Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Здесь мы представляем протокол для анализа данных miRNA-Seq с использованием R. Этот рабочий процесс позволяет исследователям изучать регулируемые микроРНК сети и их значение в различных биологических и клинических вопросах. Данная работа призвана послужить практическим руководством как для начинающих, так и для опытных исследователей в области биоинформатики микроРНК.
МикроРНК (микроРНК) являются важнейшими посттранскрипционными регуляторами, влияющими на широкий спектр физиологических и патологических процессов. С развитием технологий высокопроизводительного секвенирования miRNA-Seq превратился в мощный инструмент для профилирования паттернов экспрессии микроРНК. Однако для надежной интерпретации таких данных требуется стандартизированный и воспроизводимый конвейер анализа. В данной статье мы представляем верифицированный рабочий процесс обработки данных miRNA-Seq и биоинформатического анализа с использованием R. Этот протокол включает в себя все основные этапы, включая предварительную обработку исходных данных, контроль качества, выравнивание, количественную оценку, нормализацию, анализ дифференциальной экспрессии, прогнозирование мишени, функциональное обогащение и построение регуляторной сети. Разработанный для обеспечения гибкости и прозрачности, рабочий процесс интегрирует широко распространенные пакеты R и поддерживает аннотации для конкретных видов и модульную настройку. Кроме того, пользователям предлагается провести последующую биологическую интерпретацию с использованием курируемых баз данных и инструментов визуализации, таких как Cytoscape. Этот протокол не только поддерживает надежный статистический анализ, но и позволяет получить значимое представление о взаимодействиях микроРНК и мРНК и их роли в механизмах заболевания. Он особенно хорошо подходит как для начинающих, так и для опытных исследователей, проводящих поиск биомаркеров микроРНК, моделирование заболеваний или интегративные мультиомиксные исследования.
МикроРНК (микроРНК) представляют собой короткие некодирующие молекулы РНК, которые существенно влияют на экспрессию генов, действуя на посттранскрипционной стадии1. Обычно они функционируют путем связывания с комплементарными последовательностями в 3'-нетранслируемых областях (UTR) целевых матричных РНК (мРНК), что приводит к деградации мРНК или репрессии трансляции1. За последние два десятилетия микроРНК все чаще признаются в качестве центральных регуляторов различных биологических процессов, включая пролиферацию клеток, дифференцировку, апоптоз, иммунные реакции и развитие органов
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы со ссылками на программное обеспечение перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка образцов РНК и библиотек последовательностей
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте экстракцию и секвенирование РНК вне этого вычислительного процесса. Существует несколько способов анализа данных секвенирования микроРНК. В этом разделе представлен контекст одного из практических вопросов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Мы загрузили матрицу экспрессии микроРНК из GSE133530 и провели дифференциальный анализ экспрессии напрямую. Мы предоставили пример аналитического скрипта R для набора данных в дополнительном файле 1. В наборе данных было проведено глобальное профилирование микроРНК 16 кист почек разного размера (минимальные кисты: менее 1-5 мл, n = 10; средние кисты: от 10 до 25 мл, n = 4; большие кисты: более 50 мл, n = 4) и минимально кистозные ткани (MCT, n = 7, включая 1 репликацию) .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Анализ данных miRNA-Seq сопряжен с определенными трудностями из-за небольшого размера и избыточности прочтений, что делает критически важным строгий контроль качества и предварительную обработку. Одним из самых важных этапов в рабочем процессе является обрезка адаптеров. Поскольку длина микроРНК составляет примерно 22 нуклеотида, адаптерные последовательности могут легко доминировать при чтении, если их не удалить должным образом. Невыполнение точной обрезки может привести к смещению и р.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Мы выражаем признательность финансирующим организациям и партнерам, поддерживающим этот проект. Шанхайский план действий по научным и технологическим инновациям (22Y11905500, 24142201800), Институциональный проект госпиталя ВМС НОАК No 905 (2024Q021), Молодежный исследовательский проект Комитета здравоохранения района Чаннин (2024QN29) и Исследовательский проект Военно-морского медицинского университета (2024QN040).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agilent-021827 Микрочип микроРНК человека | Agilent | / | Коммерческая матрица для профилирования микроРНК образцов человека |
| Га́лстук-ба́бочка | Университет Джонса Хопкинса | http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml | Программный инструмент для выравнивания считываний секвенирования с длинными опорными последовательностями |
| clusterProfiler (пакет R) | Биопроводник | https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/ | Пакет R, предназначенный для функционального обогащения, анализа и визуализации высокопроизводительных биологических данных. |
| Катадапт | Открытый исходный код | https://cutadapt.readthedocs.io | Средство командной строки, которое удаляет последовательности адаптеров, праймеры, хвосты поли-А и другие нежелательные фрагменты из операций чтения секвенирования с высокой пропускной способностью. |
| Цитоспейп | Консорциум Cytoscape | https://cytoscape.org/ | Программная платформа с открытым исходным кодом, предназначенная для визуализации и анализа сложных биологических сетей. |
| DESeq2 (пакет R) | Биопроводник | https://bioconductor.org/packages/DESeq2/ | Пакет R, предназначенный для дифференциального анализа экспрессии генов в данных подсчета |
| EnhancedVolcano (пакет R) | Биопроводник | https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/ | Пакет R, предназначенный для создания графиков вулканов издательского качества. |
| Функция FastQC | Бабрахам Биоинформатика | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Инструмент контроля качества с открытым исходным кодом для данных секвенирования с высокой пропускной способностью. |
| featureCounts | Подчтение / SourceForge | http://subread.sourceforge.net/ | Программа, используемая для подсчета прочтений, сопоставленных с геномными особенностями |
| HTSeq-счетчик | Пакет Python | https://htseq.readthedocs.io | Средство командной строки, которое подсчитывает, сколько выровненных высокопроизводительных прочтений секвенирования перекрывают геномные признаки, такие как гены или экзоны. Я |
| Бисер экспрессии микроРНК Illumina Human v2 | Иллюмина | / | Коммерческая матрица для профилирования микроРНК образцов человека |
| multiMiR (пакет R) | Биопроводник | https://bioconductor.org/packages/multiMiR/ | Пакет R, который предоставляет самую большую интегрированную коллекцию предсказанных и экспериментально проверенных микроРНК– целевые взаимодействия вместе с их ассоциациями с болезнями и лекарствами. |
| орг. Hs.eg.db (пакет R) | Биопроводник | https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/ | Пакет аннотаций, предназначенный для исследований геномики человека (Homo sapiens). |
| Программное обеспечение R | Проект R | https://www.r-project.org/ | Проект с открытым исходным кодом для статистических вычислений |
| Студия | Позировать КПБ | / | Интегрированная среда разработки помогает повысить производительность при работе с R и Python |
| SAMtools | Открытый исходный код | http://www.htslib.org/ | Программный пакет для работы с данными секвенирования нового поколения (NGS). |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.