Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Венепункция вен на лице для сбора крови мышей

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68776

⸱

26 сентября 2025 г.

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Dartmouth Geisel School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы представляем протокол оптимизированной методики забора крови у мышей с помощью венепункции лицевых вен с использованием ланцета. Мы используем этот метод вместе с проточной цитометрической оценкой для характеристики клеточных фенотипов трансгенных, конгенных и репортерных штаммов. Он также подходит для анализа цитокинов в сыворотке крови и исследований диабета.

Аннотация

В этой статье представлен оптимизированный протокол сбора крови у мышей с помощью венепункции лицевых вен с использованием ланцета, предлагающий быструю, минимально инвазивную и экономически эффективную альтернативу другим распространенным методам, таким как забор из хвостовой вены и ретроорбитальный забор проб. Этот метод особенно полезен для исследований, требующих повторного отбора проб, таких как фенотипирование мышей, анализ сывороточных цитокинов и исследования диабета. Протокол эффективен, требует минимального специализированного оборудования и хорошо подходит для высокопроизводительного клеточного анализа у мышей. Наше основное применение — фенотипирование трансгенных, конгенных и репортерных мышей с помощью проточной цитометрии, продемонстрированное здесь на примере окрашивания антителами и мышей-репортеров tdTomato. В документе описана полная процедура, от подготовки животных до анализа проб. Ключевые этапы включают забор крови с помощью ланцета 3 мм, лизис клеток, окрашивание и проточное цитометрическое профилирование. Венепункция лицевых вен повышает эффективность сбора, поддерживая этические методы исследований. Этот практичный и адаптируемый метод подходит для широкого спектра экспериментальных протоколов, включающих забор образцов крови мышей и клеточный анализ.

Введение

Эффективный, воспроизводимый и минимально инвазивный забор крови имеет важное значение для многих исследований на мышах, особенно тех, которые требуют повторного забора проб. Этот протокол обеспечивает оптимизированный метод сбора небольших объемов крови с помощью венепункции лицевой вены с последующим лизисом эритроцитов, окрашиванием антителами и проточным цитометрическим анализом. Этот рабочий процесс хорошо подходит для приложений с высокой пропускной способностью, сводя к минимуму технические сложности.

Многие методы забора крови, такие как ретроорбитальное кровотечение или разрез хвостовой вены, могут потребовать процедур, включающих тепло, анестезию1 и длительное время обработки, что может вызвать значительный стресс у животного2. В отличие от этого, венепункция лицевых вен с помощью ланцета предлагает простую и быструю альтернативу, которая поддерживает этичный и воспроизводимый экспериментальный дизайн. Этот метод был валидирован в предыдущих исследованиях в качестве гуманной альтернативы забору крови в небольшихобъемах у мышей3.

Мы иллюстрируем этот метод фенотипированием иммунных клеток трансгенных и репортерных мышей, включая мышей-репортеров TdTomato и мышей MD4-IgHEL. Последний требует окрашивания антителами против CD19 и IgMa, аллотипа IgM.

Несмотря на то, что этот протокол разработан для клеточного профилирования крови, он может быть легко адаптирован для других целей, включая анализ цитокинов сыворотки крови, обнаружение специфических антител или измерение уровня глюкозы, если исключить этап лизиса эритроцитов. В целом, этот метод повышает качество данных и эффективность эксперимента, вызывая при этом минимальный дискомфорт у животных, что делает его широко полезным в различных исследовательских приложениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мыши были размещены в специальной среде, свободной от патогенов, в Медицинском колледже Дартмута Хичкока, учреждении, аккредитованном AAALAC, и использовались в соответствии с утвержденным протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию.

1. Сбор материалов

  1. Приготовьте 5 мл культуральных пробирок, каждая из которых содержит 1,5 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов (RBC) (10x RBC Lysis, разбавленного стерильной водой). Используйте одну трубку для каждой мыши.
  2. Соберите коробку с ланцетами 3 мм (по одному ланцету на мышь).
  3. Соберите коробку марлевых губок (одна марлевая губка на мышь).
  4. Соберите передаточные пипетки и коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 1x HBSS с 0,5 мМ ЭДТА (достаточно для 20 мышей).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер используется для остановки реакции лизиса. Если буфер необходим только для фенотипирования, а не для дальнейшего анализа, вместо HBSS можно использовать большинство нейтральных буферов с pH 7,2-7,4.
  5. Возьмите с собой ведро со льдом, 1 дополнительный буфер для лизиса эритроцитов, дополнительные 5 мл пробирок и переведите пипетки.

2. Маркировка мышей и трубок

  1. Пометьте каждую карточку клетки и мышь идентификатором фенотипа, который соответствует меткам на каждой трубке, чтобы было легче различать, какие результаты соотносятся с той или иной мышью. Обычно используемые идентификаторы включают в себя различные цвета перманентных маркеров (например, красный, синий, зеленый, черный) на хвостах мышей, которые соответствуют маркировке на трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда включайте в комплект управляющую мышь для фенотипирования. Для мышей-репортеров убедитесь, что у вас отрицательный контроль репортера. Для трансгенных мышей в качестве контроля следует использовать мышь дикого типа.
  2. Разложите пробирки с маркировкой на стеллаже с ведром со льдом неподалеку, чтобы хранить пробирки сразу после забора крови.
  3. Откройте все ланцеты, необходимые для проведения процедуры.
  4. Откройте все марлевые губки, необходимые для проведения процедуры.

3. Работа с мышью и сбор образцов

  1. Доминирующей рукой схватите мышь за хвост и положите ее на решетку для подачи проволоки или любую плоскую поверхность.
  2. Используйте недоминирующий указательный и большой пальцы, чтобы загривить мышь, маневрируя от хвоста к шейному отделу.
  3. Оставшимися пальцами закрепите хвост, минимизировав движения мыши.
  4. Доминирующей рукой достаньте открытый ланцет диаметром 3 мм.
  5. Найдите небольшое безволосое пятнышко сразу за ртом и проведите прямую линию к уху. Остановитесь там, где линия пересекается с внешним уголком глаза (рисунок 1).
  6. Вставьте ланцет в это место пересечения, чтобы обеспечить достаточное кровоснабжение.
  7. Используйте плоский боковой край ланцета, чтобы собрать одну каплю крови.
  8. Поместите весь ланцет вместе с образцом крови в помеченную пробирку, содержащую буфер для лизиса эритроцитов.
  9. Осторожно перемешайте пробирку, чтобы убедиться, что весь образец смешался с буфером. Неполное перемешивание может привести к свертыванию крови и ухудшению качества данных.
  10. С помощью марлевой губки слегка надавите на место прокола в течение 5-10 секунд.
  11. Верните мышь в клетку.
  12. Поддерживайте соотношение буфера крови к лизису более 1:10.
  13. Повторите действия, описанные в этом разделе, для каждой дополнительной мыши.

4. Лизис, подготовка и анализ образца

  1. Подождите 7-10 минут после начала лизиса, добавьте примерно 2 мл 1x HBSS с 0,5 мМ ЭДТА (или другой средой).
  2. Центрифужные пробирки по 400 г в течение 5 мин. За это время приготовьте коктейли с антителами.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Извлеките ланцеты из трубок с помощью щипцов.
  5. Добавьте 30 мкл коктейля антител, предназначенного для идентификации желаемых клеточных популяций.
    Примечание: Для мышей фенотипа MD4 IgHEL наш коктейль состоял из 1 мл HBSS, 25 мкл IgMa PerCP cy-5,5 и 25 мкл CD19 APC.
  6. Ресуспензируют клетки путем вортекса в течение 2-3 с и инкубируют в течение 25-30 мин при 4 °С.
  7. Включите проточный цитометр и настройте графики потока в соответствии с потребностями эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости вращать клетки после окрашивания, если целью является фенотипирование.
  8. Добавьте 150-25 мкл HBSS или другой среды в каждый образец с помощью трансферной пипетки. При необходимости можно добавить DAPI в конечной концентрации 1 г/мл (используйте 10 мкл среды, содержащей DAPI).
  9. Обработайте каждый образец вихрем в течение 2-3 секунд непосредственно перед получением.
  10. Сбор данных со скоростью 8 000-10 000 событий/с, с целью получения 100 000 клеток, если лизис был эффективным.
  11. Проанализируйте полученные данные, как показано на рисунках 2 и 3.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью проточной цитометрии на рисунке 2 показана лизированная кровь мышей дикого типа (WT) и PF4-Cre TdTomato, полученная с использованием описанного выше протокола. Первый набор графиков потока отображает боковое рассеяние (SSC), которое отражает гранулярность ячеек, и прямое рассеяние (FSC), которое указывает на размер ячейки. Клеточный мусор и тромбоциты наблюдаются вблизи начала осей, в то время как лимфоциты кажутся ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот оптимизированный протокол забора крови из лицевых вен представляет собой эффективную и простую альтернативу другим широко используемым методам, таким как лечение хвостовой вены или ретроорбитального кровотечения. Несмотря на то, что протокол прост и понятен, необходимо тщательно следовать нескольким важным шагам. Самым важным этапом, который необходимо выполнить правильно, является правильное размещение места прокола4. Нацеливание на соответствующее место на ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована грантом Национальных институтов здравоохранения: R35 HL155458 (C.V.J.)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитело CD19 против мышей APCБиолегенда152410CD19 APC
Центрифуга 5810 R, без ротора, 120 В, 50/60 ГцЭппендорф22625501Центрифуга
Губки Dermacea Gauze 8 слоёв 2" x 2"Ковидьен441211Гуасе Понжес
Одноразовые градуированные трансферные пипеткиФишербранд13-711-91 утраТрансферная пипета
ErgoOne одноканальный пипетт (200 и микро; L)USA Scientific7100-2200Пипетт
Этилендиаминтетрауксусная кислота (раствор 0,5 м/pH 8,0)ФишербрандBP2482-100EDTA 5 M   
Анализатор клеток FACSymphony A3BD Biosciences660937Потоковый цитометр
Fisherbrand  Аналоговый вихревой микшерФишербранд02-215-414Вихрь
Goldenrod Animal Lancet 3 мм Стерильный 5 лотков по 200 человекЗолотарникGR 3MMЛанцет 3 мм
Щипцы ГрефеТонкие научные инструменты11051-10Щипцы
Хэнк' s Сбалансированный сольный раствор, 1 раз без кальция и магнияКорнинг21-021-CVRHBSS
PerCP/Cyanine5.5 против мышей IgMa  АнтителаБиолегенда408612IgMa PerCP cy-5.5
Буфер лизиса эритроцитов (10 раз)Биолегенда420301Буфер лизиса эритроцитов
Пробирки из полистирола с круглым дном без крышкиФишербрандFB1496110Культивные трубки
Маркеры Sharpie Permanent Markers, наконечник для стамескаМаркер38254PPSharpies 
Протестирован на стерильную воду USP  Корнинг25-055-CIВода сорта клеточной культуры
TipOne Pipette Refills (200 & micro; L Натуральная фаска с фашеном)USA Scientific1111-1730Кончики пипеток

Ссылки

  1. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
  2. Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
  3. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  4. Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
  5. Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
  6. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
  7. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  8. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
  9. Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
  10. Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
  11. Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
  12. Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод забора кровималоинвазивный забор пробпроточная цитометрияокрашивание антителамилизис эритроцитовтрансгенные мышианализ тромбоцитовклеточное фенотипирование
Венепункция вен на лице для сбора крови мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.