Методическая статья

Быстрая оптимизация светоиндуцируемой системы для контроля экспрессии генов млекопитающих

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании описывается метод высокопроизводительных экспериментов с использованием напечатанной на 3D-принтере светодиодной матрицы для оптимизации индуцируемой светом экспрессии генов в HEK293T клетках.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцируемые инструменты экспрессии генов могут открыть новые приложения в области здравоохранения и биотехнологий, но существующие варианты часто дороги, их трудно обратить вспять и они имеют нежелательные побочные эффекты. Оптогенетические системы используют светочувствительные белки для контроля активности регуляторов таким образом, что экспрессия контролируется «щелчком выключателя». Это исследование оптимизирует упрощенную систему эффектора CRISPR (2pLACE), активируемую светом, которая обеспечивает настраиваемый, обратимый и точный контроль экспрессии генов млекопитающих. OptoPlate-96 обеспечивает высокопроизводительный скрининг с помощью проточной цитометрии для анализа одиночных клеток и быструю оптимизацию 2pLACE. В этом исследовании показано, как использовать систему 2pLACE с OptoPlate-96 в HEK293T ячейках для определения оптимальных соотношений компонентов для максимизации динамического диапазона и поиска кривой отклика на интенсивность синего света. Аналогичные рабочие процессы могут быть разработаны для других клеток млекопитающих, а также для других оптогенетических систем и длин волн света. Эти достижения повышают точность, масштабируемость и адаптируемость оптогенетических инструментов для применения в биопроизводстве.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инструменты синтетической биологии, такие как индуцируемые системы экспрессии генов, внесли значительный вклад в биологические исследования. Их способность регулировать экспрессию генов настраиваемым, обратимым и точным образом может улучшить контроль над производством белка 1,2,3,4,5,6, морфологией клеток 7,8,9,10,11,12, метаболическими путями 13,14,15,16,17,18 и другие мишени для биопроизводства и терапевтического применения. Химически индуцируемые системы могут иметь остаточные19,20 или нецелевые эффекты. Химические добавки также могут быть очень дорогими и сложными для промышленного масштабирования из-за дополнительных процессов очистки на последующих этапах 21,22,23. Индуцируемые светом системы экспрессии генов могут предложить масштабируемый и точный метод для биопроизводственных практик 24,25,26,27.

Многие светоиндуцируемые системы экспрессии генов были разработаны в качестве полезных инструментов синтетической биологии в различных приложениях 28,29,30,31,32,33,34,35,36 и длинах волн синего 35,37,38, красного/дальнего красного 12,39.40, или зеленый41 свет. В случае оптогенетической регуляции генов на основе CRISPR изменение количества доставляемых индивидуальных направляющих РНК (гРНК) может повлиять на экспрессию мРНК эндогенных генов42 и должно быть оптимизировано для различных клеточных линий. Трансактивационные белки, такие как VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44, или их слияния47, увеличивают модульность оптогенетических систем. Для исследования сложных и взаимосвязанных биологических путей 12,40,48,49,50,51,52,53 могут быть протестированы различные комбинации этих известных компонентов. Кроме того, различные клеточные линии могут демонстрировать различия в индукции с одной и той же системой52. Различные уровни индукции могут привести к недостаточной экспрессии генов или чувствительности в точном контроле экспрессии генов, что требует тщательного тестирования для поиска оптимальной оптогенетической системы в новых или более биологически значимых клеточных линиях. С растущими темпами и расширением применимости оптогенетической регуляции генов крайне важно быстро охарактеризовать эти различные системы.

Современные методы характеристики оптогенетических инструментов используют либо стабильную, либо временную экспрессию генов12,54. Генерация стабильно экспрессирующих клеточных линий и оптимизация системной динамики для максимальной экспрессии может быть трудоемкой и, следовательно, дорогостоящей. Экспрессия переходных процессов позволяет быстро получать ценную информацию, особенно при тестировании многокомпонентных оптогенетических систем. В данном случае мы использовали активируемую синим светом систему эффектора CRISPR-dCas9 (LACE)37, состоящую из криптохрома 2 (CRY2) и взаимодействующего с криптохромом N-терминала (CIBN). Он использовался для контроля экспрессии генов в клетках млекопитающих, таких как HEK293T (клетки эмбриональных почек человека)37,38, CHO-DG44 (клетки яичников китайского хомяка)55 и C2C12 (клетки миобластов мыши)38. Его модульная структура идеально подходит для быстрой определения характеристик производительности системы с помощью переходных экспрессий и методов с высокой пропускной способностью. Например, многокомпонентные системы, такие как LACE, могут нуждаться в оптимизации соотношения масс для улучшения индукции, что обычно не используется при определении характеристик оптогенетических систем.

В этом протоколе подробно описывается быстрая оптимизация и определение характеристик двух плазмидных систем LACE (2pLACE)38. В этой конфигурации 2pLACE контролирует экспрессию флуоресцентного репортера, eGFP (усиленного зеленого флуоресцентного белка), в HEK293T клетках. Активация выполняется в 96-луночных планшетах с черным стеклянным дном с использованием OptoPlate-96, 3D-печатной светодиодной матрицы, разработанной и изготовленной Лукашем Бугаем и его коллегами 56,57,58,59. Этот протокол специально оптимизирует максимальную экспрессию при различных соотношениях масс двухплазмидной системы. Он также включает в себя удобный код для управления различной интенсивностью света для исследования настраиваемости системы и ее полного динамического диапазона. Для сбора и анализа данных используется проточная цитометрия. Протоколы создания плазмидных конструкций и материалы для 3D-печати для светодиодной матрицы можно найти в предыдущих публикациях54,56. Эти методы подчеркивают быстрый, высокопроизводительный конвейер для характеристики светоиндуцируемых систем экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Гальваническое покрытие HEK293T ячеек в формате 96 лунок

  1. В шкафу биобезопасности соберите контейнер для отходов отбеливателя, серологические пипетки, пипетку, фосфатный солевой буфер Дульбекко (DPBS), модифицированную Дульбекко орлиную среду (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и колбу для клеточной культуры T-75 с конфлюентными HEK293T клетками. Разогрейте среду до 37 °C.
  2. В колбе Т-75 проверьте слияние примерно на 80%-100% с помощью инвертированного микроскопа.
  3. В шкафу биобезопасности с помощью серологической пипетки отсасывайте отработанную среду из колбы для клеточных культур. Не прикасайтесь к поверхности или пластику колбы. Выбросьте отработанную среду и аспиратор в контейнер для отходов.
  4. Аккуратно промойте ячейки примерно 10 мл DPBS, втянув его в угол колбы и осторожно взболтав по поверхности. Отасуньте DPBS из колбы и утилизируйте моечку и аспиратор в контейнер для отходов.
  5. Добавьте 1,5 мл 0,05% Трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть поверхность колбы, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1 минуты. Аккуратно постучите по колбе, чтобы оторвать ячейки от поверхности.
  6. Добавьте в колбу 8,5 мл свежего DMEM. Повторно суспендируйте и перемешайте клетки с помощью серологической пипетки до тех пор, пока все агрегаты не будут разрушены, путем аспирации вверх и вниз.
  7. Соберите 9 мл клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл.
    1. Добавьте в колбу 9 мл свежего DMEM и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2
  8. С помощью гемоцитометра смешайте 10 мкл взвешенных клеток с 10 мкл синего красителя Trypan в соотношении 1:1, чтобы рассчитать концентрацию клеток. Используйте это значение, чтобы подготовить достаточное количество клеток для посева на пластине.
  9. Высадите ~35 000 клеток по 100 мкл на каждую лунку высокопроизводительной черной 96-луночной стеклянной нижней пластины #1.5 и поместите в инкубатор при 37 °C и 5%CO2 на 24 ч.

2. Оптимизация трансфекции 2pLACE

  1. На одну лунку и 10% избытка добавьте 11 μL теплой бессывороточной DMEM (SFM) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Используя массовые отношения плазмид CRY2-eGFP: CIBN-gRNA, равные 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 и 9:1, аликвоты 110 нг для каждой лунки общего ДНК к аликвотам SFM (табл. 1).
  3. В качестве положительного контроля следует аликвотировать одну и ту же массу плазмиды CMV-eGFP к различным аликвотам SFM.
  4. На каждую лунку выделяют 11 мкл SFM для трансфекционного разведения реагента.
  5. Приготовьте реагент для трансфекции в соотношении массы (мкг) к объему (мкг) ДНК и реагента для трансфекции 1:3.
  6. В разведенную ДНК добавляют разведенный реагент для трансфекции и инкубируют в течение 12 мин при комнатной температуре до создания трансфекционных комплексов.
  7. Добавьте ~20 мкл трансфекционного комплекса в каждую лунку. Следите за тем, чтобы он не касался стенок колодца.
  8. Оберните пластину алюминиевой фольгой и поместите ее в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 24 часа.

3. Активация 2pLACE

  1. Измените входной код микроконтроллера для освещения нужных лунок с помощью этих настроек (файл дополнительного кодирования 1, строки 147 - 158).
    1. Интенсивность светодиода: 9,27 мВт/см2 (файл дополнительной кодировки 1, строки 200 - 215).
    2. Длительность импульса: 1 с (Файл дополнительного кодирования 1, строки 280 - 290).
    3. Частота импульсов: 0,067 Гц (каждые 15 с) (Файл дополнительного кодирования 1, строки 264 - 278).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки длины волны определяются типами установленных светодиодов.
  2. Распылите на напечатанную на 3D-принтере крышку OptoPlate 70% этанола и дайте ей высохнуть в шкафу для биобезопасности.
  3. Включите красную лампу в темной комнате и поместите 96-луночную пластину в шкаф для биобезопасности, а затем замените крышку на высушенную крышку, напечатанную на 3D-принтере.
    Примечание: При желании можно просмотреть клетки CMV-eGFP с помощью флуоресцентной микроскопии для оценки эффективности трансфекции.
  4. Возьмите 96-луночный планшет и поместите его на светодиодную матрицу, чтобы построить аппарат светодиодной матрицы. Убедитесь, что пластина зафиксирована на месте со щелчком.
  5. Подключите порты микроконтроллера, светодиода и вентилятора к источнику питания.
  6. Осторожно распылите на провода 70% этанол и вытрите насухо.
  7. Поместите светодиодную матрицу в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 24 часа. Убедитесь, что светодиоды загораются должным образом и что провода не натянуты, когда инкубатор запечатан.

4. Подготовка к проточной цитометрии

  1. Находясь в условиях красного света, достаньте OptoPlate и поместите пластину в шкаф для биологической безопасности
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно рассмотреть клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы визуально подтвердить индукцию света.
  2. Тщательно отсасывайте все среды из каждой лунки.
  3. Отделите клетки с помощью 30 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  4. Смешайте каждую лунку со 100 мкл холодного буфера FACS (1% FBS в PBS) до одноклеточного состояния.
  5. Переложите каждый образец в 96-луночный планшет с V-образным дном.
  6. Центрифугируйте 96-луночный планшет с V-образным дном при давлении 164 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
  7. Асасируйте 80 мкл надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.
  8. Добавьте 200 мкл холодного буфера FACS для ресуспендирования гранулы.
  9. Оберните 96-луночную пластину с V-образным дном в алюминиевую фольгу для легкой изоляции.
  10. Поместите тарелку в пенопластовую коробку со льдом для транспортировки.

5. Проточная цитометрия, гейтирование и сбор данных

  1. Включите проточный цитометр с помощью переключателя на задней панели и откройте соответствующее программное обеспечение проточной цитометрии на компьютере.
  2. Запустите программу запуска системы и загрузите 2 мл деионизированной воды в загрузчик проб (дополнительный рисунок 1A).
  3. Запустите контроль качества (QC) с помощью предоставленных валиков контроля качества (дополнительный рисунок 1B).
  4. Убедитесь, что проточный цитометр находится в режиме отбора проб планшетом (дополнительный рисунок 1C).
  5. Настройте и укажите пробоотборные скважины (дополнительный рисунок 1D).
  6. Создайте следующие точечные диаграммы и таблицы (дополнительный рисунок 2A).
    1. Боковой разброс (SSC-A) против прямого разброса (FSC-A).
    2. SSC-H против SSC-A.
    3. SSC-A против FITC-A.
    4. Таблица статистики FITC-A (дополнительный рисунок 2B).
  7. Вставьте пластину с V-образным дном в загрузчик планшетов цитометра.
  8. Выберите нетрансфицированную лунку и нажмите «Инициализировать», а затем нажмите «Запустить».Убедитесь, что частота дискретизации объема составляет 10 мкл/мин (дополнительный рисунок 2C).
  9. Настройте напряжения SSC и FITC так, чтобы центрировать интересующую популяцию на графике SSC-A и FSC-A (дополнительный рисунок 2C).
    1. Создание многоугольника для затвора популяции здоровых клеток, представляющей интерес (дополнительный рисунок 2D).
    2. Создание многоугольника в строб для различения дублетов на графике SSC-H и SSC-A.
    3. Отрегулируйте напряжение FITC так, чтобы нетрансфицированные элементы располагались слева от графика SSC-A и FITC-A (дополнительный рисунок 2D).
  10. Повторите эти действия для оставшихся нетрансфицированных скважин и запишите средние данные FITC-A.
  11. Выберите хорошо трансфицированный CMV-eGFP и нажмите «Выполнить».
  12. Отрегулируйте напряжение FITC для захвата как автофлуоресцентных, так и флуоресцирующих ячеек на графике SSC-A и FITC-A.
    1. Создайте многоугольник для затвора флуоресцирующих клеток против нефлуоресцирующих клеток, одновременно ссылаясь на исходный затвор в нетрансфицированных клетках (дополнительный рисунок 2E).
  13. Автоматическая запись проб со скоростью 60 мкл/мин до тех пор, пока не будет достигнуто 200 с и/или не будет достигнуто 10 000 (дополнительный рисунок 2F).
  14. Экспортируйте Mean FITC в виде файла CSV и проанализируйте данные.
  15. Очистите проточный цитометр с помощью опции «Ежедневная чистка» (дополнительный рисунок 2G).

6. Оптимизация интенсивности светодиодов

  1. Отредактируйте сценарий микроконтроллера для проверки желаемой интенсивности светодиодов (дополнительный файл кодирования 1, строки 200-215).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эквивалентная интенсивность светодиодов по отношению к значениям в сценарии микроконтроллера указана в другом месте38. При использовании разных светодиодов может потребоваться самокалибровка.
  2. Убедитесь, что сценарий содержит следующие значения в (Файл дополнительного кодирования 1, строки 200-215), как указано в таблице 2, и загрузите код на микроконтроллер.
  3. Повторите шаги 1-5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя элементы рабочего процесса из предыдущей литературы 37,38,55, мы добавили высокопроизводительное одновременное освещение от OptoPlate-96 и продемонстрировали конвейер для быстрой оптимизации индуцируемой светом системы экспрессии генов в клетках млекопитающих (рис. 1).

Для индуцируемых систем экспрессии генов высокий динамически...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует оптогенетический контроль многокомпонентной экспрессии транзиторных генов в клетках млекопитающих, что позволяет другим исследователям быстро и одновременно характеризовать модульные оптогенетические системы с помощью флуоресцентного репортера.

В этом случае двухплазмидная светоиндуцируемая система была оптимизирована для экспрессии eGFP в HEK293T клетках. Для успешной совместной трансфекции важно оптимизировать плотность посева и с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается Институтом трансляционных исследований в рамках Соглашения о сотрудничестве НАСА NNX16AO69A и Институтом хорошего питания. Этот проект был поддержан Лабораторией общих ресурсов проточной цитометрии Калифорнийского университета в Дэвисе при технической поддержке Бриджит Маклафлин, Джонатана Ван Дайка и Эшли Карадже, при финансировании NCI P30 CA093373 (Комплексный онкологический центр) и S10OD018223 (цитометр Beckman Coulter "Cytoflex").

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млVWR10025-724
Реагентные резервуары объёмом 10 млVWR77395-252
Серологические пипетки объемом 10 млVWR75816-100
1000 & mu; Наконечники L-фильтраVWR76322-154
15 мл&нбсп; Высокопроизводительные центрифугные лампы с плоской крышкойVWR89039-664
Оптический измеритель мощности 1931-CНьюпорт1931-C
Серологические пипетки объемом 2 млVWR75816-104
20 & mu; Наконечники L-фильтраVWR76322-134
200 и мю; Наконечники L-фильтраVWR76322-150
50 мл высокопроизводительные центрифугные лампы с плоской крышкойVWR89039-656
Пластины V-образного дна с 96 лункамиBRANDplates781661
A21, светодиодная красная лампочкаBluex BulbsН/ДИсточник красного света
Arduino IDE SoftwareArduinoН/Д
Кабинет биобезопасности, класс IINuAireН/Д
Яркий гемоцитометрHausser Scientific3110
Слайды для подсчёта клетокBioRad1450016
Пластина для культивирования клеток 96-колодца, стеклянная нижняя пластина #1.5HCellvisP96-1.5H-N
Программное обеспечение CytExpertБекман КоултерН/Д
CytoFLEX — готовые к использованию ежедневные флуоросферы контроля качестваБекман КоултерC657194 и °; C
Цитометр потока CytoFLEX-S (4 фиолетовых, 2 синих, 4 желто-зелёных, 3 красных канала)Бекман КоултерC09766
Физиологический порошок Dulbecco's с фосфатным буфером, без каликума, без магнияFisher Scientific21600069Комнатная температура
Центрифуга Эппендорфа 5804Эппендорф  022622501Ступень центрифуги с V-образным нижним пластином
Центрифуга Эппендорфа 5810RЭппендорф22625501
Eppendorf Research plus, 8-канальный, с переменной громкостью, 30–300 и мю; LЭппендорф3125000052
Eppendorf Research Plus, одноканальный, с переменной громкостью, 100–1000 и мю; LЭппендорф3123000063
Eppendorf Research plus, одноканальный звук, с переменной громкостью, 2–20 и мю; LЭппендорф3123000039
Eppendorf Research plus, одноканальный, с переменной громкостью, 20–200 и миль; LЭппендорф3123000055
Универсальная лента для лабораторной маркировкиVWR89097-920
Gibco DMEM, порошок, с высоким содержанием глюкозыFisher Scientific121000614 и °; C
Gibco Trypan Blue Solution, 0,4%Fisher Scientific15-250-061Комнатная температура
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 & °; C
Гибко, Трипсин-ЭДТА (0,05%), с ЭДТА, Animal Origin, 1X, Фенол Ред, 500 млGibco25300062-20 & °; C
HEK293T КлеткиATCCCRL-11268-80 и градус; C, жидкий азот
Лабораторные маркеры, MicronovaVWR89205-944
Металлическая настольная лампаПростые конструкцииН/ДЛампа для красного света
OptoPlate-96LABmakerН/Д
Pipet-aid XPДраммонд4-000-101
Плазмида: CIBN-gRNAН/ДН/Д-20 & °; C
Плазмида: CMV-eGFPН/ДН/Д-20 & °; C
Плазмида: CRY2-eGFPН/ДН/Д-20 & °; C
Реагент для трансфекции ДНК PolyJet in vitroFisher ScientificNC15361174 и °; C
Фляга для культуры клеток T-75VWR10062-860
Инкубатор CO2 с водяной рубашкойVWR10810-884

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPRHEK293T

Похожие статьи