Быстрая оптимизация светоиндуцируемой системы для контроля экспрессии генов млекопитающих

Инструменты синтетической биологии, такие как индуцируемые системы экспрессии генов, внесли значительный вклад в биологические исследования. Их способность регулировать экспрессию генов настраиваемым, обратимым и точным образом может улучшить контроль над производством белка 1,2,3,4,5,6, морфологией клеток 7,8,9,10,11,12, метаболическими путями 13,14,15^,16,17,18 и другие мишени для биопроизводства и терапевтического применения. Химически индуцируемые системы могут иметь остаточные^19,20 или нецелевые эффекты. Химические добавки также могут быть очень дорогими и сложными для промышленного масштабирования из-за дополнительных процессов очистки на последующих этапах 21,22,23. Индуцируемые светом системы экспрессии генов могут предложить масштабируемый и точный метод для биопроизводственных практик 24,25,26,27.

Многие светоиндуцируемые системы экспрессии генов были разработаны в качестве полезных инструментов синтетической биологии в различных приложениях 28,29,30,31,32,33,34,35,36 и длинах волн синего 35,37,38, красного/дальнего красного ^12,39.⁴⁰, или зеленый⁴¹ свет. В случае оптогенетической регуляции генов на основе CRISPR изменение количества доставляемых индивидуальных направляющих РНК (гРНК) может повлиять на экспрессию мРНК эндогенных генов⁴² и должно быть оптимизировано для различных клеточных линий. Трансактивационные белки, такие как VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44, или их слияния⁴⁷, увеличивают модульность оптогенетических систем. Для исследования сложных и взаимосвязанных биологических путей 12,40,48,49,50,51,52,53 могут быть протестированы различные комбинации этих известных компонентов. Кроме того, различные клеточные линии могут демонстрировать различия в индукции с одной и той же системой⁵². Различные уровни индукции могут привести к недостаточной экспрессии генов или чувствительности в точном контроле экспрессии генов, что требует тщательного тестирования для поиска оптимальной оптогенетической системы в новых или более биологически значимых клеточных линиях. С растущими темпами и расширением применимости оптогенетической регуляции генов крайне важно быстро охарактеризовать эти различные системы.

Современные методы характеристики оптогенетических инструментов используют либо стабильную, либо временную экспрессию генов^12,54. Генерация стабильно экспрессирующих клеточных линий и оптимизация системной динамики для максимальной экспрессии может быть трудоемкой и, следовательно, дорогостоящей. Экспрессия переходных процессов позволяет быстро получать ценную информацию, особенно при тестировании многокомпонентных оптогенетических систем. В данном случае мы использовали активируемую синим светом систему эффектора CRISPR-dCas9 (LACE)³⁷, состоящую из криптохрома 2 (CRY2) и взаимодействующего с криптохромом N-терминала (CIBN). Он использовался для контроля экспрессии генов в клетках млекопитающих, таких как HEK293T (клетки эмбриональных почек человека)^37,38, CHO-DG44 (клетки яичников китайского хомяка)⁵⁵ и C2C12 (клетки миобластов мыши)³⁸. Его модульная структура идеально подходит для быстрой определения характеристик производительности системы с помощью переходных экспрессий и методов с высокой пропускной способностью. Например, многокомпонентные системы, такие как LACE, могут нуждаться в оптимизации соотношения масс для улучшения индукции, что обычно не используется при определении характеристик оптогенетических систем.

В этом протоколе подробно описывается быстрая оптимизация и определение характеристик двух плазмидных систем LACE (2pLACE)³⁸. В этой конфигурации 2pLACE контролирует экспрессию флуоресцентного репортера, eGFP (усиленного зеленого флуоресцентного белка), в HEK293T клетках. Активация выполняется в 96-луночных планшетах с черным стеклянным дном с использованием OptoPlate-96, 3D-печатной светодиодной матрицы, разработанной и изготовленной Лукашем Бугаем и его коллегами 56,57,58,59. Этот протокол специально оптимизирует максимальную экспрессию при различных соотношениях масс двухплазмидной системы. Он также включает в себя удобный код для управления различной интенсивностью света для исследования настраиваемости системы и ее полного динамического диапазона. Для сбора и анализа данных используется проточная цитометрия. Протоколы создания плазмидных конструкций и материалы для 3D-печати для светодиодной матрицы можно найти в предыдущих публикациях^54,56. Эти методы подчеркивают быстрый, высокопроизводительный конвейер для характеристики светоиндуцируемых систем экспрессии генов.

1. Гальваническое покрытие HEK293T ячеек в формате 96 лунок

1. В шкафу биобезопасности соберите контейнер для отходов отбеливателя, серологические пипетки, пипетку, фосфатный солевой буфер Дульбекко (DPBS), модифицированную Дульбекко орлиную среду (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и колбу для клеточной культуры T-75 с конфлюентными HEK293T клетками. Разогрейте среду до 37 °C.
2. В колбе Т-75 проверьте слияние примерно на 80%-100% с помощью инвертированного микроскопа.
3. В шкафу биобезопасности с помощью серологической пипетки отсасывайте отработанную среду из колбы для клеточных культур. Не прикасайтесь к поверхности или пластику колбы. Выбросьте отработанную среду и аспиратор в контейнер для отходов.
4. Аккуратно промойте ячейки примерно 10 мл DPBS, втянув его в угол колбы и осторожно взболтав по поверхности. Отасуньте DPBS из колбы и утилизируйте моечку и аспиратор в контейнер для отходов.
5. Добавьте 1,5 мл 0,05% Трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть поверхность колбы, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 1 минуты. Аккуратно постучите по колбе, чтобы оторвать ячейки от поверхности.
6. Добавьте в колбу 8,5 мл свежего DMEM. Повторно суспендируйте и перемешайте клетки с помощью серологической пипетки до тех пор, пока все агрегаты не будут разрушены, путем аспирации вверх и вниз.
7. Соберите 9 мл клеточной суспензии в коническую пробирку объемом 15 мл.
   1. Добавьте в колбу 9 мл свежего DMEM и поместите его в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2
8. С помощью гемоцитометра смешайте 10 мкл взвешенных клеток с 10 мкл синего красителя Trypan в соотношении 1:1, чтобы рассчитать концентрацию клеток. Используйте это значение, чтобы подготовить достаточное количество клеток для посева на пластине.
9. Высадите ~35 000 клеток по 100 мкл на каждую лунку высокопроизводительной черной 96-луночной стеклянной нижней пластины #1.5 и поместите в инкубатор при 37 °C и 5%_CO2 на 24 ч.

2. Оптимизация трансфекции 2pLACE

1. На одну лунку и 10% избытка добавьте 11 μL теплой бессывороточной DMEM (SFM) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Используя массовые отношения плазмид CRY2-eGFP: CIBN-gRNA, равные 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 и 9:1, аликвоты 110 нг для каждой лунки общего ДНК к аликвотам SFM (табл. 1).
3. В качестве положительного контроля следует аликвотировать одну и ту же массу плазмиды CMV-eGFP к различным аликвотам SFM.
4. На каждую лунку выделяют 11 мкл SFM для трансфекционного разведения реагента.
5. Приготовьте реагент для трансфекции в соотношении массы (мкг) к объему (мкг) ДНК и реагента для трансфекции 1:3.
6. В разведенную ДНК добавляют разведенный реагент для трансфекции и инкубируют в течение 12 мин при комнатной температуре до создания трансфекционных комплексов.
7. Добавьте ~20 мкл трансфекционного комплекса в каждую лунку. Следите за тем, чтобы он не касался стенок колодца.
8. Оберните пластину алюминиевой фольгой и поместите ее в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 24 часа.

3. Активация 2pLACE

1. Измените входной код микроконтроллера для освещения нужных лунок с помощью этих настроек (файл дополнительного кодирования 1, строки 147 - 158).
   1. Интенсивность светодиода: 9,27 мВт/^см2 (файл дополнительной кодировки 1, строки 200 - 215).
   2. Длительность импульса: 1 с (Файл дополнительного кодирования 1, строки 280 - 290).
   3. Частота импульсов: 0,067 Гц (каждые 15 с) (Файл дополнительного кодирования 1, строки 264 - 278).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки длины волны определяются типами установленных светодиодов.
2. Распылите на напечатанную на 3D-принтере крышку OptoPlate 70% этанола и дайте ей высохнуть в шкафу для биобезопасности.
3. Включите красную лампу в темной комнате и поместите 96-луночную пластину в шкаф для биобезопасности, а затем замените крышку на высушенную крышку, напечатанную на 3D-принтере.
   Примечание: При желании можно просмотреть клетки CMV-eGFP с помощью флуоресцентной микроскопии для оценки эффективности трансфекции.
4. Возьмите 96-луночный планшет и поместите его на светодиодную матрицу, чтобы построить аппарат светодиодной матрицы. Убедитесь, что пластина зафиксирована на месте со щелчком.
5. Подключите порты микроконтроллера, светодиода и вентилятора к источнику питания.
6. Осторожно распылите на провода 70% этанол и вытрите насухо.
7. Поместите светодиодную матрицу в инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 24 часа. Убедитесь, что светодиоды загораются должным образом и что провода не натянуты, когда инкубатор запечатан.

4. Подготовка к проточной цитометрии

1. Находясь в условиях красного света, достаньте OptoPlate и поместите пластину в шкаф для биологической безопасности
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно рассмотреть клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы визуально подтвердить индукцию света.
2. Тщательно отсасывайте все среды из каждой лунки.
3. Отделите клетки с помощью 30 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 1 минуты при комнатной температуре.
4. Смешайте каждую лунку со 100 мкл холодного буфера FACS (1% FBS в PBS) до одноклеточного состояния.
5. Переложите каждый образец в 96-луночный планшет с V-образным дном.
6. Центрифугируйте 96-луночный планшет с V-образным дном при давлении 164 x g в течение 10 минут при комнатной температуре.
7. Асасируйте 80 мкл надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.
8. Добавьте 200 мкл холодного буфера FACS для ресуспендирования гранулы.
9. Оберните 96-луночную пластину с V-образным дном в алюминиевую фольгу для легкой изоляции.
10. Поместите тарелку в пенопластовую коробку со льдом для транспортировки.

5. Проточная цитометрия, гейтирование и сбор данных

1. Включите проточный цитометр с помощью переключателя на задней панели и откройте соответствующее программное обеспечение проточной цитометрии на компьютере.
2. Запустите программу запуска системы и загрузите 2 мл деионизированной воды в загрузчик проб (дополнительный рисунок 1A).
3. Запустите контроль качества (QC) с помощью предоставленных валиков контроля качества (дополнительный рисунок 1B).
4. Убедитесь, что проточный цитометр находится в режиме отбора проб планшетом (дополнительный рисунок 1C).
5. Настройте и укажите пробоотборные скважины (дополнительный рисунок 1D).
6. Создайте следующие точечные диаграммы и таблицы (дополнительный рисунок 2A).
   1. Боковой разброс (SSC-A) против прямого разброса (FSC-A).
   2. SSC-H против SSC-A.
   3. SSC-A против FITC-A.
   4. Таблица статистики FITC-A (дополнительный рисунок 2B).
7. Вставьте пластину с V-образным дном в загрузчик планшетов цитометра.
8. Выберите нетрансфицированную лунку и нажмите «Инициализировать», а затем нажмите «Запустить».Убедитесь, что частота дискретизации объема составляет 10 мкл/мин (дополнительный рисунок 2C).
9. Настройте напряжения SSC и FITC так, чтобы центрировать интересующую популяцию на графике SSC-A и FSC-A (дополнительный рисунок 2C).
   1. Создание многоугольника для затвора популяции здоровых клеток, представляющей интерес (дополнительный рисунок 2D).
   2. Создание многоугольника в строб для различения дублетов на графике SSC-H и SSC-A.
   3. Отрегулируйте напряжение FITC так, чтобы нетрансфицированные элементы располагались слева от графика SSC-A и FITC-A (дополнительный рисунок 2D).
10. Повторите эти действия для оставшихся нетрансфицированных скважин и запишите средние данные FITC-A.
11. Выберите хорошо трансфицированный CMV-eGFP и нажмите «Выполнить».
12. Отрегулируйте напряжение FITC для захвата как автофлуоресцентных, так и флуоресцирующих ячеек на графике SSC-A и FITC-A.
    1. Создайте многоугольник для затвора флуоресцирующих клеток против нефлуоресцирующих клеток, одновременно ссылаясь на исходный затвор в нетрансфицированных клетках (дополнительный рисунок 2E).
13. Автоматическая запись проб со скоростью 60 мкл/мин до тех пор, пока не будет достигнуто 200 с и/или не будет достигнуто 10 000 (дополнительный рисунок 2F).
14. Экспортируйте Mean FITC в виде файла CSV и проанализируйте данные.
15. Очистите проточный цитометр с помощью опции «Ежедневная чистка» (дополнительный рисунок 2G).

6. Оптимизация интенсивности светодиодов

1. Отредактируйте сценарий микроконтроллера для проверки желаемой интенсивности светодиодов (дополнительный файл кодирования 1, строки 200-215).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эквивалентная интенсивность светодиодов по отношению к значениям в сценарии микроконтроллера указана в другом месте³⁸. При использовании разных светодиодов может потребоваться самокалибровка.
2. Убедитесь, что сценарий содержит следующие значения в (Файл дополнительного кодирования 1, строки 200-215), как указано в таблице 2, и загрузите код на микроконтроллер.
3. Повторите шаги 1-5.

Используя элементы рабочего процесса из предыдущей литературы 37,38,55, мы добавили высокопроизводительное одновременное освещение от OptoPlate-96 и продемонстрировали конвейер для быстрой оптимизации индуцируемой светом системы экспрессии генов в клетках млекопитающих (рис. 1).

Для индуцируемых систем экспрессии генов высокий динамический диапазон является критическим маркером производительности, в дополнение к абсолютному включению и выключению (утечке) экспрессии. С помощью флуоресцентной визуализации трансфицированных клеток можно качественно наблюдать разницу в экспрессии eGFP между активируемыми светом клетками и клетками, содержащимися в темноте (рис. 2). Соотношение 1:9 заметно приводит к меньшей максимальной экспрессии eGFP по сравнению с соотношением 5:5. Также можно отметить повышенную негерметичность в соотношении 5:5. Флуоресцентная визуализация конститутивно экспрессирующих эГФП (ЦМВ-эГФП) трансфицированных и нетрансфицированных клеток является ценным положительным и отрицательным контролем для контекстуализации эффективности трансфекции и индуцированной и негерметичной экспрессии системы, соответственно. Использование флуоресцентной визуализации позволяет пользователям быстро увидеть и проверить успешную трансфекцию и активацию экспрессии генов синим светом, обеспечивая ценную контрольную точку перед проточной цитометрией. Затем можно использовать проточную цитометрию для количественной оценки средней интенсивности флуоресценции (MFI) и динамического диапазона.

После световой активации клетки получают с помощью буфера FACS и анализируют с помощью проточной цитометрии. HEK293T клетки имеют длину около 11-15 мкм, что приводит к приросту FSC 500 и приросту SSC 125 (дополнительный рисунок 2C) для центрирования здоровых клеточных популяций. Более высокие напряжения приводят к анализу мусора, а не здоровых клеточных популяций. Наши прогоны постоянно содержат более ~60% событий в первых воротах популяции (P1) (Рисунок 3A-D). Поскольку популяции здоровых клеток составляют большую часть событий на графике SSC-A и FSC-A, плотность событий также может быть проверена для идентификации большей части популяции (дополнительный рисунок 3A). Затем можно выполнить дискриминацию дуплетов с помощью графика SSC-H и SSC-A, что имеет решающее значение для надежных и воспроизводимых результатов60,61. В этой системе мы обнаружили, что более 95% событий, стробированных в P1, являются синглетами (рис. 3A-D). На графике SSC-A и FITC-A нетрансфицированные клетки, как правило, будут находиться слева от центра графика и будут закрыты для популяции <0,1% (рисунок 3A). Затем eGFP-положительные клетки заполнят ворота, которые были пустыми в нетрансфицированном образце, что приведет к измерениям MFI при анализе отдельных клеток (рис. 3B). После того, как отрицательный и положительный контроль собраны для установки правильных стробов и напряжений, образцы с 2pLACE могут быть проанализированы с использованием тех же стробов для надежного исключения автофлуоресцентных ячеек (рис. 3C, D). Здесь процент популяции для eGFP-положительных клеток составил ~99% для CMV-eGFP и ~57% для клеток, трансфицированных 2pLACE. Конечный затвор также может быть использован на канале PE-A для обеспечения захвата высокофлуоресцентных клеток (дополнительный рисунок 3B).

Другое соотношение, которое было выбрано для тестирования, было 3:7. В качестве этапа валидации перед проточной цитометрией были получены изображения флуоресцентной микроскопии, в ходе которой наблюдалась успешная трансфекция для индукции экспрессии eGFP с помощью 2pLACE, что ожидаемо меньше, чем у CMV-eGFP (рис. 4A). После сбора данных проточной цитометрии 2pLACE экспрессию генов, активированных синим светом, можно сравнить с экспрессией генов «утечки» (рис. 4B). Используя настройки, перечисленные в шаге 3.1, мы смогли наблюдать ~3-кратное увеличение экспрессии после активации синим светом, что соответствует увеличению флуоресцентного сигнала, качественно наблюдаемого при микроскопии. Кроме того, эффективность трансфекции можно косвенно увидеть, измерив % eGFP-положительной популяции или процента родителя на ~60% здоровых одиночных клеток (рис. 4C).

Реализация этого протокола в полном объеме позволяет определить оптимальные соотношения масс (рисунок 5A) и интенсивность света (рисунок 5B) для максимального динамического диапазона и настраиваемого выражения. При соотношении масс ниже 6:4 наблюдался больший динамический диапазон (3,5-4,5), в то время как при соотношении масс выше 6:4 наблюдалось уменьшение динамического диапазона из-за увеличения фона и снижения максимальной экспрессии eGFP. Для максимальной выразительности и широкого динамического диапазона предпочтительно соотношение 3:7. Соотношения ниже 3:7 показали аналогичные индукции фолда, но имели меньшую общую максимальную экспрессию. Используя ранее откалиброванные значения интенсивности света38 (табл. 2), можно охарактеризовать уровень экспрессии генов по отношению к различным интенсивностям света. Интенсивность света также контролировала уровни экспрессии eGFP, где MFI насыщается со скоростью ~3 мВт/см2. Интенсивность света сверх этого значения может иметь различные значения MFI, вероятно, из-за фотообесцвечивания в некоторых образцах, наблюдаемого при ~9 и 11 мВт/см2.

Рисунок 1: Общий конвейер высокопроизводительных экспериментов по тестированию оптогенетических систем. Клетки засевают в черный 96-луночный планшет на 24 ч. Затем клетки трансфицируют с помощью 12-минутного инкубационного периода ДНК и трансфекционного реагента. Через 24 часа после трансфекции пластина помещается на OptoPlate-96 для активации синего света. После желаемой продолжительности активации синим светом клетки подготавливаются в среде красного света для проточной цитометрии. Данные проточной цитометрии представлены в виде графиков средней интенсивности флуоресценции eGFP-положительных клеток в темноте или под действием синего света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения 2pLACE во включенном и выключенном состоянии в HEK293T клетках. Различные массовые отношения CRY2-eGFP: CIBN-gRNA были протестированы на уровни экспрессии eGFP. Клетки подвергались воздействию синего света (ON) или хранились в темноте (OFF) в течение 24 часов. Масштабная линейка представляет собой 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные диаграммы рассеяния проточной цитометрии нетрансфицированных (UT), CMV-eGFP и 2pLACE HEK293T клеток. Проточную цитометрию проводили с использованием функции загрузчика планшетов. (A) HEK293T ячейки были стробированы на основе прямого рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния (SSC-A). Концентрацию событий на графиках SSC-A и FSC-A можно визуализировать с помощью контурной диаграммы (дополнительный рисунок 3A), что помогает при гейтировании здоровых популяций. Дискриминация дублетов была выполнена на графике SSC-H и SSC-A с использованием линейного вентиля. Окончательный график конструирования флуоресцентных клеток по ссылке на нетрансфицированный образец. (B) Клетки были закрыты, как показано на рисунке (A), что показывает флуоресцентную популяцию и интенсивность флуоресценции в статистической таблице (дополнительный рисунок 2B). (C,D) 2pLACE-трансфицированные клетки стробировали отдельно через P3-ворота. Пурпурная популяция представляет все eGFP-положительные клетки (дополнительный рисунок 3B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Качественный и количественный анализ индуцированной светом экспрессии eGFP в HEK293T клетках. (A) Флуоресцентные микроскопические изображения HEK293T клеток, трансфицированных плазмидами 2pLACE или CMV-eGFP. (B) Количественная оценка средней интенсивности флуоресценции (MFI) eGFP в клетках, поддерживаемых в условиях синего света или темноты. (C) Процент eGFP-положительных клеток, измеренный с помощью анализа с помощью проточной цитометрии. В результате гейтирования <0,1% нетрансфицированных клеток попадали в пределы порога eGFP-положительного порога. Данные проточной цитометрии представляют собой средние значения, а полосы погрешностей указывают на стандартные отклонения от четырех технических повторений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Проточная цитометрия репрезентативных массовых соотношений интенсивностей 2pLACE и синего света. (A) Различные массовые соотношения CRY2-eGFP: CIBN-gRNA трансфицировали в HEK293T клетки, которые затем подвергали воздействию синего света или держали в темноте с использованием тех же настроек, которые были описаны на шаге 3 протокола. Каждое состояние является средним значением 3 биологических реплик. (B) Репрезентативная тенденция экспрессии генов в зависимости от интенсивности синего света. Каждое условие является средним значением 6 технических повторов. Средние интенсивности флуоресценции количественно оцениваются с помощью проточного цитометрического гейтирования клеток, экспрессирующих eGFP. Все полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Для соотношений плазмид статистическая значимость MFI была рассчитана с использованием одностороннего t-критерия , сравнивающего светлый и темный соотношения плазмид. Для интенсивности света статистическая значимость была рассчитана с помощью одностороннего ANOVA и теста T2 Тамхана post hoc по сравнению с темным (выключенным) состоянием. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 и нс не является значимым. Этот рисунок был адаптирован из Garimella et al.38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Количество плазмид CRY2-eGFP и CIBN-gRNA в лунке с использованием примерных концентраций. Объемные количества указываются на лунку и могут быть изменены в зависимости от количества образцов или повторений в эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Рекомендуемые значения интенсивности синего света. Код находится в Файле дополнительного кодирования 1 (строки 215-228). Эквивалентные значения интенсивности рассчитываются с использованием данных калибровки, ранее сообщенных с помощью измерителя оптической мощности. Каждый уровень интенсивности имеет 6 технических повторов. Строки G и H предназначены для CMV-eGFP и нетрансфицированных контрольных скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Шаги 5.1-5.5 протокола. (A) Запуск программы запуска системы. (B) Стандартизация контроля качества с использованием флуорофорных шариков. (C) Переключение с отбора проб из пробирки в режим загрузчика пластин. (D) Выбор скважин для маркировки в качестве пробных скважин; Для этого примера было выбрано 35 скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Шаги 5.6-5.14 протокола. (A) Построение графиков светорассеяния: FSC-A против SSC-A для гейтинга популяции здоровых клеток, SSC-A против SSC-H для дискриминации дублетов и SSC-A против FITC-A для гейтирования автофлуоресцентных и eGFP-положительных клеток. (B) Создание статистической таблицы для получения данных FITC-A для измерения средней интенсивности флуоресценции. (C) Выделение правил остановки на вкладке «События для отображения». Обеспечьте медленную скорость потока образца, извлеките и загрузите планшет, инициализируйте зонд проточного цитометра и отрегулируйте напряжение регистрации. (D) Создание полигонов для ворот каждой популяции, как показано на рисунке. (E) Добавление соответствующего количества скважин. (F) Нажмите на кнопку «Автозапись » после завершения настроек и ворот. (G) Нажмите на кнопку «Ежедневная очистка » после того, как все образцы собраны и статистика экспортирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Валидация всех клеток в пределах захваченного затвора, визуализированная зелеными событиями в P4 (пурпурный). (A) Контурная диаграмма здоровой популяции в пределах eGFP-положительных популяционных ворот (P3). Клетки в основном сосредоточены в красных зонах, уменьшаясь наружу. (B) График SSC-A в сравнении с PE-A для стробирования P4, обеспечивающий дополнительную проверку для обеспечения учета всех флуоресцирующих событий на графике FITC-A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл кодирования 1: Пример кода Arduino, реализующего все свойства, описанные в вышеуказанном протоколе. Этот файл активирует все положения светодиодов с использованием рекомендуемых значений интенсивности светодиодов, приведенных в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.