Трехмерная количественная оценка кишечной слизи с помощью визуализации целых тканей

Summary

В этом исследовании представлен метод 3D-визуализации с использованием целых тканей кишечника и многофотонной микроскопии для количественного определения секретируемой слизи, что позволяет проводить точный объемный анализ и визуализацию динамики слизи в ответ на такие стимулы, как карбамоилхолин хлорид.

Abstract

Слизь играет важную роль в поддержании гомеостаза кишечника, облегчая пищеварение, формируя барьер против микробов и регулируя иммунные реакции в кишечнике. Его секреция модулируется различными внутренними и внешними факторами, включая микробные инфекции и воспаления. В то время как традиционные методы анализа слизи основаны на относительной количественной оценке, такой как измерение толщины слизи в гистологических срезах, эти подходы дают ограниченное представление о фактическом объеме и пространственном распределении секретируемой слизи в просвете кишечника. Здесь мы представляем подробную методологию абсолютной, трехмерной количественной оценки слизи с использованием целых тканей кишечника и многофотонной микроскопии. Этот протокол включает в себя подготовку лигированных петель кишечника, обработку карбамоилхолина хлоридом в качестве стимула для активации бокаловидных клеток, фиксацию тканей и окрашивание для визуализации. С помощью многофотонной микроскопии мы получаем Z-сложенные изображения люминальной поверхности. Они обрабатываются в программном обеспечении Imaris для количественной оценки объема и пространственного распределения выделяемой слизи. Мы продемонстрировали, что карбамоилхолина хлорид надежно индуцирует секрецию слизи как в подвздошной, так и в толстой кишке в течение 30 минут. Выделяемая слизь появляется спорадическим и прерывистым образом по всему просвету, что подчеркивает важность объемного анализа по сравнению с традиционными двумерными подходами. Этот протокол позволяет исследователям получать абсолютные количественные данные и визуализировать распределение слизи in situ, предлагая мощный инструмент для изучения динамики кишечной слизи в физиологических и патологических условиях.

Introduction

Слизистая среда желудочно-кишечного тракта млекопитающих очень динамична, способствуя колонизации разнообразного микробного сообщества. Эпителий кишечника состоит из различных специализированных клеток, которые взаимодействуют друг с другом для поглощения питательных веществ, поддержания целостности барьера и связи с иммунной системой¹. Среди них бокаловидные клетки хранят гранулы муцина и выделяют слизь в просвет в установившихся условиях. Эта слизь образует критически важный физический барьер, предотвращая прямой микробный контакт с эпителиальным слоем, модулируя воспаление тканей и поддерживая гомеостаз кишечника ^2,3. Нарушение регуляции секреции слизи нарушает барьерную функцию и связано с воспалением и онкогенезом 4,5,6,7.

Секреция кишечной слизи может быть вызвана внутренними факторами, такими как нейромедиатор ацетилхолин, и микробными компонентами комменсалов ^8,9. Учитывая сложность кишечной среды, многие факторы, влияющие на секрецию слизи бокаловидных клеток, остаются неизученными. Таким образом, точный метод количественного определения просветной слизи имеет важное значение для изучения того, как различные стимулы влияют на динамику секреции. Традиционные подходы в основном основаны на относительной количественной оценке: например, измерение толщины слизи с помощью флуоресцентных или угольных частиц в системах кишечных эксплантов ex vivo ^10,11 или оценка расстояния между люминальными микробами и эпителием в окрашенных срезах тканей^12,13. Хотя эти методы удобны для относительных сравнений, они могут не охватывать полное распределение или трехмерную структуру секретируемой слизи, особенно потому, что секретируемая слизь не всегда равномерно покрывает эпителий.

В данном исследовании мы представляем метод трехмерной визуализации и абсолютной количественной оценки просветной слизи с использованием целых тканей кишечника. Этот подход требует фиксации свежей ткани с помощью соответствующего фиксатора для сохранения структурной целостности и морфологии с последующим флуоресцентным окрашиванием и визуализацией с помощью конфокального или многофотонного микроскопа. Путем введения испытуемых препаратов непосредственно в лигированные петли кишечника мышей, находящихся под глубоким наркозом, с последующей немедленной фиксацией, метод сохраняет нативную архитектуру слизи и позволяет анализировать кинетику секреции. По сравнению с разрезанными тканями, где глубина визуализации в основном ограничена толщиной ткани, глубина визуализации целых тканей (без делипидации) достигает примерно 200-300 мкм, что ограничено рассеянием света и помутнением ткани. Используя эту методику, мы показываем, что карбамоилхолина хлорид (CCh), аналог ацетилхолина, рецепторы которого экспрессируются на бокаловидных клетках¹⁴, надежно индуцирует быструю секрецию слизи. Примечательно, что выделяемая слизь образует как непрерывный слой вдоль эпителия, так и прерывистые структуры в просвете, особенности, которые трудно обнаружить в обычных срезах ткани. Этот протокол обеспечивает надежную платформу для количественной оценки трехмерного распределения кишечной слизи и для сравнения слизисто-индуцирующего потенциала различных стимулов.

Protocol

Все эксперименты на животных одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Чанг Гун. Животноводческий комплекс Университета Чанг Гунг аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC). В этих исследованиях не наблюдалось никаких проблем со здоровьем животных.

1. Подготовка фиксирующей основы

1. Смешайте порошок агарозы с ddH₂O до концентрации 4% (по массе) в колбе для микроволновой печи. Готовьте в микроволновой печи 2-3 минуты, пока не закипит без мелких пузырьков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем зависит от количества образцов; примерно 10 мл на посуду диаметром 6 см.
2. Дайте раствору агарозы остыть до ~60 °C за ~3 минуты. Осторожно вылейте агарозу в посуду диаметром 6 см, пока высота жидкости не достигнет половины посуды (примерно 10 мл для посуды диаметром 6 см).
3. Поставьте блюдо с крышкой в закрытое место на 20-30 минут, пока агароза полностью не застынет.

2. Подготовка фиксирующего материала

1. Подготовьте новые медные провода и разрежьте их на отрезки по 5 мм. На каждый кусочек ткани требуется 6-8 кусков проволоки.

3. Приготовление раствора ГЧ

1. Растворите кристаллический CCh в стерильном буфере PBS до конечной концентрации 10 мкМ (200 мкл на одну кишечную петлю).

4. Приготовление инъекционных анестетиков

1. Для приготовления стокового раствора для анестезии растворите 2,2,2-трибромэтанол в 2-метил-2-бутаноле.
2. Используйте стерильный PBS для разбавления исходного раствора таким образом, чтобы конечный рабочий раствор содержал 30 мг/мл 2,2,2-трибромэтанола и 3% (v/v) 2-метил-2-бутанола.
3. Тщательно перемешайте в течение ~1 минуты, пока в растворе не останется гранул (максимальная скорость: 8).
4. Храните стоковый раствор в темноте при температуре 4 °C во избежание порчи; Утилизируйте подвой через 1 месяц после приготовления.
5. Перед анестезией наберите исходный раствор в стерильную PBS и хорошо перемешайте, чтобы обеспечить равномерное диспергирование, достигнув конечной дозы 250 мг/кг на мышь.
   ВНИМАНИЕ: 2,2,2-трибромэтанол обладает нейротоксичностью, а 2-метил-2-бутанол летуч и имеет раздражающий запах. Следует использовать надлежащие средства защиты. Для утилизации соберите отходы в герметичный контейнер и следуйте процедурам утилизации опасных химических отходов, принятым в учреждении.

5. Посев в кишечник с помощью петлевой инъекции

1. Обезболите мышь в возрасте 6-8 недель внутрибрюшинной инъекцией 200 мкл 2,2,2-триброметанола (250 мг/кг на мышь) и положите мышь на грелку для поддержания температуры тела.
2. После стерилизации поверхности кожи спиртом сделайте разрез в левой нижней части живота мыши с помощью операционных ножниц и обнажите слепую кишку под наркозом.
3. Определите подвздошную кишку или проксимальный отдел ободочной кишки, поместите кишечную петлю на стерильную марлю и с помощью артериальных зажимов закрепите оба конца, создав замкнутую петлю длиной 3 см.
4. Промойте орган на марле стерильным ПБС.
5. Ввести стерильный реагент PBS или CCh в объеме не более 200 мкл в перевязанную петлю кишечника под анестезией.

6. Забор тканей, фиксация и окрашивание

1. Через 30 минут лечения усыпьте мышь при вывихе шейки матки и извлеките кишечную петлю.
2. С помощью щипцов удерживайте петлю кишечника и аккуратно промойте ее в стерильном PBS.
3. Аккуратно разрежьте петлю кишечника в продольном направлении и промойте ткань в стерильном PBS.
4. Разровняйте ткань и с помощью отрезков медной проволоки закрепите ее на агарозе в посуде диаметром 6 см.
5. Зафиксируйте ткань 10 мл 4% раствора параформальдегида на 12-24 ч в чашке.
6. Промойте салфетку PBS не менее 3 раз, чтобы удалить остатки параформальдегида.
7. Погрузите ткань в 10 мл блокирующего буфера (PBS с добавлением 0,4% Triton X-100 и 3% бычьего сывороточного альбумина [BSA]) при 4 °C на 12-24 ч в чашке.
8. Окрасьте ткань агглютинином зародышей пшеницы (WGA, 1:200) и фаллоидином (1:500) в блокирующем буфере, встряхивая при 120 об/мин при 4 °C в течение 12-24 часов в посуде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму расход красителя, ткань можно закрепить на застывшей агарозе в чашке диаметром 3 см, погрузив в 2 мл буфера для красителя для окрашивания.
   ВНИМАНИЕ: Параформальдегид представляет опасность при вдыхании. Во время работы с вытяжным шкафом следует использовать надлежащие средства защиты, например, при работе в вытяжном шкафу. Для утилизации соберите отходы в герметичный контейнер и следуйте процедурам утилизации опасных химических отходов, принятым в учреждении.

7. Захват изображений с помощью многофотонной микроскопии

1. Промойте остатки буфера для окрашивания не менее 3 раз с помощью PBS.
2. Закрепите ткань на агарозе медными проволоками в посуде 6 см в 10 мл PBS.
3. Получите 100 оптических срезов (глубиной 99 мкм) кишечной ткани и связанной с ней секретируемой слизи с помощью многофотонного микроскопа, оснащенного линзой объектива с высоким уровнем NA, для визуализации глубоких тканей. Для многофотонной микроскопии используйте источник возбуждения, настроенный на длину волны 750 нм. Сбор сигналов излучения с помощью полосовых фильтров BP500-550 нм и BP565-610 нм. Установите скорость сканирования на 8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для многофотонной микроскопии максимальная скорость сканирования составляет 9, при этом более высокие значения указывают на более быструю сборку. Настройка скорости зависит от емкости микроскопа. При использовании платформы обработки изображений, используемой для получения 3D-стеков, мы рекомендуем скорость сканирования 8, чтобы сбалансировать время сканирования и качество изображения.

8. Анализ изображений и количественное определение содержания слизи (Рисунок 1)

1. Чтобы измерить объем каждой частицы слизи (в канале WGA), откройте стек изображений в Imaris, перетащив файл на страницу Арены. Щелкните значок Поверхность, чтобы начать процесс создания поверхности. Следуйте стандартным шагам для сегментации и количественного определения объемов частиц в z-стеке. Конкретные параметры и этапы обработки подробно описаны на рисунке 1.
2. Исключите частицы слизи размером менее 1000^мкм3, которые в основном являются бокаловидными клетками (рис. 2A, B).
3. Суммируйте объем выделяемой слизи по каждой группе.

9. Статистический анализ

1. Анализируйте и сравнивайте общий объем для каждой группы. Введите значение объема слизи в столбец и проанализируйте с помощью непараметрического теста Манна-Уитни.

Results

В этом методе мы количественно оценили объем кишечной слизи по сложенным изображениям целых тканей, полученным с помощью многофотонной микроскопии. Ткани кишечника окрашивали флуоресцентным фаллоидином и агглютинином зародышей пшеницы (WGA) для визуализации клеточного F-актина и слизи соответственно^15,16. В тканях подвздошной кишки и толстой кишки, получавших PBS, слизь WGA⁺ в основном обнаруживалась в бокаловидных клетках на поверхности эпителия. Посл...

Discussion

В данной работе мы представляем метод трехмерной количественной оценки кишечной слизи с использованием окрашивания тканей целиком, многофотонной микроскопии и анализа с помощью программного обеспечения Imiris. Эта процедура позволяет наблюдать прерывистое распределение слизи в просвете кишечника и обеспечивает абсолютное измерение объема слизи.

Прерывистое распределение слизи при стимуляции также наблюдалось в системах культивирования тканей эксплантатов

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-триброметанол	Сигма-Олдрич	T48402
2-метил-2-бутанол	Сигма-Олдрич	240486
6 см тарелка	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Гиспанагар	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Карбамоилхолин хлорид и ге; 98% (титрирование), кристаллический	СИГМА	SI-C4382-1G
Медная проволока (новая)	TOP TECH WIRE & КАБЕЛЬНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ	IW00125	Медный провод без изоляционного слоя
Щипцы	Шинетех	ST-M110
Марля, стерильная	GMTH	Май-40
GraphPad Prism 8	Программное обеспечение GraphPad
Грелку	КОНФОРТ	SY-666
IMARIS 10.0.0	OXFORD INSTRUMENTS
Параформальдегид	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Зонды для маркировки фаллоидина	Инвитроген	A12379
Ножницы	Шинетех	02-1250.18
Triton X-100	Мерк	1.08603.1000
Конъюгаты агглютинина из зародышей пшеницы (WGA)	Биотиум	29027
Zeiss 7MP с объективом погружения в воду W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti сапфировый фемтосекундный лазер (без модуля DeepSee) с детекторами BP500 нм-550 нм и BP565 нм-610 нм, а также длиной волны лазера 750 нм			платформа для визуализации, используемая для получения 3D-стеков с объективной линзой с высоким уровнем NA, для глубокотканной визуализации; Источник возбуждения для многофотонной микроскопии, настроенный на длину волны 750 нм