Методическая статья

Получение стабильных монодисперсных микропузырьков, покрытых фосфолипидами, при комнатной температуре с использованием микрофлюидного устройства фокусировки потока

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье описывается способ получения монодисперсных микропузырьков, покрытых фосфолипидами, с использованием микрофлюидного устройства для фокусировки потока при комнатной температуре, в том числе способ приготовления рецептуры фосфолипидного покрытия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Монодисперсные микропузырьки продемонстрировали значительный потенциал в повышении эффективности ультразвуковых контрастных веществ как для визуализации, так и для терапевтических целей. Эти микропузырьки могут быть получены непосредственно с помощью микрофлюидного метода фокусировки потока, который позволяет точно контролировать их размер. Тем не менее, предотвращение коалесценции во время производства остается критически важной проблемой. В то время как повышенные производственные температуры (например, 55 °C) могут подавлять коалесценцию, такие условия усложняют конструкцию микрофлюидных устройств и могут быть несовместимы с агентами нацеливания и конъюгатами лекарственных препаратов. В этом протоколе описан способ получения монодисперсных микропузырьков, покрытых фосфолипидами, при комнатной температуре, при этом стабильность и монодисперсность микропузырьков сохраняются в течение не менее 7 дней. В протоколе также описывается изготовление многоразовых микрофлюидных чипов PDMS и приготовление композиции фосфолипидного покрытия, содержащей поверхностно-активное вещество Pluronic F68. Наши результаты показывают, что микропузырьки, полученные с помощью этого метода, сохраняют свой размер и стабильность в течение 7 дней, что подтверждает их будущую применимость в клинических условиях, где необходимы стабильные и контролируемые ультразвуковые контрастные вещества.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ультразвуковые контрастные вещества (ОЦА) широко используются в клинической эхографии и терапевтических приложениях 1,2,3. При внутривенном введении эти микропузырьки остаются в сосудистой системе, действуя как агенты пула крови 4,5. Стабилизирующая оболочка покрывает микропузырьки и уменьшает диффузию газа, вызванную давлением Лапласа, тем самым продлевая срок службы микропузырьков 3,6. При воздействии ультразвука микропузырьки начинают колебаться и издавать сильные эхо-сигналы из-за сжимаемости газового ядра 7,8. Наиболее ярко колебания проявляются на резонансной частоте микропузырька, на которую влияют размер микропузырька и свойства оболочки 9,10,11. Клинически одобренные UCA обычно состоят из полидисперсных микропузырьков с широким распределением по размерам, обычно в диапазоне приблизительно 0,5-10 мкм в диаметре 12,13,14. Такое широкое распределение по размерам приводит к широкому диапазону частот, на которых эти микропузырьки являются резонансными. Учитывая, что клинические ультразвуковые зонды обычно работают в узкой полосе частот, только подмножество популяции UCA эффективно резонирует15. Было показано, что монодисперсные микропузырьки, которые имеют узкое распределение по размерам (например, PDI 3~10%16,17), усиливают диагностику и терапию по сравнению с полидисперсными микропузырьками. При ультразвуковой визуализации с контрастным усилением интенсивность увеличилась на два-трипорядка18, в то время как чувствительность неинвазивного измерения давления через субгармонические сигналы была почти в два раза выше19,20,21, а эффективность доставки лекарств увеличилась почти на порядок 22. Следовательно, получение монодисперсных микропузырьков с узким распределением по размерам и, следовательно, акустическим откликом является ключом к максимальному использованию их потенциала в ультразвуковой визуализации и терапевтических приложениях, где контролируемые колебания микропузырьков имеют решающее значение.

Монодисперсные микропузырьки могут быть получены с помощью различных методов, таких как декантация23, механическая фильтрация24 и центрифугирование полидисперсного микропузырькового агента25. Тем не менее, достижение точного контроля размера и высокой монодисперсии с помощью этих методов остается сложной задачей26. Альтернативным и более контролируемым подходом является непосредственное производство монодисперсных микропузырьков с помощью микрофлюидного устройства фокусировки потока. В этом процессе газовая нить фокусируется между двумя водными потоками липосомы на микрофлюидном чипе, что приводит к воспроизводимому отщипыванию газовой нити, что позволяет с высокой скоростью производить монодисперсные микропузырьки желаемого размера27. Несмотря на то, что методы фокусировки потока широко используются для получения монодисперсных капель28,29, их применение при производстве монодисперсных микропузырьков менее распространено из-за трудности предотвращения коалесценции и надлежащего поддержания долговременной стабильности с точки зрения размера, монодисперсности и концентрации30. Коалесценция, при которой несколько микропузырьков сливаются в более крупные, влияет на монодисперсность. Было показано, что повышенные производственные температуры снижают коалесценцию31, но это усложняет конструкцию микрофлюидных систем и может быть непригодным для составов, включающих агенты нацеливания или конъюгаты лекарственных препаратов. Поэтому получение монодисперсных микропузырьков при комнатной температуре было бы выгодным. Не менее важен и способ хранения этих монодисперсных микропузырьков, так как покрытые фосфолипидами микропузырьки имеют тенденцию сжиматься, схлопываться и терять свою монодисперсностьс течением времени. Обеспечение долговременной стабильности в течение нескольких дней во время хранения имеет решающее значение для внедрения технологии монодисперсных микропузырьков в клиническое применение.

В этом протоколе мы описываем метод получения покрытых фосфолипидами монодисперсных микропузырьков с использованием микрофлюидной платформы, фокусирующей поток, при комнатной температуре. Этот метод совместим со скоростью потока липидов в диапазоне от 13 до 42 мкл/мин и предназначен для использования при комнатной температуре, что делает его подходящим для лабораторий, в которых отсутствует контроль температуры в их микрофлюидных системах. В протоколе используется фосфолипидная форма, состоящая из 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC), 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N-[карбонил-метоксиполиэтиленгликоль] (DPPE-PEG5000) и плюроника F68, который обеспечивает стабильность и воспроизводимость. Протокол содержит пошаговые инструкции по изготовлению многоразовых микрофлюидных чипов PDMS, приготовлению растворов фосфолипидных покрытий и включению поверхностно-активного вещества Pluronic F68 для предотвращения коалесценции микропузырьков во время производства при комнатной температуре. В нем также подробно описаны процедуры очистки микрофлюидной системы для предотвращения засорения форсунок, регулировки давления газа и расхода жидкости для контроля размера микропузырьков, а также сбора и хранения образующихся микропузырьков для долгосрочной стабильности. Этот метод предлагает практический подход к получению стабильных монодисперсных микропузырьков с точным контролем размера при комнатной температуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление липидных пленок

ПРИМЕЧАНИЕ: Липидная смесь для производства монодисперсных микропузырьков состоит из бинарной смеси DSPC и DPPE-PEG5000 в молярном соотношении 90:10. DSPC был выбран в качестве основного липида, поскольку было показано, что он обеспечивает превосходную устойчивость к растворению газов как в полидисперсныхмикропузырьках 33,34, так и в монодисперсных микропузырьках31. Предполагается, что эта повышенная стабильность является результатом относительно высокой температуры перехода гелеобразно-жидкокристаллической фазы 55 °C35, что выше, чем у других широко используемых липидов, таких как DPPC (~41 °C)35, что приводит к более жесткой и непроницаемой липидной оболочке при комнатной температуре36. Здесь продемонстрирован пример приготовления раствора фосфолипидного покрытия объемом 3 мл. Для достижения конечной концентрации фосфолипидов 20 мг/мл, что является типичной концентрацией для получения монодисперсных микропузырьковтребуется 16,17, 60 мг фосфолипидов. Желаемое количество каждого фосфолипидного компонента приведено в таблице 1.

  1. Достаньте фосфолипидный порошок из морозильной камеры при температуре -20 °C и дайте оттаять при комнатной температуре в течение 1 часа.
  2. Развейте необходимый липидный порошок в отдельных мерных колбах объемом 2 мл.
  3. Приготовьте 100 мл смеси хлороформа:метанола в соотношении 90:10 В в вытяжном шкафу, отмерив 90 мл хлороформа с помощью стеклянного мерного цилиндра объемом 100 мл, а затем перенесите это в стакан Эрленмейера объемом 250 мл. Затем отмерьте 10 мл метанола с помощью стеклянного мерного цилиндра объемом 100 мл и налейте его в стакан Эрленмейера объемом 250 мл, который уже содержит хлороформ. Закройте стакан Эрленмейера стеклянной пробкой и смешайте два растворителя, осторожно поворачивая Эрленмейер до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    ВНИМАНИЕ: Хлороформ и метанол являются токсичными химическими веществами. Хлороформ является потенциальным канцерогеном и может вызывать раздражение дыхательных путей, кожи и глаз. Метанол легко воспламеняется, токсичен при вдыхании, проглатывании или всасывании через кожу и может вызвать слепоту при попадании внутрь. Всегда работайте со смесями хлороформа и метанола в хорошо проветриваемом вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания паров. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Убедитесь, что при работе с метанолом нет открытого огня или источников возгорания. Утилизируйте отходы растворителей в соответствии с протоколами учреждения по опасным отходам.
  4. Чтобы полностью растворить липидные порошки, взвешенные на Шаге 1.2, добавьте мл смеси хлороформа и метанола в каждую объемную стеклянную колбу объемом 2 мл и быстро закройте стеклянную крышку, чтобы предотвратить испарение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что липидный порошок полностью растворен. При необходимости аккуратно поворачивайте колбу, чтобы облегчить растворение.
  5. Смешайте растворенные липидные растворы в стеклянном флаконе объемом 30 мл, последовательно наливая каждый раствор.
  6. Испаряйте растворитель под постоянным потоком газообразного аргона, вращая флакон так, чтобы обеспечить равномерное распределение липидной пленки по поверхности стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные следы растворителя может быть трудно испарить с помощью только газообразного аргона. Оставьте флакон в вытяжном шкафу на 2 часа, чтобы дать возможность высохнуть. Если газообразный аргон недоступен, то для испарения растворителя хлороформ/метанол можно использовать газообразный азот37 или вакуумный ротационный испаритель, работающий при температуре 6°С31,38 °С 38 (т.е. выше температуры фазового перехода DSPC, равной 55°С35).
  7. После испарения растворителя поместите липидную смесь в вакуум, чтобы удалить остатки органических растворителей. Запечатайте стеклянный флакон слоем парапленки и проколите иглой несколько отверстий, чтобы обеспечить поток воздуха во время вакуума.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью использования парапленки является предотвращение диспергации липидов из стеклянного флакона в процессе сублимационной сушки.
  8. Поместите флаконы в сублимационную сушилку под вакуум на ночь, чтобы удалить остатки органического растворителя.
  9. Перейдите к следующему шагу или храните липидную пленку при температуре -20 °C до тех пор, пока она не понадобится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ни в этом разделе, ни в других частях протокола не используется этап центрифугирования.

2. Изготовление микрофлюидных чипов, фокусирующих поток

ПРИМЕЧАНИЕ: Монодисперсные микропузырьки получают с помощью микрофлюидного чипа, фокусирующего поток, как показано на рисунке 1A. Схема геометрии микрофлюидного канала, включая размеры сопла и выпускного отверстия, представлена на дополнительном рисунке S1. Подробный протокол изготовления фотолитографии на основе SU-8, используемой для подготовки этих форм, был описан ранее37 и может быть найден в качестве дополнительной информации к этому протоколу. Процесс изготовления микросхемы PDMS описан в следующих этапах.

  1. Смешайте основу PDMS (23 г) и отвердитель (2,3 г) в весовом соотношении 10:1, чтобы получить в общей сложности 25,5 г PDMS.
  2. Поместите мастер-форму в чашку Петри и полейте ее смесью PDMS.
  3. Дегазируйте смесь под вакуумом (2 ~ 7 мбар) в течение 40 минут, чтобы удалить захваченные пузырьки воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При больших объемах может потребоваться более длительное время дегазации, чтобы обеспечить полное удаление пузырьков.
  4. Поместите форму на горячую плиту при температуре 75 °C на 1 час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших объемов может потребоваться более длительное время отверждения.
  5. Дайте PDMS остыть до комнатной температуры. С помощью скальпеля аккуратно разрежьте вокруг отвержденного PDMS и снимите его, чтобы освободить скол.
  6. Отрежьте чип PDMS до нужного размера и проделайте отверстия на входах/выходах с помощью пуансона 1 мм.
  7. Очистите чип PDMS с помощью клейкой ленты, чтобы удалить частицы пыли.
  8. Очистите чип PDMS и предметное стекло изопропанолом, а затем деионизированной водой.
  9. Приклейте PDMS к предметному стеклу, обработав их в воздушно-плазменном очистителе в течение 1 минуты при мощности 60% (60 Вт).
  10. Поместите склеенный чип на горячую плиту с температурой 95 °C на 3 минуты, чтобы усилить сцепление.
  11. Дайте микросхеме PDMS остыть до комнатной температуры. Полностью изготовленная микросхема показана на рисунке 1C, а микроскопическое изображение светлого поля сопла показано на рисунке 1D.
  12. Поместите склеенный чип в плазменный очиститель на 5 минут при мощности 80% (80 Вт) для восстановления поверхностной гидрофильности микрофлюидного канала.
  13. Немедленно заполните чип водой Milli-Q для сохранения гидрофильности.
  14. Храните чипсы при комнатной температуре в воде Milli-Q до использования.

3. Приготовление раствора фосфолипидного покрытия

  1. Подготовленную липидную пленку достать из морозильной камеры при температуре -20 °C и разморозить при комнатной температуре в течение 1 ч.
  2. Добавьте 3 мл предварительно подогретого (55 °C) фосфатно-солевого буфера (PBS) в липидную пленку (60 мг) до достижения конечной концентрации липидов 20 мг/мл. Поместите флаконы на водяную баню при температуре 55 °C на 40 минут, переворачивая каждые 15 минут на средней скорости (уровень 3 из 5 на вихревом миксере).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап служит для предварительного растворения и равномерного диспергирования липидных компонентов в PBS перед ультразвуковой обработкой на этапе 3.5. Эта температура является температурой фазового перехода DSPC39, способствуя частичной солюбилизации и снижению агрегации липидов. Несмотря на то, что ультразвуковая обработка на этапе 3.6 требуется для достижения полной оптической прозрачности, предварительная термическая инкубация способствует более эффективной и воспроизводимой ультразвуку за счет минимизации образования крупных липидных агрегатов и повышения однородности дисперсии.
  3. Добавьте в липидную смесь 0,43 мл раствора Pluronic F68 до достижения молярной концентрации 10%, а именно, DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81:9:10 моль%. После этого образец должен визуально напоминать рисунок 2А, который представляет собой мутное решение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Pluronic F68 является поверхностно-активным веществом, используемым для предотвращения коалесценции при образовании монодисперсных микропузырьков16,40. В отсутствие Pluronic F68 монодисперсные микропузырьки не могут быть сформированы с использованием микрофлюидного устройства37Horizon и липидной композиции, описанных в настоящем протоколе16. Пропиленгликоль не использовался в липидной композиции, так как сообщалось, что это соединение нарушает как монодисперсность, так и стабильность полученной монодисперсной микропузырьковой суспензии38.
  4. Для приготовления монодисперсных микропузырьков с флуоресцентной меткой на этой стадии добавьте в смесь липидный краситель, такой как липофильный карбоцианиновый краситель.
  5. Обработать липидную смесь ультразвуком на водяной бане при 100% мощности в течение 20 минут, поддерживая температуру воды на уровне 55 °C. Через 20 мин липидный раствор должен выглядеть как показано на рисунке 2В , что является менее мутным раствором, чем на шаге 3.4. Продолжайте обработку ультразвуком с интервалом в 10 минут, пока раствор не станет прозрачным, как показано на рисунке 2C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения на рисунке 2C потребовалось 30 минут ультразвуковой обработки для получения прозрачного раствора. Определение характеристик липидного раствора может быть выполнено путем измерения размера липосом, например, с помощью динамического светорассеивателя.
  6. Перед дальнейшей обработкой дайте липидному раствору остыть до комнатной температуры.

4. Приготовление флакона для сбора микропузырьков

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения длительного хранения монодисперсных микропузырьков в качестве флакона для сбора необходим газонепроницаемый медицинский флакон.

  1. Закупорьте стеклянный медицинский флакон объемом 5 мл резиновой пробкой и наполните флакон газом C4F10 . Впоследствии сожмите алюминиевый колпачок вокруг флакона, чтобы обеспечить газонепроницаемость. Теперь флакон для сбора готов к использованию.

5. Подготовка микрофлюидной платформы

Примечание: Как показано на рисунке 3А, система включает в себя микрофлюидную платформу37 Horizon (далее именуемую «микрофлюидная платформа»), компьютер для управления, высокоскоростную камеру для наблюдения за производственным процессом, внешний источник света на светодиодах (LED) для освещения во время высокоскоростной визуализации и функциональный генератор сигналов для запуска высокоскоростной визуализации через определенные промежутки времени в процессе производства. Перед началом производства микропузырьков устройство необходимо очистить, чтобы снизить вероятность засорения форсунки. В процедуре очистки задействованы как трубки, так и микрофлюидный чип.

  1. Процедура очистки трубок
    1. Включите выключатель питания микрофлюидной платформы, который расположен с правой стороны (рисунок 3А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: «Выключатель питания» относится к основному блоку управления питанием платформы Horizon, который активирует внутренний микроконтроллер системы, насосы и датчики.
    2. Поместите стеклянный флакон объемом 4 мл, наполненный 70% этанолом, в левую сторону камеры P-насоса микрофлюидной платформы (рис. 3). Начните подачу жидкости со скоростью 100 μл/мин, чтобы входная трубка для жидкости была промыта 70% этанолом из флакона. Остановите промывку, остановив поток жидкости через 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: P-насос относится к блоку подачи газа с регулируемым давлением, встроенному в микрофлюидную систему. Этот шаг предназначен только для очистки трубки; На этом этапе трубка не должна быть соединена с микрофлюидным чипом. Этот процесс удаляет растворимую в этаноле пыль и загрязняющие вещества из жидкостной и газовой системы.
    3. Замените флакон с этанолом на флакон с водой Milli-Q.
    4. Промойте трубку водой Milli-Q со скоростью 100 мкл/мин в течение 5 минут, чтобы удалить остатки этанола из системы.
  2. Процедура очистки от стружки
    1. Включите внутренний светодиодный выключатель микрофлюидной платформы.
    2. Вставьте чип PDMS в держатель.
    3. Расположите коллектор над чипом и закрепите его с помощью регулируемого колеса.
    4. Подсоедините газовую, жидкостную и выпускную трубку к микросхеме PDMS с помощью пинцета. Конфигурация подключения показана на рисунке 3B. Убедитесь, что выпускная трубка ведет к пробирке для сбора отработанного раствора в процессе очистки.
    5. Отрегулируйте платформу так, чтобы сопло чипа находилось в поле зрения объектива.
    6. Очистите чип водой Milli-Q в течение 5 минут, используя давление газа 1000 мбар и расход жидкости 100 μл/мин. Сначала запустите поток газа, а затем поток жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе необходимо очистить микрофлюидную стружку перед соплом.
    7. Остановите поток жидкости, а затем поток газа.
    8. Подсоедините газовую и выпускную трубки, как показано на рисунке 3C.
    9. Повторите процедуру промывки водой Milli-Q в течение еще 5 минут, используя давление газа 1000 мбар и расход жидкости 50 μл/мин. Сначала запустите поток газа, а затем поток жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка очищает микрофлюидную стружку после сопла.
    10. Остановите поток жидкости, а затем поток газа. Чип PDMS теперь готов к производству микропузырьков.

6. Настройка высокоскоростной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга и управления производством монодисперсных микропузырьков рекомендуется интегрировать высокоскоростную камеру с микрофлюидной платформой, так как микропузырьки будут производиться со скоростью более 105 микропузырьков/с. Высокоскоростная камера позволяет измерять размер микропузырьков на кристалле и скорость производства, а также контролировать коалесценцию микропузырьков на кристалле.

  1. Установите светодиодный источник света над монтажной платформой (рис. 3A), чтобы освещать микрофлюидный чип во время высокоскоростной визуализации.
  2. Подключите высокоскоростную камеру к боковому порту визуализации микрофлюидной платформы.
  3. Используйте внешний функциональный генератор сигналов для запуска высокоскоростной записи с интервалом в 10 с в течение всего времени создания микропузырьков. Подключите выход запуска TTL генератора сигналов к внешнему входу запуска высокоскоростной камеры с помощью стандартного кабеля BNC для обеспечения синхронизированного захвата данных. Этот мониторинг необходим для оценки формы газовой нити и стабильности размера микропузырьков во время производства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывный мониторинг важен, так как во время производства может произойти засорение. Кроме того, высокоскоростные последовательности изображений используются для извлечения распределений микропузырьков по размерам на кристалле с временным разрешением. Этот интервал в 10 секунд может быть скорректирован в зависимости от требований пользователя».

7. Получение и определение характеристик монодисперсных микропузырьков

  1. Перед началом производства настройте сборную пробирку, как показано на рисунке 4A. Проткните одну иглу через резиновую пробку, которая будет служить иглой для сбора, а другую иглу через пробку в качестве иглы для вентиляции, при этом кончик иглы будет расположен на дне флакона. Во время производства держите собирательную пробирку перевернутой с помощью зажима.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вентиляционная игла обеспечивает постоянное давление внутри флакона во время сбора. Поскольку C4F10 тяжелее воздуха, он не выходит из флакона самопроизвольно.
  2. Загрузите приготовленный фосфолипидный раствор в Р-насос микрофлюидной платформы.
  3. Переместите сопловую часть чипа в поле зрения объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидная платформа включает в себя внутренний оптический модуль с регулируемым зумом и фокусировкой, а также внешний соединитель F-mount для крепления высокоскоростной камеры.
  4. Чтобы начать образование микропузырьков, установите давление газа на 800 мбар и расход жидкости на 40 μл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидная платформа объединяет два жидкостных канала с регулируемым потоком, 1-5 мкл/мин слева и 1-100 мкл/мин справа, а также один газовый канал с регулируемым давлением. В этом протоколе использовался жидкостный канал со скоростью 1-100 мкл/мин и газовый канал с регулируемым давлением.
  5. Как только жидкость достигает сопла, газовая нить отщипывается и выпускает монодисперсные микропузырьки через выпускное отверстие (рисунок 4A).
  6. Установите высокоскоростную запись на частоту кадров ≥ 200 000 кадров в секунду и используйте высокоскоростную запись для измерения размера образующихся микропузырьков с помощью функции imfindcircles в MATLAB.
  7. Отрегулируйте давление газа и расход жидкости, чтобы контролировать размер микропузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После регулировки расхода и/или давления газа используйте скрипт MATLAB для построения графика распределения размеров на кристалле по высокоскоростной записи. Подгоняя распределение по размерам к распределению Гаусса, можно получить среднее μ и σ стандартного отклонения. μ представляет собой размер на кристалле производимых монодисперсных микропузырьков. Коалесценция микропузырьков может произойти на начальном этапе производства из-за остаточной воды Milli-Q в трубке, которая разбавляет концентрацию липидов. Эта проблема обычно решается после того, как неразбавленный липидный раствор достигает сопла. В таблице 2 обобщены полученные диаметры микропузырьков для нескольких прикладываемых скоростей потока при постоянном давлении газа 800 мбар; Различные комбинации давления газа и расхода жидкости могут создавать микропузырьки одинакового размера, хотя различные комбинации параметров также влияют на скорость производства. Известно, что при постоянном расходе газа производительность положительно коррелирует со скоростью потока жидкости41. Скорость образования микропузырьков в этом протоколе составляет порядка ~105 микропузырьков в секунду, основываясь на покадровом анализе высокоскоростных записей, что согласуется с ранее сообщенными значениями для аналогичных геометрий фокусировки потока37.
  8. Как только желаемый размер микропузырьков будет достигнут, соберите образовавшиеся микропузырьки, подсоединив выпускную трубку к собирательному флакону.
  9. Во время сбора данных настройте высокоскоростную запись на срабатывание каждые 10 секунд для контроля производственного процесса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между записями может быть скорректирован в зависимости от конкретных требований.
  10. После того как будет собрано достаточное количество микропузырьковой суспензии, извлеките вентиляционную иглу и собирательную иглу из собирательного флакона.
  11. Остановите поток жидкости, а затем поток газа.
  12. Храните собранные микропузырьки в вертикальном положении при комнатной температуре, обеспечивая минимальное механическое перемешивание флакона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор микропузырьков будет иметь три слоя, как показано на рисунке 5A: слой пены, слой монодисперсного микропузырька и субнатант. Лучше всего оставить слой пены во флаконе, так как предыдущие исследования показали, что пузырьки, связанные с пеной, могут постепенно сжиматься до размера16,38 монодисперсии. Микропузырьки, полученные с использованием этого протокола, не подвергались нормативной оценке безопасности. Тем не менее, составляющие липиды (DSPC, DPPE-PEG5000) и поверхностно-активное вещество (Pluronic F68) обычно используются в одобренных FDA инъекционных формах и считаются биосовместимыми42,43. Требуется дальнейшая доклиническая оценка для установления безопасности для медицинского использования.
  13. Через 2 часа после обработки (т.е. через 2 часа после производства монодисперсных микропузырьков) определить окончательный размер и концентрацию микропузырьков с помощью машины для определения характеристик частиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монодисперсные микропузырьки, полученные методом фокусировки потока, требуют примерно 90 минут для стабилизации до их конечного размера44. Поэтому рекомендуется дать не менее 2 часов стабилизации перед использованием микропузырьков.
  14. Прикрепите иглу 19 G к мл-шприцу, далее именуемому «экстракционным шприцем».
  15. Вставьте отдельную иглу 19 G во флакон с микропузырьками в качестве иглы для вентиляции. Убедитесь, что кончик иглы остается в верхней части флакона, чтобы обеспечить поступление воздуха и поддерживать внутреннее давление во время экстракции микропузырьков.
  16. Аккуратно взболтайте флакон, чтобы гомогенизировать суспензию. Суспензия будет разделена на три слоя: верхний слой пены, средний слой, содержащий монодисперсные микропузырьки, и нижний водный слой.
  17. Быстро введите шприц для экстракции и осторожно расположите кончик иглы в середине слоя монодисперсных микропузырьков, избегая пены и опуская водный субтонирующий слой. Извлеките нужный объем микропузырьковой суспензии и извлеките шприц для экстракции из флакона. Когда извлечение микропузырьков будет завершено, извлеките иглу для вентиляции.

8. Порядок очистки и отключения

ПРИМЕЧАНИЕ: После производства микропузырьков микрофлюидная платформа и чип должны быть тщательно очищены, чтобы обеспечить надлежащее функционирование и возможность повторного использования чипа. Следующие шаги описывают процесс очистки.

  1. Для чипа действуйте следующим образом:
    1. Замените липидный флакон на флакон с водой Milli-Q.
    2. Промывайте микрофлюидный чип под давлением газа 800 мбар и расходом жидкости 40 мкл/мин в течение 5 минут.
    3. Сначала остановите поток жидкости, а затем остановите поток газа.
    4. Отсоедините только входную трубку газа от микрофлюидного чипа.
    5. Заполните микрофлюидный чип водой Milli-Q для поддержания гидрофильности внутренних поверхностей.
    6. Остановите поток жидкости и отсоедините все оставшиеся трубки от чипа.
    7. Храните чип в воде Milli-Q до тех пор, пока он не понадобится для использования в будущем.
  2. Для микрофлюидной системы действуйте следующим образом:
    1. Замените флакон с водой Milli-Q флаконом с 70% этанолом на микрофлюидной платформе.
    2. Промойте входную трубку жидкости 70% этанолом со скоростью потока 100 мкл/мин в течение 5 минут, чтобы удалить остатки липидов.
    3. Замените флакон с этанолом на флакон с водой Milli-Q в P-Pump1.
    4. Промойте трубку водой Milli-Q со скоростью 100 мкл/мин в течение 5 минут, чтобы удалить остатки этанола из системы. Теперь система чистая.
    5. Отключите микрофлюидную платформу и систему высокоскоростных камер.

9. Действия по устранению неполадок

  1. Засорение форсунок
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая небольшой размер сопла (5 мкм), в процессе производства могут возникать засоры. Чтобы устранить засор, выполните следующие действия.
    1. Немедленно остановите поток жидкости, а затем поток газа.
    2. Подсоедините трубки в соответствии с конфигурацией, показанной на рисунке 3B.
    3. Замените флакон, наполненный фосфолипидами, флаконом, наполненным водой Milli-Q, в P-Pump1.
    4. Примените давление газа 1000 мбар и установите расход жидкости на 100 мкл/мин на 5 мин, чтобы промыть сопло.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев засоры устраняются после 5-минутного полоскания. Однако, если блокировка не устранена, может потребоваться замена чипа PDMS на новый.
    5. Как только засор будет устранен, снова подсоедините трубку, как показано на рисунке 3C.
    6. Снова промойте чип водой Milli-Q в течение 5 минут, используя давление газа 1000 мбар и расход жидкости 50 мкл/мин, чтобы обеспечить полный очиститель.
    7. Замените наполненный водой флакон Milli-Q флаконом, наполненным фосфолипидами, в P-Pump1 и возобновите производство микропузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если засорение не прекращается во время производства, это может указывать на недостаточную очистку трубки или микрофлюидного чипа. В этом случае отсоедините трубку от чипа и следуйте процедуре очистки, описанной в шаге 5. Если засорение продолжает происходить после тщательной очистки всей системы, это может указывать на неисправность внутреннего фильтра в микрофлюидной платформе. Замена фильтра на новый может решить проблему.
  2. При желании используйте микрофлюидный чип повторно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если чип не хранится должным образом, он может потерять гидрофильность. В этом случае защемление газовой нити может напоминать рисунок, показанный на рисунке 5E. В таких случаях рекомендуется перейти на новую микросхему, которая является гидрофильной, чтобы обеспечить стабильное и надежное образование микропузырьков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы представляем метод получения стабильных монодисперсных микропузырьков при комнатной температуре с использованием микрофлюидного чипа, фокусирующего поток. Микросхема PDMS изготавливается методом литья из мастер-формы, как показано на Иллюстрации 1. Для приклеивания чипа PDMS к предметному стеклу используется плазменная обработка. Плазменная обработка имеет решающее значение, поскольку она изменяет поверхность PDMS с гидрофобной на гидрофильную. Эта гидрофильность имеет ва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описано, как производить и хранить стабильные монодисперсные микропузырьки при комнатной температуре с помощью микрофлюидного чипа, фокусирующего поток. Монодисперсный микропузырь может быть использован для ультразвуковой визуализации18 с контрастным усилением, неинвазивного зондирования давления19 и доставки лекарственного препарата22 с помощью микропузырьков, как in vitro , так и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично профинансирована Европейским исследовательским советом (ERC) в рамках Программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 (Соглашение о гранте 805308) и частично Applied and Engineering Sciences TTW (VIDI-проект 17543), входящим в состав NWO, оба присуждены К.К. Микрофлюидная платформа Horizon была разработана при финансировании грантов EPSRC (гранты NoNo EP/I000623 и EP/K023845). Авторы благодарят консорциум Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) в Университете Лидса за полезные обсуждения, а также Стюарта Уэстона и Эндрю Прайса за их помощь в концептуализации инструмента и производстве деталей для микрофлюидной платформы Horizon. Мастер-форма для изготовления чипов PDMS была любезно предоставлена Университетом Лидса. Авторы благодарят Роберта Берскенса из Биомедицинской инженерии, Отделение кардиологии, и Герта Спрингелинга из Департамента экспериментального медицинского оборудования, оба из Erasmus MC, Нидерланды, за техническую помощь во время экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мм пуансон для биопсии Кай Медикал143831
1,1'-Диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндодикарбоцианин (DiD)Термо Фишер СайентикД307липофильный карбоцианиновый краситель
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[карбонил-метоксиполиэтиленгликоль] (DPPE-PEG5000)ЛипоидCAS-No. 384835-61-4
1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)ЛипоидCAS-No. 816-94-4
Стеклянный измерительный цилиндр объемом 100 млБЛАУБРАНД
Мерные стеклянные колбы объемом 2 млБЛАУБРАНД
250 мл стакан ЭрленмейерБЛАУБРАНД
Стеклянный флакон объемом 30 мл DWK Медико-биологические наукиSCERC40752700D0C2
70% этанол
75 ° C конфорка 
Скотч
Алюминиевый колпачок Сигма-Олдрич27016
Газ аргон  Linde Gas Бенилюкс
C4F10 газХимикаты F2
ХлороформMerck KGaA67-66-3
Клинически доступно  ультразвуковое контрастное вещество (например, микропузырьковое)Bracco,
Plan-LesOuates, Швейцария		СоноВьюРисунок 6А.
Игла для сбора и вентиляции 19G100 Стерикан4657799
Счетчик сошников Multisizer 3Бекман КоултерМашина для определения характеристик частиц
Изготовленное на заказ ультразвуковое контрастное вещество (т.е. монодисперсный микропузырьковый)NAФ1-10ПФРисунок 6А. Произведено в соответствии с описанием: Wang, Y. et al. Влияние плуронового F68 на стабильность размеров и акустические свойства монодисперсных микропузырьков, покрытых фосфолипидами, образующихся при комнатной температуре. ACS Appl. Mater. Интерфейсы 2025, 17, 8976&минус;8986. (2025).
Изготовленное на заказ ультразвуковое контрастное вещество (т.е. монодисперсный микропузырьковый)NAФ2-10 ПФРисунок 6А. Произведено в соответствии с описанием: Wang, Y. et al. Влияние плуронового F68 на стабильность размеров и акустические свойства монодисперсных микропузырьков, покрытых фосфолипидами, образующихся при комнатной температуре. ACS Appl. Mater. Интерфейсы 2025, 17, 8976&минус;8986. (2025).
Полувода
Внешняя светодиодная подсветкаГСВИТЕКGS02370
Сублимационная сушилкаМертин Крист ГмбХАльфа 1– 2 ЛД плюс
Функциональный генератор сигналов Agilent33220А
Газонепроницаемый стеклянный флаконСигма-ОлдричZ113964-288ЭА
Предметное стеклоВВР631-1552
Высокоскоростная камераФотронНова С16
Микрофлюидная платформа HorizonУниверситет Лидса, АнглияПлатформа коммерчески доступна и подробно описана в: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Microfluidic platform for for production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Обзор научных приборов. 92 (7), 074105 (2021).
МатлабМатематические работыR2023a
МетанолMerck KGaA67-56-1
Вода Milli-Q
Гель PDMSСИЛЬГАРДSYLGARD®   184
Фосфатно-солевой буфер (PBS 1x) Gibco10010023
Плазменный очистительНаучный ХенникерГПТ-100
Плуроновый F68Thermo Fisher Scientific24040032
Резиновая пробкаСигмаZ166065-100 шт.
ТрубопроводМастерфлексMFLX06407-41ПТФЭ, внутренний диаметр 1/32 дюйма x внешний диаметр 1/16 дюйма; 25 футов
Выщипывать пинцетом
Вихрь Сигма-ОлдричZ654779
Ультразвуковая баня с водяной банейEMAGЭММИ 30НС

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Pluronic F68
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи