Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиная модель рецидива лейкоза при индукционной химиотерапии при остром лимфобластном лейкозе

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

В этой статье

Краткое содержание

Протокол направлен на описание мышиной модели генерации рецидивов острого лимфобластного лейкоза, основанной на динамике ответа на индукционную химиотерапию.

Аннотация

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является новообразованием незрелых лимфоидных клеток-предшественников и одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у детей. Несмотря на то, что показатели излечения при ОЛЛ у детей приближаются к 90%, рецидив и лекарственная устойчивость остаются проблемами. В этом контексте изучение биологии рака in vivo имеет важное значение, и для этой цели широко используются ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX) с использованием мышиных моделей. Тем не менее, PDX из образцов с рецидивом или по сравнению с диагностическими образцами не позволяют в полной мере оценить механизмы возникновения и прогрессирования рецидива. Этот протокол основан на генерировании рецидивов B-ALL PDX у мышей, что позволяет собирать лейкозные клетки на протяжении всего процесса приобретения лекарственной устойчивости. Животные, приживленные клетками B-ALL PDX, лечатся комбинацией четырех препаратов, обычно используемых в терапии ОЛЛ, представляющих различные механизмы действия: дексаметазон, винкристин, L-аспарагиназа и даунорубицин. После 4-недельной фазы индукции ремиссии за животными наблюдают на предмет рецидивов в период покоя. Цикл лечения и рецидива повторяется до тех пор, пока время рецидива не сокращается, выступая в качестве суррогата повышенной лекарственной устойчивости in vivo. Чтобы изучить механизмы, лежащие в основе рецидива и резистентности, лейкозные клетки собираются до и после каждого цикла лечения для фенотипического и генетического анализа. Для валидации модели были протестированы различные образцы ОЛЛ у детей, включая как хорошие, так и плохие ответы, что оценивалось по наличию бластов в периферической крови после 7 дней терапии кортикостероидами и по минимальной остаточной болезни (МОБ) на 15, 33 и 78/96 день. Результаты, наблюдаемые на мышах, согласуются с данными пациентов, подтверждая точность модели в имитации клинического ответа на химиотерапию. Этот подход позволяет динамически изучать рецидив и лекарственную устойчивость при B-ОЛЛ, поддерживая механистические исследования и разработку новых терапевтических стратегий.

Введение

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у детей. Несмотря на высокие показатели излечения, достигнутые в последние десятилетия, с 5-летней общей выживаемостью, достигающей 90%в странах с высоким уровнем дохода1, и значительные усилия по поиску новых терапевтических стратегий, в развитых странах у 15%-20% пациентов случается рецидив заболевания, при этом выживаемость варьируется от 30% до 60% в зависимости от того, произойдет ли первый рецидив рано (до 18 месяцев) или позже (36 месяцев) после постановкидиагноза. 3. В связи с этим, рефрактерность и рецидив ОЛЛ остаются проблемами, которые необходимо преодолеть. С точки зрения диагностики, рефрактерный ОЛЛ отличается от рецидива низкой чувствительностью к химиотерапии, в то время как рецидив ОЛЛ характеризуется рецидивом заболевания после периода ремиссии. Как и для других видов рака, для ОЛЛ характерны генетические аномалии, включая анеуплоидии, хромосомные перестройки и различные генные мутации, которые связаны с различными терапевтическими реакциями и риском рецидива4. Поскольку рецидивы ОЛЛ чаще возникают у пациентов с высоким риском, которые уже получали химиотерапию максимальной интенсивности, дальнейшие корректировки доз или комбинаций препаратов вряд ли будут достаточными. Вместо этого усилия должны быть направлены на выявление механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости и рецидива.

В свете этого исследователи попытались понять, как давление отбора, оказываемое химиотерапией, способствует появлению резистентных клеток. Большая часть существующей литературы связывает рецидив с распространением резистентного злокачественного субклона, который уже присутствовал намомент постановки диагноза. Тем не менее, недавнее исследование предполагает существование альтернативных механизмов, таких как эпигенетические модификации, которые регулируют транскрипционные программы, которые также могут способствовать рецидиву6.

Значительные усилия были направлены на создание точных моделей in vivo для изучения ВСЕХ рецидивов. Иммунодефицитные мыши были успешно использованы для приживления ОЛЛ, сохранив исходные признаки заболевания 7,8, что привело к разработке ксенотрансплантатов (PDX), полученных от пациента. Эта модель позволяет осуществлять приживление и пролиферацию исходных опухолевых клеток/клеток лейкемии в совместимом микроокружении. Одним из его основных преимуществ является возможность оценки реакции трансплантированных ОЛЛ клеток на химиотерапию9.

Модели PDX также использовались для имитации и изучения ВСЕХ рецидивов. Например, в протоколе, разработанном Samuels et al.10 , использовались мыши, не страдающие ожирением и тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID), которым были трансплантированы клетки лейкемии пациента, для изучения механизмов резистентности к индукционно-подобному режиму химиотерапии. Авторы описали лечение винкристином, дексаметазоном, L-аспарагиназой и даунорубицином (VXLD) и привели примеры количества циклов лечения и сроков рецидива. Тем не менее, модель была сосредоточена на анализе клеток сразу после лечения - тех, которые пережили первоначальную терапию - вероятно, представляя собой минимальную остаточную болезнь (МОБ), а не рецидив.

В более позднем исследовании оценивалось, является ли краткосрочным лечением ОЛЛ-трансплантированного НОД. Мыши с иммунодефицитом Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, или NSG) могли прогнозировать рецидив у соответствующих пациентов11. Образцы ОЛЛ промежуточного риска - как от рецидивирующих, так и от нерецидивирующих пациентов - были трансплантированы мышам и обработаны индукционной схемой, состоящей из винкристина, дексаметазона и L-аспарагиназы (VXL). Измеряли и сравнивали время до приживления и рецидивы после лечения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эта PDX-модель может служить прогностическим инструментом для прогнозирования исходов для пациентов. Этот вывод подтверждает полезность мышиных моделей PDX для изучения биологии рецидивов ОЛЛ. Например, рецидивирующие клетки могли быть исследованы в разные моменты времени, чтобы раскрыть механизмы, лежащие в основе рецидива.

В этой рукописи мы представляем усовершенствования модели мышей PDX для изучения рецидива B-ОЛЛ. Мы стремимся изучить рецидив заболевания и характеристики рецидивирующих клеток после их формирования с помощью индукционной химиотерапии. Схема из четырех препаратов, похожая на индукцию - винкристин, дексаметазон, L-аспарагиназа и даунорубицин - была стандартизирована с использованием линии мышей NSG. Известно, что этот штамм имеет ограничения в выдерживании повторных циклов химиотерапии из-за мутации Prkdcscid и повышенной чувствительности к генотоксическому стрессу12. Поэтому масса тела животного контролировалась как маркер токсичности лечения. Модель рецидива B-ALL можно разделить на три основных этапа: (1) трансплантация клеток ALL мышам с целью достижения порога приживления 0,2-1% клеток CD45⁺ человека в периферической крови; (2) 4 недели химиотерапии, за которыми следует период покоя до первого рецидива (R1); и (3) при обнаружении R1 повторные 1-недельные циклы лечения индукционного типа. Последующие рецидивы (R2, R3... RN), и регистрируется интервал между лечением и рецидивом (Δt). Прогрессирующее укорочение Δt интерпретируется как признак приобретенной лекарственной устойчивости. В рамках более глубоких исследований механизмов рецидива клетки B-ALL могут быть собраны до и после различных этапов протокола. Важно подчеркнуть, что в зависимости от времени между возникновением рецидива и восстановлением клеток, присущие этому феномену механизмы могут не сохраняться. В связи с этим крайне важно, чтобы после подтверждения рецидива клетки были собраны быстро. Собранные клетки могут быть использованы для будущих фенотипических и генетических анализов, включая, среди прочего, оценку динамики клеточного цикла, миграции клеток, частоты клеток, инициирующих лейкемию, хромосомных изменений и эпигенетических модификаций.

В рамках данной статьи мы сосредоточимся на описании модели мыши с рецидивом. Подробная информация будет предоставлена для трех экспериментальных фаз - трансплантации, лечения до первого рецидива (R1) и циклического лечения до множественных рецидивов (R2, R3...). Мы надеемся, что эта модель позволит исследователям создавать устойчивые к химиотерапии B-ALL клетки из различных подтипов, что позволит глубже изучить клеточные и молекулярные изменения, связанные с рецидивом. В конечном счете, это может способствовать лучшему пониманию механизмов резистентности и способствовать разработке более эффективных и персонализированных методов лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с правилами и этическими принципами Comissão de Ética no Uso de Animais из Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). Образцы лейкемии, использованные в этом исследовании, были получены из биобанков флаконов пациентов, проходивших лечение в Centro Infantil Boldrini, которые разрешили использование своих клеток через форму информированного согласия. Проект был одобрен Комитетом по институциональной этике (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Трансплантация клеток лейкемии и мониторинг приживления

  1. Подготовка образцов лейкемии для трансплантации мышей
    1. Разморозьте ранее криоконсервированные образцы ВСЕХ клеток, взятых из аспирата костного мозга пациента. Используйте набор водяной бани при температуре 37°C. Разморозьте образцы, перемещая криопробирку круговыми движениями.
    2. Переложите размороженный образец в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 14 мл 1x стерильного PBS в образец, чтобы промыть клетки и удалить раствор для криоконсервации. Центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость.
  2. Приготовление раствора для пересадки
    1. Ресуспендируйте размороженные клетки в стерильном 1x PBS. Используйте 5-10 x 106 жизнеспособных клеток в объеме 100 мкл PBS для каждого животного, подлежащего трансплантации. Держите раствор для трансплантации на льду до пересадки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки подсчитывали по полуавтоматическому методу13.
  3. Трансплантация мышей
    1. Выберите 2-месячного кобеля или самку NOD. Мышам Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) для трансплантации лейкемии.
      Примечание: Для поддержания однородного экспериментального дизайна, свободного от полового вмешательства животных, образцы ALL были пересажены мышам обоих полов, гарантируя, что все хорошо и плохо реагирующие лейкозы были одинаково представлены у обоих полов. В результате мы обнаружили, что самки мышей приживаются раньше, чем самцы мышей. Учитывая это, чтобы избежать возможного вмешательства пола мышей в будущие анализы (например, кинетика приживления), мы предлагаем использовать только один пол мыши при работе с одним и тем же образцом лейкемии. Никакие другие параметры не использовались для того, чтобы отдавать предпочтение одному полу перед другим.
    2. Помещайте по одной мыши за раз в надежную и одобренную мышеловку, чтобы обеспечить надлежащее содержание животного. Следите за тем, чтобы хвост животного находился за пределами ловушки и был легко доступен для пересадки.
      Примечание: Клетки лейкемии трансплантируются мышам путем внутривенной (в/в) инъекции. Согласно установленным протоколам, для этой цели используются боковые вены хвоста11.
    3. Используйте инфракрасный свет, чтобы обеспечить правильное расширение вен. Введите 100 μл раствора для трансплантации с помощью стерильной, острой, одноразовой иглы для инъекций. Храните пересаженных мышей в определенном помещении, свободном от патогенов. Дайте им отдохнуть в течение 15 дней.
      1. Чтобы использовать инфракрасный свет, держите уже скованное животное за пределами клетки и на расстоянии 30 см от света. В зависимости от потенциальной мощности света регулируйте время экспозиции. При использовании света средней мощности достаточно периода в 5 минут, чтобы обеспечить расширение вен. Если оставить хвост открытым в течение более длительного периода времени, животное может получить ожоги и стресс.
      2. Для инъекции используется инсулиновый шприц с прикрепленной иглой, объемом 1 мл и размером иглы 12,7 мм х 0,33 мм. Со спецификацией используемой иглы можно ознакомиться в Таблице материалов. Поддерживайте мышей в режиме 12 ч/12 ч свет/темнота. Кроме того, животные, использованные в этом исследовании, содержатся в автоклавируемой полупрозрачной клетке из янтарного поликарбоната с обогащением окружающей среды для создания гнезд.
  4. Забор периферической крови
    1. Соберите образец периферической крови объемом 50 мкл у каждой мыши через 2 недели после прививки и каждую неделю в дальнейшем.
    2. Вручную удерживайте животное левой рукой, следя за тем, чтобы его голова была надежно удержана. Правой рукой с помощью стерильного, острого одноразового ланцета проколите лицевые вены подчелюстного сплетения животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это потенциально опасная процедура для мышей, и ее следует выполнять осторожно.
      1. Убедитесь, что животное может легко дышать во время фиксации. Следите за изменениями частоты дыхания (одышка) и изменением цвета рта (он не должен стать фиолетовым или темно-синим). Если подчелюстное сплетение не проколото правильно, из-за прокола слухового прохода может возникнуть кровотечение в ухе. Чтобы помочь будущим экспериментаторам, доступен дополнительный рисунок 1 , чтобы убедиться в правильном расположении сплетения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для сбора образцов крови также можно использовать кровотечение из хвостовой вены.
    3. После сбора не оставляйте животное без присмотра. Он должен быть активным и невредимым. Если мышь проявляет признаки падения (головы или тела) и бездействия, ее следует усыпить. Не превышайте объем 50 мкл, так как большее количество крови может привести к смерти животного.
    4. Во избежание коагуляции образца образца храните собранный образец крови в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл, содержащей 8 мкл 50 мМ ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали ранее приготовленный раствор ЭДТА в качестве антикоагулянта. При желании на этом этапе также можно использовать коммерчески доступные пробирки ЭДТА малого объема для сбора крови. Образцы крови должны быть обработаны в тот же день.
  5. Подготовка образцов периферической крови к обработке
    1. Гомогенизируйте кровь с помощью ЭДТА. Перелейте 50 μл смеси в пробирку проточной цитометрии.
    2. Приготовьте смесь антител, которую следует добавить в каждый образец, состоящую из антитела против мышиного CD45 (mCD45), антитела против человеческого CD45 (hCD45), антитела против человеческого CD19 (hCD19) и стерильного 1x PBS в качестве разбавителя.
  6. Обработка образцов крови
    1. Добавьте 10 мкл смеси антител в каждый образец крови. Гомогенизируйте легкими постукиваниями указательным пальцем. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящие антитела, описанные выше, с учетом доступных каналов цитометра. Чтобы определить количество антител, используемого в образце, рассмотрите возможность выполнения кривой титрования для каждого антитела. Антитела, использованные в нашем исследовании, флуорохромы и объем, выбранный для образцов, перечислены в дополнительной таблице 1. Полное описание каталожных номеров антител и названий клонов приведено в Таблице материалов.
    2. Добавьте 1 мл коммерческого 1x раствора для лизиса эритроцитов (эритроцитов) в каждый образец. Энергично гомогенизируйте указательным пальцем. Выдерживать в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для лизиса, используемый на этом этапе, представляет собой коммерчески доступный 10-кратный раствор для лизиса эритроцитов. Если используется другой реагент, необходимо отрегулировать рабочий объем для лизиса в 1x.
    3. Добавьте 2 мл стерильного 1x PBS в каждый образец для первого этапа промывки. Центрифугируйте образцы при плотности 200 x g (в качающемся роторе) в течение 5 мин при комнатной температуре. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость, перевернув, и высушите оставшуюся жидкость в верхней части тюбика, аккуратно промокнув бумажными полотенцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах промывки клетки лейкемии будут гранулированы на дне цитометрической трубки, а оставшаяся жидкость будет отброшена. Крайне важно проявлять осторожность при работе с образцами, так как в некоторых случаях гранулы могут быть неразличимы. Чтобы обеспечить целостность гранулы, избегайте встряхивания пробы, так как это может привести к ее потере.
    4. Повторите шаг 1.6.3. Ресуспендируйте клетки лейкемии 200 мкл стерильного 1x PBS, осторожно постукивая указательным пальцем по цитометрической трубке. Образцы готовы к анализу с помощью проточной цитометрии. Контроль приживления должен быть проведен в тот же день, что и забор крови.
  7. Мониторинг приживления методом проточной цитометрии
    1. Использовать стандартные методологии проточной цитометрии 9,14 для определения процентного соотношения CD45+ клеток человека в периферической крови по отношению к CD45+ клеткам мышей (% hCD45+).
    2. Соберите данные, полученные с помощью проточной цитометрии, для последующего анализа процентного соотношения hCD45+ к общему количеству клеток CD45 (hCD45+ плюс mCD45+) с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить надлежащий мониторинг приживления, следующие этапы анализа должны быть выполнены в тот же день. Эта ежедневная последовательность особенно важна при рассмотрении начала будущего графика лечения, который мы рекомендуем начинать с понедельника. При невозможности начать лечение в понедельник, лечение можно начинать в любой день недели, в зависимости от достижения уровня hCD45+% (0,2%-1%) по периферической крови.
  8. Подготовка среды для анализа данных проточной цитометрии
    1. Запустите программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. Импортируйте собранные данные и дождитесь их распознавания инструментом.
    2. Откройте данные из исходного образца, чтобы создать ворота, помеченные лимфоцитами. Проверьте настройки оси: выберите FSC-A для оси X и SSC-A для оси Y. На верхней панели создания стробов выберите инструмент «Полилинкер» и обведите контур основной популяции клеток.
      Примечание: Лимфоциты обычно появляются в диапазоне от 50 000 до 100 000 по оси X и от 0 до 50 000 по оси Y. Значения могут варьироваться в зависимости от особенностей каждого лейкоза.
    3. Дважды щелкните на воротах , чтобы создать новые ворота. Чтобы исключить дублеты ячеек, установите FSC-A по оси X и FSC-H по оси Y. Используйте инструмент полилинера, чтобы изолировать популяцию первичных клеток. Нарисуйте ворота близко к населению, исключив события, удаленные вдоль оси X.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге различаются события отдельных ячеек.
  9. Создание цитометрической панели для различения клеточных популяций
    1. Дважды щелкните выбранную популяцию , чтобы отличить клетки CD45 человека от мыши. Установите ось X на флуорофор mCD45, а ось Y на SSC-A. С помощью инструмента «Фигура» нарисуйте квадрат вокруг mCD45-отрицательной популяции.
    2. Дважды щелкните результирующую популяцию , чтобы различить клетки hCD19+ и/или hCD45+. Установите ось X на флуорофор hCD19, а ось Y на hCD45. На панели создания стробов выберите Перпендикулярные линии , чтобы разделить отдельные популяции.
      Примечание: В качестве альтернативы исследователь может использовать вентиль или возможность для различения клеток hCD45 и mCD45. Эта возможность рассматривает сумму событий как 100%, создавая более точную стратегию идентификации популяций.
  10. Применение статистики к созданной панели
    1. Рассчитайте процент каждой популяции изолированных клеток по отношению ко всем приобретенным событиям. В главном окне программы щелкните правой кнопкой мыши значок подграфа , полученный из основного графика каждого образца, и выберите «Создать статистику». В открывшемся окне нажмите кнопку Частота и выберите Single Cell. Выполняйте этот шаг отдельно для каждого подграфа.
    2. Выберите все внесенные изменения, чтобы применить стратегию стробирования и связанную статистику ко всем выборкам. Затем с помощью левой кнопки мыши перетащите выбранные изменения в опцию «Все сэмплы» в главном окне программы.
    3. Нажмите «Редактор таблиц» в главном окне, чтобы создать таблицу со всеми рассчитанными частотами. Во всплывающем окне выберите формат файла .xls, укажите папку назначения и нажмите «Создать таблицу».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, выполненные с использованием программного обеспечения для анализа проточной цитометрии, можно визуализировать на дополнительном рисунке 2. Итоговая таблица, созданная на этом этапе, содержит процент hCD45+, необходимый для построения графиков для анализа прогрессирования приживления с течением времени.
  11. Построение графика развития приживления
    1. Запустите программное обеспечение для построения и анализа графиков. Выберите формат таблицы XY. В главном окне выберите «Ввод» или «Импорт данных в новую таблицу», установите для параметра X значение «Числа» и Y для параметра «Ввод» для репликации значений в параллельных подстолбцах.
    2. В открывшейся таблице организуйте заголовки столбцов: введите Days of engraftment для столбца X и % hCD45+ на PB для первой группы подстолбцов Y. Заполните столбец X днями после инъекции, соответствующими дням забора крови для контроля приживления. Вручную введите еженедельно собираемый процент данных hCD45+ для каждой мыши в подстолбцах Y.
    3. В меню программного обеспечения в подмножестве Семейство выберите Данные 1. Во всплывающем окне выберите вторую опцию графика под названием «Точки и соединительная линия с полосами погрешностей» и включите построение графиков средних значений и полос погрешности.
    4. Настройте оси графика в нужных диапазонах. Нажмите «Экспорт » в правом верхнем углу меню, чтобы загрузить окончательный график.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, собранные во время экспериментов с любым отдельным ОЛЛ, должны быть нанесены на один и тот же график, чтобы облегчить анализ с течением времени с начала эксперимента. Описательный пример построения графика можно найти на дополнительном рисунке 3.

2. Лечение мышей

  1. Приготовление рабочих растворов лекарств
    1. Приготовьте рабочий раствор винкристина в концентрации 1 мг/мл. Приготовьте рабочий раствор дексаметазона в концентрации 4 мг/мл. Приготовьте рабочий раствор L-аспарагиназы в концентрации 2000 МЕ/мл. Приготовьте рабочий раствор даунорубицина в концентрации 2 мг/мл.
      Примечание: Препараты, используемые в данном протоколе, эквивалентны тем, которые используются при клиническом лечении пациентов15. Рабочий раствор дексаметазона состоит из креатинина, дигидрата цитрата натрия, гидроксида натрия, бисульфита натрия, метилпарабена, пропилпарабена и воды для инъекций. Рабочий раствор винкристина состоит из маннита, серной кислоты, гидроксида натрия и воды для инъекций. L-аспарагиназа и даунорубицин часто доступны в лиофилизированной форме. В таких случаях рекомендуемым средством для восстановления является стерильная вода для инъекций, которую необходимо использовать для достижения правильной концентрации. Чтобы предотвратить потерю активности препарата из-за повторяющихся циклов размораживания, препараты необходимо делить на рабочие аликвоты, используемые не более 3х.
  2. Масса животных при выявлении лейкоза
    1. Начинайте лечение в тот момент, когда процент клеток hCD45+ в периферической крови мышей достигает медианы от 0,2% до 1%. Достигнув его, разделите пересаженных мышей на две отдельные группы: одну для лечения, а другую для контроля.
    2. При достижении установленного порога следует продолжать еженедельный мониторинг прогрессирования лейкемии. Непрерывный сбор данных о hCD45% для мониторинга реакции на лечение, возникновения рецидивов и выявления лекарственной устойчивости.
    3. Взвесьте животных, подлежащих лечению. Используйте среднее арифметическое весов для определения дозы каждого препарата, который будет вводиться в группе. Взвесьте животных контрольной группы, чтобы сравнить прибавку/потерю веса между группами.
      1. Применяют следующие дозы препарата: винкристин, 0,15 мг/кг; дексаметазон, 5 мг/кг; L-аспарагиназа, 1 000 МЕ/кг; и даунорубицин, 1,2 мг/кг. Взвешивайте всех животных не менее 3 раз в неделю: в понедельник, среду и пятницу. С помощью гирь можно регулировать лечебные дозы препаратов и контролировать уровень токсичности лечения.
  3. Приготовление растворов для введения препарата из рабочего раствора аликвот
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы для введения лекарственного средства состоят из стерильного 1x PBS в качестве разбавителя и правильного объема (в соответствии с весом животного) рабочих лекарственных растворов (стерильная вода используется исключительно для восстановления, а не для инъекций), вводимых каждый день недели. Препараты, которые вводятся внутрибрюшинно, могут быть объединены в одном растворе; Однако, если какой-либо препарат вводится внутривенно, его следует поместить в индивидуальный раствор. Объем вводимого раствора препарата для введения каждому животному составляет 100 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильный инсулиновый шприц с прикрепленной иглой (1 мл, с размерами иглы 12,7 мм Х 0,33 мм) использовали на описанном выше этапе. С полным описанием шприца можно ознакомиться в Таблице материалов.
    1. В понедельник приготовьте раствор для введения препарата, состоящий из дексаметазона, винкристина и PBS. Вводят препараты внутрибрюшинно.
    2. Во вторник и четверг приготовьте раствор для введения препарата, состоящий из дексаметазона, L-аспарагиназы и PBS. Вводят препараты внутрибрюшинно.
    3. В среду приготовьте раствор для введения препарата, состоящий из дексаметазона и PBS, и введите его внутрибрюшинно. Готовят второй раствор для введения препарата, состоящий из даунорубицина и ПБС. Вводите его внутривенно.
    4. В пятницу приготовьте раствор для введения препарата, состоящий из дексаметазона и ПБС. Вводят препарат внутрибрюшинно.
    5. Позвольте животным отдохнуть в выходные дни. Повторяйте цикл лечения в течение 4 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полный график лечения можно найти в дополнительной таблице 2. Важно уточнить, что другие протоколы, уже разработанные для лечения мышей, были протестированы, но привели к высоким уровням токсичности для штамма NSG. Таким образом, предложенный график лечения был сначала подвергнут процессу стандартизации для снижения токсичности, что привело к дозам и частоте введения, представленным в этом протоколе. Ожидается, что процент hCD45+ в группе лечения снизится по сравнению с процентом hCD45+ в контрольной группе в связи с назначением лечения.
  4. Назначение лекарственных препаратов и мониторинг реакции на лейкоз
    1. Вручную удерживайте животное левой рукой для введения препаратов внутрибрюшинно. Держите животное брюшной частью вверх. На вентральной части найдите нижний правый квадрант.
    2. Правой рукой используйте стерильную, острую, одноразовую иглу для инъекций и введите 100 мкл раствора для введения препарата в нижний правый квадрант мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при удержании животного; Это не должно быть вредной процедурой для мышей. Как и при сборе крови, будьте в курсе любых респираторных осложнений. В случае внутрибрюшинных инъекций всегда держите иглу перпендикулярно, чтобы избежать сверления органа.
    3. Следуйте тем же инструкциям, которые используются для трансплантации клеток лейкемии для внутривенного введения лекарств. Дайте мышам отдохнуть после 4 недель лечения до повторного появления ВСЕХ клеток, называемых здесь первым рецидивом (R1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на разницу в способе введения, при внутривенном введении используется тот же объем, что и при внутрибрюшинном введении.
  5. Мониторинг чувствительности к лейкозу и выявление первого рецидива (R1)
    1. Не прекращайте еженедельный мониторинг лейкемии с помощью проточной цитометрии во время лечения или в фазах покоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая лечение 5 дней в неделю, настоятельно рекомендуется проводить мониторинг в начале недели. В нашем исследовании забор крови, обработка образцов и анализ всегда проводились по понедельникам.
    2. Выполните забор крови и любые последующие процедуры, необходимые для мониторинга, в соответствии с шагами 1.4 - 1.11.
      Примечание: После определенного периода покоя клетки R1 будут обнаружены по внезапному увеличению процента hCD45+ в периферической крови мышей. Период между окончанием лечения и возникновением рецидива варьирует и может быть различным для каждого обследованного лейкемии. При обнаружении R1 следует провести третью и заключительную фазу предложенной мышиной модели рецидива. Для улучшения мониторинга и анализа ответа мы предлагаем использовать объективные меры ответа, такие как прогрессирующее заболевание, стабильное заболевание, уровень реакции (частичный, полный или поддерживаемый), ремиссия и резистентность, в соответствии с рекомендациями, описанными Randall et al. (2024)16.

3. Повторные циклы лечения до появления резистентных клеток

  1. Выявление первого рецидива
    1. Назначайте целую неделю лечения индукционного типа любой мыши с рецидивом лейкемии (называемым R1), т.е. когда достигнут порог 0,2% hCD45+ в периферической крови. В течение 1 недели, с понедельника по пятницу, следуйте графику приема препарата, используемому для 4-недельного лечения индукционного типа.
      Примечание: Введение только 1 недели лечения на данном этапе направлено на проверку in vivo , приобрели ли клетки лейкемии устойчивость к химиотерапии, в конечном итоге приводя к прогрессированию лейкемии до последовательных рецидивов с течением времени под давлением химиотерапии. Мы решили не применять вторую 4-недельную схему, чтобы избежать чрезмерной токсичности и потери животных.
    2. Дайте мышам отдохнуть в конце полной недели приема препарата. Продолжайте еженедельный мониторинг ответа лейкемии с помощью проточной цитометрии, следуя шагам 1.4 - 1.11.
      Примечание: Ожидается, что на этом этапе клетки лейкемии будут оставаться чувствительными к лечению. Следовательно, при мониторинге лейкемии процент hCD45+ у мышей должен снижаться и оставаться отрицательным в течение определенного периода.
  2. Мониторинг появления R2
    1. Дождитесь появления рецидива R2 (клетки hCD45+ ≥ 0,2%). Когда он появится, подсчитайте время, прошедшее между окончанием лечения и появлением R2. Назовем этот период Δt1.
    2. Перейдите ко второй полной неделе введения лечения индукционного типа. Следуйте тем же рекомендациям, что и при первом применении этого графика.
    3. Дайте мышам отдохнуть в конце лечения. Продолжайте наблюдение за лейкемией.
  3. Мониторинг появления R3
    1. Дождитесь появления рецидива R3. Отсчитайте время так же, как и в шаге 3.2.1. Назовем его Δt2.
    2. Сравните Δt1 и Δt2. Повторите вышеуказанные шаги N раз, чтобы получить множественные рецидивы лейкемии (R1, R2... RN), если период Δt остается прежним. Прекратите циклы лечения, как только период Δt сократится.
      Примечание: Снижение Δt до рецидива является признаком лекарственной устойчивости, приобретенной клетками лейкемии. Этот результат усиливает способность мышиной модели рецидива генерировать устойчивые к химиотерапии клетки ОЛЛ.
    3. Восстановите клетки лейкемии, как описано в шаге 4 ниже. Храните их живыми с помощью криоконсервации или с помощью любого консерванта, совместимого с предполагаемыми последующими анализами.
      Примечание: Рекомендуемым событием для восстановления клеток лейкемии является до 25% hCD45+ в периферической крови, как описано в современной литературе16.

4. Восстановление лейкозных клеток путем забора органов

  1. Мышам эвтаназия с передозировкой химических анестетиков
    1. Усыпляйте мышей путем передозировки химических анестетиков с последующим вывихом шейки матки для подтверждения эвтаназии, как описано ниже.
    2. Приготовьте смесь, содержащую три анестетика, разведенных в стерильном 1х ПБС для глубокой анестезии. Используйте 150 мкл коммерческого ацепромазина малеата, 50 мкл коммерческого ксилазина, 80 мкл коммерческого кетамина и 220 мкл PBS на каждое животное, подлежащее эвтаназии.
    3. Введите 500 мкл приготовленной смеси путем внутрибрюшинного введения. Следуйте тем же рекомендациям по сдерживанию и инъекциям, которые описаны в шаге 2.4.
    4. Под действием передозировки химических анестетиков мыши лягут на дно клетки. Через несколько минут понаблюдайте, есть ли у мышей остановка дыхания. Если это так, подождите, пока дыхательное усилие прекратится. Чтобы убедиться в эффективности процедуры эвтаназии, проверьте наличие непроизвольного рефлекса, надавливая на одну из задних лап животного. Для подтверждения эвтаназии приступают к вывиху шейки матки.
  2. Вывих шейки матки
    1. Прижмите животное тыльной стороной к решетке для корма клетки. Указательным и большим пальцами левой руки сформируйте форму пинцета. Поместите пальцы в форме пинцета прямо под голову животного. Плотно прижмите к шейному отделу позвоночника.
    2. Возьмитесь за хвост животного правой рукой. Оттяните его назад сильным и устойчивым движением, пока голова животного не отделится от остальной части его тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вывих шейки матки является одним из принятых методов подтверждения эвтаназии 17,18,19. В качестве альтернативы можно использовать и другие методы, такие как продолжительное воздействиеСО2 в течение как минимум 15 минут после остановки дыхания.
  3. Подготовка животных к забору органов
    1. Продезинфицируйте мышей, нанеся 70% спирт на все их тело. Поместите тело животного над хирургической платформой для грызунов брюшной частью вверх. Побрейте брюшную часть тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное описание хирургической операционной платформы для грызунов можно найти в Таблице материалов.
  4. Забор селезенки
    1. Сделайте небольшой надрез стерильными хирургическими ножницами и пинцетом на коже живота. Удалите его из области живота, обнажив брюшину.
    2. Сделайте небольшой надрез в брюшине. Разрежьте его до тех пор, пока не будет получен полный доступ к органам, расположенным в брюшной полости.
    3. Найдите селезенку, прямо под животом животного. Удалите селезенку. Поместите его в реципиент, содержащий стерильный 1x PBS для дальнейшей обработки.
  5. Заготовка бедренной кости
    1. Приступайте к вскрытию брюшинной полости, чтобы получить доступ к задним лапам животного.
    2. Найдите бедренную кость. Удалите его, разрезав в суставах, которые соединяют его с тазовой костью, а также с большеберцовой и малоберцовой костью. Проделайте этот процесс для обеих бедренных костей.
    3. Очистите кости, удалив все оставшиеся мышцы, кожу или ткани. Поместите их в реципель, содержащий стерильный 1x PBS для дальнейшей обработки. Выбросьте тушу животного в соответствии с рекомендациями Комитета по этике животных.
      Примечание: В зависимости от целей исследования, ВСЕ клетки также могут быть собраны из печени, центральной нервной системы, тимуса, лимфатических узлов и т.д. В этой рукописи, в качестве примера, мы описываем сбор ВСЕХ клеток из селезенки и костного мозга.
  6. Подготовка к переработке органов
    1. Соберите одну стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл, два стерильных шприца объемом 1 мл, одну стерильную иглу для подкожных инъекций размером 25 мм x 0,6 мм и два стерильных клеточных фильтра объемом 70 мкм.
  7. Обработка селезенки
    1. Поместите одно сетчатое фильтр на верхнюю часть открытой центрифужной пробирки объемом 50 мл. Положите селезенку на поверхность клеточного ситечка. Мацерируйте орган плоской частью поршня шприца до тех пор, пока не станут видны большие участки.
    2. Добавьте стерильный 1x PBS в мацерированную селезенку. Выполняйте круговые движения плоской частью поршня шприца, чтобы обеспечить фильтрацию клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заливка PBS может производиться постепенно; однако конечный используемый объем не может превышать 6 мл. По завершении обработки селезенки клеточный фильтр должен быть чистым и лишенным каких-либо остаточных тканей. В случае насыщения клеточного фильтра можно использовать альтернативный клеточный фильтр. Содержимое первоначального ситечка может быть перенесено во второе ситечко, после чего обработка может быть продолжена. Чтобы получить доступ к опухолевой опухоли в этом органе, часть селезенки может быть отделена для гистопатологической оценки.
  8. Обработка костного мозга
    1. Вставьте новый клеточный фильтр для обработки костного мозга в уже используемую центрифужную пробирку. Разрежьте края бедренной кости до тех пор, пока отверстия костного мозга не станут доступными. Введите иглу для подкожных инъекций в новый шприц. Добавьте в шприц 1 мл стерильного 1x PBS.
      Примечание: В зависимости от целей исследования, ВСЕ клетки, полученные из селезенки и костного мозга, должны быть собраны отдельно. В этом случае для каждой ткани следует использовать отдельную центрифужную пробирку. Часть бедренной кости может быть отделена для гистопатологической оценки, чтобы оценить опухолевую нагрузку в этом органе.
    2. Промывайте костный мозг через клеточное ситечко. Вставьте кончик иглы в отверстие костного мозга с одной стороны. Надавите на поршень шприца сильным и постоянным движением. Повторите процедуру с другой бедренной костью.
    3. Отсоедините иглу. Используйте плоскую часть шприца для мацерации промытого костного мозга. Добавьте стерильный 1x PBS в мацерированный костный мозг. Выполняйте круговые движения плоской частью поршня шприца, чтобы обеспечить фильтрацию клеток. По завершении процедуры обработки центрифужная пробирка объемом 50 мл будет содержать общий объем 10 мл, содержащий смесь клеток селезенки и костного мозга, разведенных в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс заливки PBS может выполняться постепенно; однако крайне важно обеспечить, чтобы конечный используемый объем не превышал 2 мл.

5. Выделение лейкозных клеток методом градиентного центрифугирования

  1. Подготовка к выделению лейкозных клеток
    1. Соберите одну центрифужную пробирку объемом 15 мл, стерильные одноразовые пипетки Пастера, центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую обработанные органы, и среду градиента плотности для выделения лимфоцитов.
      Примечание: Среда способствует изоляции мононуклеарных ячеек, создавая градиент плотности за счет центрифугирования. Мононуклеарные клетки (лимфоциты, моноциты и ОЛЛ клетки) образуют слой на границе между средой и плазмой.
  2. Выделение лейкозных клеток
    1. Добавьте 5 мл градиентной среды для выделения лимфоцитов в центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью одноразовой пипетки Пастера. Постепенно добавляйте 10 мл смеси клеток селезенки и костного мозга поверх среднего слоя. Держите пробирку под небольшим углом, около 30° или меньше, и медленно добавляйте смесь ячеек вдоль стенки пробирки, чтобы слой плотной среды не был нарушен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность во время этого процесса, чтобы убедиться, что клетки не смешиваются со средой плотности. Возмущение во время этого процесса может привести к нарушению формирования градиента плотности во время центрифугирования.
    2. Центрифугируйте пробирку объемом 15 мл при давлении 420 x g на роторе с качающимся ведром в течение 30 мин, без ускорения и без перерыва, чтобы не нарушать образовавшиеся фазы.
      Примечание: Лейкозные клетки образуют слой между плотной средой и водными фазами.
    3. Удалите и выбросьте верхнюю водную фазу с помощью стерильной одноразовой пипетки Пастера. Соберите образовавшийся слой лейкозных клеток с помощью стерильной одноразовой пастеровской пипетки. Переложите его в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокойтесь, если часть среднего слоя с низкой плотностью пипетируется вместе с клетками лейкемии.
  3. Промывка лейкозных клеток
    1. Добавьте стерильный 1x PBS в пробирку, содержащую собранные клетки, до тех пор, пока не будет достигнут предел в 15 мл.
    2. Центрифугируйте клетки при 300 x gв течение 5 минут. Восстановите максимальное ускорение и торможение. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в новом стерильном холоде 1x PBS.5.3.3.Приступайте к проверке клеток и жизнеспособности клеток. Следуйте стандартным рекомендациям по процедуре подсчета ячеек13. Промытые клетки могут быть окрашены антителом против мышиного CD45 (mCD45), антителом против человеческого CD45 (hCD45) и антителом против человеческого CD19 (hCD19) с последующим этапированием промывки и сбором данных.
      Примечание: В случае обработки клеток селезенки и клеток костного мозга в различных центрифужных пробирках, часть этих образцов может быть использована для доступа к опухолевой нагрузке в этих органах с помощью проточной цитометрии.
  4. Криоконсервация лейкозных клеток
    1. Гранулируйте клетки центрифугированием при 300 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость. Держите клетки на льду.
    2. Приготовьте замораживающую среду, состоящую на 90% из стерильной холодной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Используйте 1 мл этого раствора на каждый флакон для криоконсервации.
    3. На льду ресуспендировать клетки в приготовленном растворе в концентрации 2 х 107 клеток/мл. Поместите клетки в пробирки для криоконсервации. Криоконсервация клеток в соответствии со стандартными рекомендациями по криоконсервации клеточных культур20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти ячейки могут быть использованы для дальнейших анализов. Вместо того, чтобы замораживать жизнеспособные клетки, можно также аликвотировать и консервировать клетки в различных консервантах для последующего анализа ДНК, РНК, белка и метаболитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В контексте наших исследований образцы ОЛЛ-предшественников В-клеток были отобраны из двух групп пациентов: одна, которая продемонстрировала благоприятный ответ, что определялось отсутствием лейкозных клеток в периферической крови на 8-й день и отсутствием остаточных лейкозных клеток в костном мозге на 15, 33 и 78/96 день. Другая группа была сформирована ОЛЛ, которые соответствовали молекулярным подгруппам предыдущих, полученных от пациентов с плохим клин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание биологических механизмов, лежащих в основе опухолевых заболеваний, имеет важное значение для разработки более эффективных методов лечения и улучшения результатов лечения пациентов. При таких состояниях, как острый лимфобластный лейкоз у детей, эти исследовательские подходы не только актуальны для повышения показателей излечения, но и имеют особую ценность для пациентов, у которых стандартные методы лечения достигли пределов терапевтической интенсивности и переносимости. В услов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Centro Infantil Boldrini и всех пациентов, которые пожертвовали свои образцы для исследования. Мануэлла М. Хофф получила стипендию от Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) от Исследовательского фонда Сан-Паулу (FAPESP, 2024/ 03383-2). Хосе А. Юнес получил стипендию в области продуктивности от Национального совета по технологическому и научному развитию (CNPq, 308399/2021-8). Эта работа была поддержана финансированием исследований от Министерства здравоохранения Бразилии в рамках программы PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 mL  шприцBD #309628Извлечение органов
10 мл стерильной воды для инъекцииHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Восстановление препарата
10-кратное решение лизиса эритроцитовBioLegend#420302Обработка образцов крови мышей
5-канальный анализатор ячейкиBD Biosciences658226R1Потоковый цитометр и bbsp;
70 мкМ фильтрFalcom#352350Извлечение органов
Ацепромазин малеат Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Анестезия для мышей
APC анти-человеческий CD45 - изотип мыши IgG1 - клон HI30BioLegend#304037Окрашивание лимфоцитов
Аспарагиназа 10000 UАгиназа/медак#88660100Лечение мышей
Brilliant-Violet 605 антимышиный CD45 - изотип мыши IgG2 - клон 30-F11BioLegend#103139Окрашивание лимфоцитов
ДаунорубицинФармарин#116880025Лечение мышей
ДексаметазонОстро;#00000066Лечение мышей
ДиметилсульфоксидСигма-Олдрич#589569Криоконсервация лимфоцитов
Одноразовая игла — 0,60 x 25 мм (23G x 1') ’)BD#300388Извлечение органов
Esterile одноразовый ланцет Yancheng Huida Medical Instruments https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Сбор крови мышей
Этилендиаминитетретретретическая кислотаЖизненные технологии#15576-O28Решение EDTA
Сыворотка плода для быкаКультилаб#F083Криоконсервация лимфоцитов
Анализ программного обеспечения для цитометрии потока — версия 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Анализ потоковой цитометрии
Анализ программного обеспечения для графов и построения графиков — версия 9.5.1Дотматикаhttps://www.graphpad.com/featuresПостроение графиков и анализ графиков
Инсулиновый шприц с прикреплённой иглой 1 мл FX 12,7 мм X 0,33 ммDescarpacke0342101Трансплантация мышей и введение лекарств
Кетамин ИнджSespo Indú stria e comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Анестезия для мышей
Многофункциональная хирургическая платформа для грызуновKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Хирургические процедуры на мышах
ПЭ-анти-человеческий CD19 — изотип мыши IgG1 — клон HIB19BioLegend#302208Окрашивание лимфоцитов
Хлорид калияСигма-ОлдричP3911-1KGРешение PBS
Калийфосфат дибазичныйСигма-ОлдричP0662-1KGРешение PBS
Реагент для выделения лимфоцитовЦитива#17-1440-02, упаковка из 6 и раз; 100  млИзоляция лимфоцитов из извлекаемых органов
Хлорид натрияСигма-ОлдричS9888-1kgРешение PBS
Натрий фосфат дибазовый Сигма-ОлдричS9763-1KGРешение PBS
Пинцеты для стерильного анатомического рассечения — 12 см ABC 0170Лаборатория Lí Дер120Хирургические процедуры на мышах
Стерильные ножницы 12 см — ABC 0321Лаборатория Lí Дер136Хирургические процедуры на мышах
ВинкристинЛиббс#7896094208483Лечение мышей
Ксилазин ИнджSespo Indú stria e comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Анестезия для мышей

Ссылки

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мышиная модель рецидива лейкоза при индукционной химиотерапии при остром лимфобластном лейкозе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.