Method Article

Совместимый с сканирующей электронной микроскопией оптический метод визуализации для мезоскопического картирования мозга в целых клеток

DOI:

10.3791/68814

⸱

February 20th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы внедрили новую технику визуализации под названием оптическая многослойная интерференционная томография (OMLIT), которая позволяет объективно визуализировать все клетки в образцах мозга в мезомасштабе и может быть бесшовно интегрирована в процесс визуализации ленточной последовательной сканирующей электронной микроскопии на одном образце.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание структурных и функциональных связей внутри сложных нейронных сетей мозга требует построения атласов мозга, обладающих как широким полем зрения, так и субклеточным разрешением. Однако современные методы оптической и электронной микроскопии имеют ограничения, что затрудняет получение всех клеток в одном образце. Этот протокол вводит метод визуализации, называемый оптической многослойной интерференционной томографией (OMLIT), который позволяет беспорядочно оптически визуализировать все клетки в образцах мозга, полученные после подготовки образцов электронной микроскопии, тем самым восстанавливая полный атлас мозга всех нейронных клеток. Кроме того, визуализация OMLIT может быть бесшовно интегрирована с рабочим процессом визуализации автоматизированной ультрамикротомической сканирующей электронной микроскопии (ATUM-SEM). Это позволяет исследователям получать мезомасштабную структурную информацию клеток до проведения электронной микроскопии, облегчая точный выбор интересующих областей и значительно уменьшая площадь и объём данных, необходимые для высокоразрешающей электронной микроскопии (ЭМ). Мы подтвердили точность и совместимость этого метода на реальных образцах из коры мозга взрослой мыши, продемонстрировав его широкие перспективы применения в построении многомасштабного атласа мозга.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комплексное картирование нейронных цепей с клеточным и субклеточным разрешением необходимо для выявления структуры и функций мозга. Традиционные методы оптической визуализации, такие как двухфотоннаямикроскопия 1, флуоресцентная микрооптическая секционная томография (fMOST)2,3,4 и системаVISoR 5, позволили проводить мезомасштабную нейронную визуализацию и функциональную визуализацию in vivo. Однако из-за зависимости от редкой маркировки они не могут охватить всю клеточную популяцию. С другой стороны, методы оптической визуализации без меток, такие как функциональная фотоакустическая микроскопия (fPAM)6,7, оптическая когерентная томография (OCT)8 и количественная фазоваямикроскопия 9, позволяют одновременно визуализировать все нейроны в поле зрения. Тем не менее, эти методы обычно ограничены низким осевым разрешением и малой глубиной изображения, а их аппаратная сложность препятствует широкому применению в построении атласа мозга. В отличие от этого, методы последовательной электронной микроскопии (ssEM), включая серийную блок-гранную SEM (SBF-SEM)10,11, фокусированный ионный пучок SEM (FIB-SEM)12,13,14 и автоматизированную ультрамикротомию с сбором ленты SEM (ATUM-SEM)15,16,17 , может выявлять плотные синаптические сети связности с нанометровым разрешением, предоставляя необходимые инструменты для высокоразрешающей коннектомики. Однако эти методы страдают от низкой пропускной способности, длительного времени сбора, ограниченных полей зрения и высокой стоимости обработки данных иаппаратного обеспечения 18.

Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, мы разработали метод визуализации под названием Оптическая многослойная интерференционная томография (OMLIT), который предлагает недорогое и высокопроизводительное решение для неизбирательной, высококонтрастной, широкоугольной визуализации всех клеток на ультратонких срезах, достигая субмикронного разрешения на больших тканях. В то же время OMLIT по своей природе совместим с рабочими процессами SEM с серийным сечением: до высокоразрешающей электронной микроскопии OMLIT предоставляет структурную информацию на тех же участках, что позволяет точно ориентироваться по ROI и значительно снижает площадь и объём данных, необходимый для последующего EM-визуализации. OMLIT обладает уникальными преимуществами на уровне мезомасштабной визуализации и служит важным мостом, соединяющим нейронные структурные карты на различных пространственных масштабах. Его неразрушительная природа сохраняет потенциал для будущей интеграции с конкретными стратегиями маркировки, такими как использование осмий-устойчивых флуоресцентныхбелков 19 для подготовки образцов и визуализации. Этот метод позволяет мезомасштабно визуализировать выбранные области мозга, что позволяет быстро усваивать морфологию нейронов, их количество, распределение и плотность в этих областях. Он также облегчает количественную характеристику аксональных проекций и распределения дендритов между нейронами в разных областях мозга. Для конкретных областей, представляющих интерес в результатах визуализации, детали ультраструктуры in situ могут быть дополнительно изучены с помощью электронной микроскопии.

Принцип визуализации OMLIT был описан в работе ХаоФаня 20. Кратко, во время визуализации ультратонкий срез, покрытый слой, сборная лента, проводящая лента и пластина образуют многослойную тонкоплёночную структуру. Когда плоская волна взаимодействует с этой структурой, отражённые волны образуются на различных интерфейсах и перекрываются в пространстве обнаружения, что приводит к оптическим помехам из-за различий в отражательной способности, показателе преломления и поглощении между материалами. Программа моделирования на базе MATLAB, разработанная на основе этого принципа, демонстрировала разумное согласие с экспериментальными результатами.

Схему визуализации OMLIT можно разделить на два типа в зависимости от стратегии обработки ленты. Первая — это стратегия высокой отражательной способности, при которой металлы, такие как Cr, Cu, Al или Ag используются для покрытия поверхности ленты, что приводит к более высокой оптической интенсивности в цитоплазматических областях и заполненных смолой сосудистых люменах по сравнению с окружающими участками. Вторая — стратегия низкой отражательной способности, при которой используются непокрытые ленты Kapton, ленты D-50 или ПЭТ-ленты с покрытием CNT. В данном случае результат оптической визуализации противоположен первому: богатые смолой свободные от мембраны области (например, цитоплазма и сосудистый люмен) появляются с меньшей интенсивностью.

Мы систематически обобщаем и устанавливаем стандартизированные протоколы, адаптированные к двум различным стратегиям визуализации. Представленные здесь протоколы предлагают комплексные и детальные экспериментальные процедуры. Кроме того, обобщаются общие проблемы, встречающиеся в ходе экспериментов, вместе с предложенными решениями. Мы сосредоточены на представлении набора данных коры мышей, полученных с использованием стратегии низкой отражательной способности (805 × 857,5 × 11,66 мкм³), демонстрируя отличительные особенности и преимущества подхода OMLIT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями Университета науки и технологий Китая и соответствующими национальными нормативными актами. Подготовка образца для OMLIT проводится по тому же протоколу, что и в традиционной ЭМ, и конкретная процедура, которую мы использовали, была описана в другомместе 21. Кратко говоря, после анестезии мышей транскардиально последовательно перфузировали с помощью буфера натрия какодилата, искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) и, наконец, фиксатора, содержащего глутаральдегид и параформальдегид. Мозг был аккуратно удален, и примерно 1 × 1 × 1 мм³ блоков мозговой ткани были выделены на секции. Образцы затем химически фиксировали, подвергались серийному окрашиванию тяжёлыми металлами, обезвоживались и встраивались в смолу. Общий рабочий процесс протокола представлен на рисунке 1.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса. (A) Коллекционные ленты, упомянутые в протоколе (слева направо: полиимид, D-50 и PET с наноутом). (B) Серийное секционирование и сбор обрезанных образцов. (C) Крепление лент с собранными секциями на круглую кремниевую пластину. (D) Световая микроскопия, шкала 100 мкм. (E) Углеродное покрытие. (F) Электронная микроскопия соответствует области, описанной на рисунке 1D, шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой картины.

1. Подготовка ленты

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры следует выполнять в чистой комнате, чтобы предотвратить загрязнение лентой пылью.

  1. Стратегия высокой отражательной способности
    1. Выберите Kapton (далее — полиимидная лента, толщиной 50 мкм) или плёнку Panlite (далее D-50, толщиной 50 мкм) и установите её на моторизованную обмотку. Здесь в качестве примера приводится полиимидная лента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалось моторизованное устройство для обмотки, предназначенное для привода шаговым двигателем, управляемым платой Arduino, для передачи ленты от одной катушки к другой через плазменный конус распыления. Чтобы компенсировать растущую скорость передачи ленты, вызванную накоплением ленты на ведущей катушке, увеличивающей диаметр катушки, была написана программа для последовательного снижения угловой скорости катушки после каждого поворота на 360°.
    2. Нанесите равномерную тонкую пленку Cr (или другие металлы, такие как Al, Ag или Cu) на поверхность ленты с помощью системы распыления магнетрона (двойной распыляющий спуттер). Расположите ленту на расстоянии 80 мм от мишени для оптимального осаджения. Проводите процесс под питанием постоянного тока и при давлении 1,0 Па, регулируемом 99,99% аргоновым газом.
    3. Установите скорость намотки ленты на 0,6 мм/с, чтобы получить толщину металлического покрытия 50 нм. После осадки охлаждайте камеру медленно до комнатной температуры (RT) при высоком вакууме, чтобы минимизировать стресс от покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная толщина покрытия для одной и той же ленты может варьироваться в зависимости от типа используемого металла. Отрегулируйте скорость трансляции ленты, чтобы получить разные толщины покрытия, такие как 50, 70, 100, 150 и 200 нм.
    4. Оцените толщину и однородность покрытия с помощью профилера стилуса, атомно-силовой микроскопии или сканирующей электронной микроскопии.
    5. Очистите и сделайте ленту гидрофильной с помощью плазменного очистителя при мощности 80 Вт с скоростью перемещения ленты 7 мм/с. После обработки капли воды, нанесённые на поверхность ленты, должны быстро распространяться в тонкую пленку (рисунок 2A).
  2. Стратегия низкой отражательной способности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет использовать либо ленту D-50, либо коммерческую полиэтилентерефталатную (ПЭТ) с покрытием углеродистых нанотрубок (CNT). Поскольку последняя может создавать фоновой шум при электронной микроскопии — хотя и не сильная — она потенциально может повлиять на сегментацию электромагнитных изображений. Поэтому в следующем описании всё равно будет использована лента D-50 в качестве примера.
    1. Подготовьте плёнки D-50 и разрежьте весь лист на ленты шириной примерно 7 мм. Используйте одну открытую сторону ленты для сбора секций, а другую защиту слоем матовой пленки для предотвращения царапины и загрязнения. Удалите матовую плёнку во время последующего этапа монтажа кремниевой пластины.
    2. Для большего количества секций соединяйте разные секции ленты D-50. Закрепите соединения между сегментами ленты двусторонней клеевой лентой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приклеивании сегментов ленты убедитесь, что ведущая лента перекрывает заднюю сверху вниз через двустороннюю ленту. Минимизируйте область клея и оставьте край вдоль краёв ленты, чтобы предотвратить выдавливание клея при намотке, что может загрязнить ленту (рисунок 2B).
    3. Очистите и сделайте ленту гидрофильной с помощью плазменного очистителя, повторяя ту же процедуру и достигая того же эффекта, что и описано ранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением этапов нанесения металлического покрытия и углеродного распыления, остальные этапы обеих стратегий одинаковы.

2. Последовательное ультратонкое сечение и сбор на ленте

  1. Используя небольшую шлифовальную машину или аналогичный режущий инструмент, грубо обрезайте смолу с образцом, удаляя окружающую пустую смолу, чтобы открыть область образца.
  2. Поместите блок с вложенной смолой в держатель образца и затяните ручку держателя, чтобы надёжно закрепить блок.
  3. Закрепите держатель образца на подвижном рычаге микротома. Установите стеклянный нож или нож для обрезки алмазов (под углом 45°) на держатель ножа. Под микроскопом обрежьте поверхность образца в форму пирамиды и выровняйте поверхность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Передние и задние края обрезанного блока образца должны быть максимально параллельными (см. рисунок 2C).
  4. Обрежьте и сглаживайте четыре стороны блока образца, чтобы удалить излишки смолы по краям и предотвратить возможные столкновения с алмазным ножом. Поверните ручку, чтобы передние и задние края обрезанного блока были выровнены в горизонтальном положении.
  5. Снимите нож для обрезки и замените его алмазным ножом, установленным под углом 45°. Установить угол наклона основания микротома на 6°. Медленно двигайте держатель ножа с помощью ручки, пока передний край алмазного ножа не окажется на расстоянии 1-2 мм от поверхности образца.
  6. Наблюдайте яркую полосу между поверхностью образца и лезвием ножа и регулируйте угол наклона, чтобы полоса была равномерно сверху вниз и из стороны в сторону. Это помогает гарантировать, что первая секция охватывает всю поверхность образца, а не только угол.
  7. Введите дистиллированную воду в канавку алмазного ножа, чтобы уровень жидкости поднялся и убедитесь, что лезвие будет влажным. Затем используйте шприц, чтобы удалить часть воды, пока уровень жидкости не снизится, и отражение не станет серебристым.
  8. Задайте толщину сечения (подачу), скорость резки и окно резки в блоке управления. Отрегулируйте скорость сечения на 0,6 мм/с и укажите толщину сечения на 60 нм (удельная скорость и толщина зависят от качества образца).
  9. Начинайте секционирование. Когда микротом работает стабильно и получаются однородные срезы, процесс секционирования останавливается. Используйте тонкую щётку, чтобы удалить порезанные участки и мусор.
  10. Установите как катушку с покрытым покрытием, так и пустую катушку на автоматическую систему сбора ультратонких секций. Закрепите фиксирующий механизм и проведите пробный запуск, чтобы лента двигалась плавно с постоянной скоростью и правильно собрана на пустую катушку.
  11. Погрузите головку устройства для сбора ленты в водяную баню алмазного ножа. Отрегулируйте положение головки для сбора так, чтобы она была параллельна краю ножа, на расстоянии в 1,5 раза больше, чем длина среза образца, обеспечивая плавное сображение срезов на ленте. Обеспечьте безопасность устройства для сбора и возобновите разрез, одновременно запуская устройство для сбора ленты.
  12. После сбора достаточного количества непрерывных секций приостановите процесс секционирования. Перережьте ленту в той области, где не были собраны секции, и продолжайте использовать устройство для сбора ленты, пока вся оставшаяся лента не будет собрана на катушке.
  13. Снимите катушку с собранными секциями и поместите её в электронную сушильную печь. Очистите устройство для сбора ленты и микротом, а все аксессуары верните на свои места.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Подготовка перед секционированием. (A) Капли воды на поверхности ленты D-50 до (верха) и после (снизу) гидрофильной обработки. (B) Сверху и боковые схемы зоны соединения ленты D-50. Синий: лента D-50; оранжевый: двусторонний клей; Зелёная стрелка: направление движения ленты. (C) Фронтальный вид образца после обрезания, показывающий параллельные верхние и нижние края. (D) Автоматическое устройство для сбора ленты. a: Катушка ленты для подачи ленты D-50; b: Катушка ленты для извлечения ленты; Красная стрелка: направление движения ленты. (E) Положение головки сбора на автоматическом устройстве для сбора ленты. Жёлтый квадрат в правом нижнем углу указывает на свежевырезанный участок, который устройство собирается забрать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Крепление на силиконовую пластину

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рабочее пространство чистое, чтобы избежать загрязнения ленты пылью, выполняя следующие шаги.

  1. Используйте круглую кремниевую пластину диаметром 4 дюйма, предварительно очищенную и гидрофилизированную в системе плазменной обработки (при мощности 80 Вт, 3 минуты).
  2. Наденьте чистые перчатки, положите силиконовую пластину на ровную поверхность и отрежьте кусок двусторонней проводящей углеродной ленты нужной длины (с выступом 2-3 см с обоих концов). Снимите белый защитный слой с одной стороны двусторонней проводящей ленты и нанесите его сверху вниз на силиконовую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Две стороны проводящей ленты должны быть расположены примерно на расстоянии 2 мм друг от друга, а края ленты должны быть видны на кремниевой пластине. Для двусторонней проводящей ленты шириной 25 мм три сегмента ленты можно наклеить на одну кремниевую пластину диаметром 4 дюйма.
  3. Нарисуйте контур 4-дюймовой кремниевой пластины на верстаке и отметьте приблизительную длину каждого сегмента ленты, который будет наклеен на пластину. Перережьте ленту, которая собрала срезы, согласно ранее отмеченной длине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срезанная лента не должна превышать край кремниевой пластины и не врезаться в секции.
  4. Снимите прозрачную защитную пленку с двусторонней проводящей ленты, а для ленты D-50 снимите защитную пленку с обратной стороны ленты. Наклейте ленту параллельно двусторонней проводящей ленте. Наклейте до трёх сегментов ленты на каждый кусок двусторонней проводящей ленты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы снизить риск смещения или загрязнения ленты D-50 пылью, накройте часть проводящей ленты прозрачной пленкой, которая ранее была снята, оставив открытой лишь небольшую часть проводящей ленты для крепления конца ленты D-50. Это облегчает регулировку направления ленты. После этого медленно отслойте оставшуюся прозрачную пленку, чтобы остальная часть ленты D-50 мягко опустилась и прилипла к проводящей ленте.
  5. После установки ленты между лентой и проводящей лентой могут образовываться воздушные пузырьки, что может мешать процессу последующей визуализации. Поместите кремниевую пластину в вакуумную камеру (или другое вакуумное оборудование) и примените вакуум. После завершения вакуумного процесса убедитесь, что пузырьки воздуха исчезли.

4. Пост-окрашивание

  1. Приготовьте 4% уранилацетата и 3% свинцового цитрата, предварительно нагрейте их до 50°C в водяной бане.
    ВНИМАНИЕ: Уранилацетат радиоактивен и обладает значительной токсичностью для печени и почек. Цитрат свинца может вызывать отравление свинцом, поражая нервную систему, почки и гемопоэтическую систему. Работа с этими реагентами должна проводиться в вытяжке с дымом, а также носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, нитриловые перчатки, маску и защитные очки. В случае контакта кожи или глазами немедленно умойте с большим количеством воды, сообщите в лабораторный персонал безопасности и обратитесь за медицинской помощью.
  2. Поместите кремниевую пластину, которая была вакуумирована и свободна от пузырьков, в систему гидрофилизации плазмы для гидрофилизации и очистки.
  3. Используя шприц объемом 10 мл с удаленной иглой, подключите фильтр для шприца 0,22 мкм и отфильтруйте 4% уранилацетат. Капите раствор на секцию, пока вся поверхность секции на кремниевой пластине не будет покрыта, а затем подождите 3 минуты.
  4. Промыйте дистиллированной водой 3 минуты, повторяя 3 раза, затем сушите поверхность образца феном с помощью азота.
  5. Используя шприц на 10 мл с удаленной иглою, подключите фильтр для шприца 0,22 мкм и отфильтруйте 3% свинцовый цитрат. Опустите раствор на секцию, пока вся поверхность секции на кремниевой пластине не будет покрыта, а затем подождите 5 минут.
  6. Промыйте дистиллированной водой 3 минуты, повторяя 3 раза, затем сушите поверхность образца феном с помощью азота.

5. Сбор данных

  1. Оптическая микроскопия
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе используется исследовательский слайд-сканер (VS200, Olympus) в качестве примера для оптической микроскопии. Другие микроскопы, такие как Axio Imager.A2 Vario (Цейсс, Германия), также подходят для описанной здесь оптической визуализации. Шаги для других оптических микроскопов в целом одинаковы.
    1. Разместите кремниевую пластину на сцене оптического микроскопа и закрепите её клейкой лентой без остатков.
    2. Используйте объектив 5x, чтобы получить обзорное изображение кремниевой пластины, ленты и образца.
    3. На обзорном изображении обведите каждый участок и отсортируйте их, затем добавьте точки фокусировки и точки экспозиции для автоматического увеличения в 20 или 50 раз по всей кремниевой пластине во всех секциях.
    4. После завершения съёмки сохраняйте изображения и проверяйте качество изображения. Если есть размытые или низкокачественные изображения, перефокусируйте и пересфотографируйте.
  2. Электронная микроскопия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные типы электронных микроскопов могут выполнять непрерывную визуализацию ультратонких срезов, размещённых на кремниевых пластинах. Здесь в качестве примера приводится Multibeam 505 (Zeiss).
    1. Проведите углеродное покрытие поверхности образца с помощью высоковакуумного распылительного покрытия с толщиной углерода 5,7 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно пропустить для лент, покрытых металлическим покрытием в стратегии с высокой отражающей способностью или покрытыми углеродными нанотрубками (CNT) в стратегии низкой отражательной способности.
    2. Используйте оптический микроскоп (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) для захвата оптической навигационной карты кремниевой пластины.
    3. Поместить кремниевую пластину в камеру образца SEM. Связать оптическую навигационную карту с изображением электронного микроскопа, последовательно идентифицируя два вложенных L-образных маркера на стадии образца.
    4. Используйте модуль SAT в микроскопическом программном обеспечении (v3.2, 64-бит) для полуавтоматического определения позиций сечений и областей изображения с оптической навигационной карты.
    5. Установите размер пикселя изображения на 4 нм, время задержки на 0,8 мкс, точки и положения фокуса, а также места хранения.
    6. Начните непрерывную визуализацию.

6. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: 2D-сшивка OMLIT изображений выполняется автоматически программным обеспечением. Для крупномасштабной 3D-регистрации и сегментации OMLIT-изображений доступны другие, более мощные алгоритмы ИИ. Здесь, для удобства большинства лабораторий при верификации процесса, демонстрируются сшивки, регистрация и сегментация с использованием Fiji (v1.54p, 64-бит) и VAST (v1.5.0, 64-бит).

  1. Откройте набор данных изображений на Fiji, перетащив папку со всеми файлами изображений в интерфейс Fiji, и выберите Virtual Stack по запросу.
  2. Используйте инструмент Rectangle для выбора интересующего региона (ROI), затем обрежьте набор данных через Image > Crop.
  3. Выровняйте стек изображений с помощью плагина Register Virtual Stack Slices (Плагины > регистрация > Register Virtual Stack Slices).
  4. Сохраните выровнённый набор данных в формате TIFF (File > Save As > Tiff).
  5. Импортируйте стек изображений TIFF вVAST 22 с помощью Импорта > Импорта объема изображения из изображений в . Файл VSV.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробного учебного материала, пожалуйста, ознакомьтесь с сайтом: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
  6. Подключив внешний планшет, используйте инструмент кисти в режиме Draw Segment Mode для начала ручной сегментации и трассировки (используйте клавиши ярлыков A и Z для быстрой навигации между срезами изображения).
  7. Визуализируйте сегментированную структуру в 3D с помощью Window > 3D Viewer > View > Update.
  8. Сохраните результаты сегментации через File > Save Segmentation.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общий рабочий процесс протокола (рисунок 1) начинается с подготовки различных коллекционных лент. На рисунке 1 показаны три типа лент, упомянутых в протоколе (слева направо: Kapton, D-50 и PET с CNT-покрытым), которые обладают различными оптическими свойствами при размещении на одном фоне. После подготовки образца и обрезки блоков сначала следует собрать несколько срезов для электронной микроскопии, чтобы убедиться, что подготов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы разработали оптический подход к визуализации, названный OMLIT, который позволяет проводить мезоскопическую визуализацию и совместим с рабочими процессами серийной сканирующей электронной микроскопии на основе ленты. С помощью метода OMLIT оптическая микроскопия может быть использована для захвата мезоскопических структурных особенностей из образцов мозга, включая кровеносные сосуды, клеточные тела, ядра, основные дендритные ветви и некоторые крупные миелинизированные аксони. Кро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликтов интересов не было объявлено.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (32271430, 62361166631) и Министерством науки и технологий Китая (2023YFF0715904). Мы благодарим Государственный технический центр Сучжоуского института биомедицинской инженерии и технологий, а также Центр визуализации мозга Института искусственного интеллекта, Всекомплексный национальный научный центр Хэфэй, за поддержку в области OMLIT и серийной ЭМ-визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Клейкая лента3MB5005094008Двусторонний клей
Атомно-силовой микроскопBrukerИконка измерения
Автоматическая система сбора ультратонких секций и nbsp;ЛехуаAutoCUTS II
Проводящая клейкая лентаТед ПеллаFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Алмазный нож для секционированияДиатомаDUJ3530Джамбо-нож Диатоме
Алмазный нож для обрезкиДиатомаDTB90Стеклянный нож
Электронный микроскопZeissMultiSEM505Альтернатива: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-бит) Открытый исходный кодhttps://fiji.sc
Нож для обрезания стеклаSelfmade
Свинцовый цитратLeicaT534/2
Световой микроскопOlympus VS200Альтернатива: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Световой микроскоп и bbsp;Zeiss  Axio Imager.A2 Vario
Очиститель плазмыYidon TechnologiesHydro-S4Альтернативы: Ted Pella Pelco или другой настольный очиститель плазмы
Полимерная лентаМелтонКаптонСайт компании больше недоступен. Мы рекомендуем исследователям попробовать местные ленты KAPTON.
Полимерная лентаТэйдзинPEThttps://www.teijin.com/
Полимерная лентаТэйдзинD-50https://www.teijin.com/
Кремниевая пластинаСайити912303Пластина отполирована с одной стороны.
Sputter Coater LeicaACE600Альтернатива: Double-head Sputter, Yujie
УльтрамикротомLeicaUC7Альтернатива: RMC PT-PC
УранилацетатEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-битный)Медицинский институт Говарда Хьюзаhttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite — это бесплатный инструмент для ручного аннотирования и сегментации больших наборов данных 3D-микроскопии.
Программное обеспечение ZEN (v3.2, 64-бит)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  3. Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
  4. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  5. Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
  6. Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
  7. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Opt Lett. 45 (19), 5401(2020).
  8. Kut, C., et al. Detection of human brain cancer infiltration ex vivo and in vivo using quantitative optical coherence tomography. Sci Transl Med. 7 (292), (2015).
  9. Hu, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging (QPI) in neuroscience. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 25 (1), 1-9 (2019).
  10. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).
  11. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  12. Heymann, E. W. Scent marking strategies of new world primates. Am J Primatol. 68 (6), 650-661 (2006).
  13. Echlin, M. P., et al. Recent developments in femtosecond laser-enabled TriBeam systems. JOM. 73 (12), 4258-4269 (2021).
  14. Randolph, S., Geurts, R., Wang, J., Winiarski, B., Rue, C. Femtosecond laser-enabled TriBeam as a platform for analysis of thermally- and charge-sensitive materials. Microsc Microanal. 25 (S2), 352-353 (2019).
  15. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  16. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: A multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  17. Schalek, R., et al. Development of high-throughput, high-resolution 3D reconstruction of large-volume biological tissue using automated tape collection ultramicrotomy and scanning electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (S2), 966-967 (2011).
  18. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  19. Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  20. Fan, H., et al. Optical multilayer interference tomography compatible with tape-based serial SEM for mesoscale neuroanatomy. ACS Photonics. 9 (1), 25-33 (2022).
  21. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nat Commun. 6 (1), 7923(2015).
  22. Berger, D. R., Seung, H. S., Lichtman, J. W. VAST (volume annotation and segmentation tool): Efficient manual and semi-automatic labeling of large 3D image stacks. Front Neural Circuits. 12, 88(2018).
  23. Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Syst Tech J. 27 (3), 379-423 (1948).
  24. Tsai, D. -Y., Lee, Y., Matsuyama, E. Information entropy measure for evaluation of image quality. J Digit Imaging. 21 (3), 338-347 (2008).
  25. Wang, T., et al. A convenient all-cell optical imaging method compatible with serial SEM for brain mapping. Brain Sci. 13 (5), 711(2023).
  26. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  27. Kislinger, G., et al. ATUM-Tomo: A multi-scale approach to cellular ultrastructure by combined volume scanning electron microscopy and electron tomography. eLife. 13, e90565(2024).
  28. Böhm, T., Felfer, P., Thiele, S. A modular and automated serial section collection system for ultramicrotomy and subsequent imaging. Microsc Microanal. 29 (1), 212-218 (2023).
  29. Wacker, I. U., et al. Multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes. J Vis Exp. (133), e57059(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical Multilayer Interference TomographyScanning Electron MicroscopyBrain Atlas MappingConnectomics ImagingAutomated Tape UltramicrotomyMesoscopic Brain MappingElectron Microscopy ImagingMouse Cerebral CortexManual SegmentationThree Dimensional Visualization

Related Articles