Method Article

Обнаружение Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii с помощью ПЦР-флуоресцентного зонда

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем клинический протокол тестирования, основанный на методе ПЦР-флуоресцентного зонда, для одновременного обнаружения видов Aspergillus , Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает стандартизированную процедуру качественного обнаружения видов Aspergillus , Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii в клинических образцах мокроты с использованием набора для обнаружения нуклеиновых кислот на основе ПЦР-флуоресцентного зонда. Процедура включает клинический сбор образцов, предварительную обработку щелочной жидкостью, автоматическую экстракцию нуклеиновых кислот и мультиплексное обнаружение ПЦР в реальном времени. Aspergillus spp., C. neoformans и P. jirovecii обнаруживают с помощью целенаправленных флуоресцентных зондов (каналы FAM, VIC и CY5 соответственно), с интегрированным внутренним контролем (ROX-канал) для обеспечения качества. Валидность анализа и интерпретация результатов выборки основаны на заданных значениях порога цикла (Ct). Положительный регулятор должен демонстрировать S-образные кривые усиления с Ct ≤ 33.7 во всех каналах, тогда как отрицательный регулятор не должен показывать усиления. Для клинических образцов значение Ct ≤ 33,7 в канале FAM указывает на положительную результативность для Aspergillus spp., а значение Ct ≤ 36 в канале VIC или CY5 указывает на положительную положительность для C. neoformans или P. jirovecii соответственно.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инвазивные грибковые инфекции, такие как вызванные Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii, представляют значительную угрозу для иммунокомпрометированных пациентов, приводя к высокой заболеваемости и смертности. Своевременная и точная диагностика критически важна для начала подходящей противогрибковой терапии и улучшения клиническихрезультатов 1. Традиционные методы диагностики, включая посев, микроскопию и обнаружение антигенов, имеют заметные ограничения. Культура занимает много времени и демонстрирует низкую чувствительность, микроскопия не определяет на ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование клинических образцов было одобрено соответствующим этическим комитетом (Номер одобрения: ZYS-GCP-2025006). Все участники дали широкое информированное согласие на использование своих данных и образцов в исследованиях. Все реагенты и расходники, используемые в этом протоколе, перечислены в разделеT of Materials.

1. Сбор образцов

  1. Соберите 3–5 мл мокроты или бронхоальвеолярной жидкости для промывания в стерильные контейнеры и немедленно сдайте на тестирование.

2. Подготовка реагентов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные кривые амплификации, полученные с помощью этого мультиплексного ПЦР-анализа флуоресцентного зонда, показаны на рисунках 1 и 2. Валидность анализа определялась на основе заранее определённых критериев контроля. В допустимом запуске положительный контроль создавал характерные S-образные кривые усиления в каналах FAM, VIC, CY5 и ROX, при этом значения порога цикла (Ct) ≤ 33,7 во всех каналах обнаружения (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексный протокол ПЦР в реальном времени, установленный в этом исследовании, обеспечивает стандартизированную процедуру для одновременного и быстрого обнаружения трёх ключевых инвазивных грибковых патогенов (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii) в клинических образцах мокроты. Этот метод позволяет напрямую обнаруживать ДНК патогена из клинических образцов. В отличие от традиционных диагностических методов, таких как культура, микроскопия или серологиче.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить отдел клинической лаборатории Народной больницы района Шаньшуй в Фошане за предоставленное оборудование и техническую поддержку.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ Стерильные удлинённые пипетные наконечники с L-фильтром (в стойках)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 & mu; Кончики стерильных пипеток LЦзянсу Синкан Медицинская Инструментальная Компания241101
200 и мю; L Extended Filter Стерильные наконечники пипеткиXiaorui Biotechnology241001
Лизисные трубкиПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoF1040
Набор для обнаружения нуклеиновых кислот для Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jiroveciiПекинский ZC Бионаука и Наука Technology Co.CT8143-48T
Реагент для экстракции нуклеиновых кислотПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoCN8053-B40T
Буфер разбавления образцаПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles