Method Article

Обнаружение Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii с помощью ПЦР-флуоресцентного зонда

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем клинический протокол тестирования, основанный на методе ПЦР-флуоресцентного зонда, для одновременного обнаружения видов Aspergillus , Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает стандартизированную процедуру качественного обнаружения видов Aspergillus , Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii в клинических образцах мокроты с использованием набора для обнаружения нуклеиновых кислот на основе ПЦР-флуоресцентного зонда. Процедура включает клинический сбор образцов, предварительную обработку щелочной жидкостью, автоматическую экстракцию нуклеиновых кислот и мультиплексное обнаружение ПЦР в реальном времени. Aspergillus spp., C. neoformans и P. jirovecii обнаруживают с помощью целенаправленных флуоресцентных зондов (каналы FAM, VIC и CY5 соответственно), с интегрированным внутренним контролем (ROX-канал) для обеспечения качества. Валидность анализа и интерпретация результатов выборки основаны на заданных значениях порога цикла (Ct). Положительный регулятор должен демонстрировать S-образные кривые усиления с Ct ≤ 33.7 во всех каналах, тогда как отрицательный регулятор не должен показывать усиления. Для клинических образцов значение Ct ≤ 33,7 в канале FAM указывает на положительную результативность для Aspergillus spp., а значение Ct ≤ 36 в канале VIC или CY5 указывает на положительную положительность для C. neoformans или P. jirovecii соответственно.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инвазивные грибковые инфекции, такие как вызванные Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii, представляют значительную угрозу для иммунокомпрометированных пациентов, приводя к высокой заболеваемости и смертности. Своевременная и точная диагностика критически важна для начала подходящей противогрибковой терапии и улучшения клиническихрезультатов 1. Традиционные методы диагностики, включая посев, микроскопию и обнаружение антигенов, имеют заметные ограничения. Культура занимает много времени и демонстрирует низкую чувствительность, микроскопия не определяет на уровне вида и зависит от оператора, тогда как антигенные анализы (например, галактоманнан β-D-глюкан) могут показывать перекрёстную реакцию и непоследовательную эффективность. Молекулярная диагностика, особенно ПЦР в реальном времени, может устранить некоторые из этих пробелов, обеспечивая более быстрые сроки обработки и потенциал высокой чувствительности и специфичности. Достижения в мультиплексной ПЦР позволяют одновременно обнаруживать несколько патогенов из одного образца, повышая диагностическую эффективность.

Этот протокол описывает мультиплексный флуоресцентный зондовый ПЦР-тест для качественного обнаружения ДНК от Aspergillus spp., C. neoformans и P. jirovecii в образцах человеческой мокроты путём нацеливания на консервативные участки гена 18S рРНК (Aspergillus spp.), гена ITS (C. neoformans) и мтLSU рРНК (P. jirovecii). Ключевые особенности этого метода включают определённую аналитическую чувствительность: предел обнаружения для видов Aspergillus, C. neoformans и P. jirovecii составляет 1500 копий/мл; Специфичность праймера/зонда: специфические праймеры и зонды минимизируют перекрёстную реакцию с человеческой ДНК или другой распространённой флорой; надёжный контроль загрязнения: внедрение систем dUTP-UDG (урацил-ДНК-гликозилаза) эффективно предотвращает перенесённое загрязнение предыдущими ПЦР-ампликонами, что является критически важной функцией для поддержания надёжности анализов в клиническихлабораторных условиях 2; интегрированный контроль процессов: эндогенный внутренний контроль, направленный на ген RP (рибосомного белка) человека, маркированный фторофором ROX, коамплифицируется для мониторинга целостности экстракции нуклеиновых кислот и выявления потенциального ингибирования ПЦР, тем самым снижая ложноотрицательные результаты3. Этот подход поддерживается установленными рекомендациями по обеспечению качества в молекулярнойдиагностике 4,5. Протокол в первую очередь применяется к респираторным образцам (мокрота/BALF) из групп высокого риска, таких как пациенты с гематологической онкологией или реципиенты трансплантации. Также обсуждаются возможные ограничения, включая ложноположительные результаты из-за загрязнения окружающей среды или снижение чувствительности из-за чрезмерного разбавления образцов, а также стратегии их снижения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование клинических образцов было одобрено соответствующим этическим комитетом (Номер одобрения: ZYS-GCP-2025006). Все участники дали широкое информированное согласие на использование своих данных и образцов в исследованиях. Все реагенты и расходники, используемые в этом протоколе, перечислены в разделеT of Materials.

1. Сбор образцов

  1. Соберите 3–5 мл мокроты или бронхоальвеолярной жидкости для промывания в стерильные контейнеры и немедленно сдайте на тестирование.

2. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы выполнялись в комнате подготовки реагентов.

  1. Вынимите комплект для обнаружения из морозильника при -28 °C и полностью разморозите при комнатной температуре (25–30 °C) в течение 30 минут.
  2. Вычислите общее количество реакций (N): N = количество пробных образцов (n) + положительные/отрицательные контрольные (2) + 1
  3. Приготовьте реакционную смесь в стерильной микроцентрифужной трубке. Для одной реакции: 35 мкл смеси амплификации нуклеиновых кислот + 5 мкл смеси грунтовки и зонда, тщательно провращённое вихрь и кратковременное центрифуга.
  4. Аликвот 40 мкл реакционной смеси помещается в каждую ПЦР-пробирку (согласно протоколу производителя набора) и передаёт в проходное окно в комнате для обработки образцов.

3. Обработка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы были выполнены в комнате обработки образцов. Утилизация отходов: Выбросить супернатант из шага 3.2.2 и другие жидкие отходы, содержащие NaOH, в специальный контейнер для химических отходов.

  1. Ликвефракция
    1. Добавьте мокроту/бронхоальвеолярную жидкость для промывания жидкости (BALF) в трубку с винтовой крышкой объемом 50 мл.
    2. Добавьте 1–2 объёма раствора расщепления 4% NaOH (относительно вязкости мокроты).
      ВНИМАНИЕ: NaOH — коррозийный. Избегайте контакта с кожей и глазами.
    3. Затяните крышку, создайте вихрь на 1 минуту и инкубуйте в шкафу для биобезопасности при комнатной температуре 15–20 минут.
  2. Обогащение
    1. Центрифуга сжижала образцы со скоростью 3000 об/мин в течение 5 минут.
    2. Сбросьте наднажённый материал с помощью пипетки, удерживая 1000 мкл осадка.
    3. Тщательно завихрьте осадок.
  3. Лизис
    1. Перенесите 500 мкл осадка в лизисную трубку. Вихрь на 10 минут и кратковременная центрифуга.
  4. Извлечение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизация отходов: Использованные экстракционные пластины, наконечники и пробирки, контактировавшие с биологическими образцами, должны быть выброшены в утверждённый контейнер для биологических отходов.
    1. Перенесите весь лизатный супернатант и 100 мкл отрицательных/положительных контролей в колонку 2 пластины экстракции.
    2. Провести экстракцию нуклеиновых кислот с помощью автоматизированной системы экстракции нуклеиновых кислот с назначеннойпрограммой 6.
  5. Загрузка выборок
    1. Пересадите 10 мкл экстракционной нуклеиновой кислоты (столбец 6) и контроля в ПЦР-пробирки. Кратковременно центрифугировать и перенести в проходное окно комнаты усиления.

4. Амплификация нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги были выполнены в комнате усиления.

  1. Загрузите ПЦР-трубки в автоматический прибор нуклеинового усиления и выберите подходящий шаблон усиления.
  2. Назначить каналы обнаружения: Aspergillus spp.: FAM-канал; C. neoformans: канал VIC; P. jirovecii: канал CY5; Внутренний контроль: каналROX 7,8,9.
  3. Задайте примерные имена и запустите программу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные кривые амплификации, полученные с помощью этого мультиплексного ПЦР-анализа флуоресцентного зонда, показаны на рисунках 1 и 2. Валидность анализа определялась на основе заранее определённых критериев контроля. В допустимом запуске положительный контроль создавал характерные S-образные кривые усиления в каналах FAM, VIC, CY5 и ROX, при этом значения порога цикла (Ct) ≤ 33,7 во всех каналах обнаружения (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексный протокол ПЦР в реальном времени, установленный в этом исследовании, обеспечивает стандартизированную процедуру для одновременного и быстрого обнаружения трёх ключевых инвазивных грибковых патогенов (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jirovecii) в клинических образцах мокроты. Этот метод позволяет напрямую обнаруживать ДНК патогена из клинических образцов. В отличие от традиционных диагностических методов, таких как культура, микроскопия или серологиче...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить отдел клинической лаборатории Народной больницы района Шаньшуй в Фошане за предоставленное оборудование и техническую поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ Стерильные удлинённые пипетные наконечники с L-фильтром (в стойках)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 & mu; Кончики стерильных пипеток LЦзянсу Синкан Медицинская Инструментальная Компания241101
200 и мю; L Extended Filter Стерильные наконечники пипеткиXiaorui Biotechnology241001
Лизисные трубкиПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoF1040
Набор для обнаружения нуклеиновых кислот для Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans и Pneumocystis jiroveciiПекинский ZC Бионаука и Наука Technology Co.CT8143-48T
Реагент для экстракции нуклеиновых кислотПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoCN8053-B40T
Буфер разбавления образцаПекинский ZC Бионаука и Наука Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles