Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка свиных глаз к конфокальной отражательной микроскопии для визуализации сети коллагеновых волокон стекловидного тела

648 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68823

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод визуализирует нативную структуру коллагеновых волокон в стекловидном теле с помощью конфокальной отражательной микроскопии.

Аннотация

Стекловидное тело представляет собой прозрачный гель, который заполняет пространство между хрусталиком и сетчаткой. Его структура поддерживается сетью коллагеновых волокон, что, вероятно, влияет на вязкоупругие свойства и способствует заболеванию сетчатки. Тем не менее, организация этой коллагеновой сети остается плохо описанной, поскольку визуализация стекловидного тела в его естественном состоянии является сложной задачей. Многие методы визуализации, применяемые к стекловидному телу, вызывают обезвоживание и деформацию, а методы на основе красителей могут привести к появлению артефактов или неспецифической маркировки, что затрудняет изучение коллагеновой сети. В этом протоколе мы описываем: 1) метод вскрытия глаз свиньи для визуализации; 2) стратегия установки глаз на инвертированный микроскоп; 3) рекомендации по визуализации коллагеновой сети стекловидного тела в ее нативном состоянии с помощью конфокальной отражательной микроскопии; и 4) инструкции по количественному анализу изображений объектов сети. Выделяем распространенные подводные камни и акцентируем внимание на ключевых технических моментах. Мы сообщаем о применении конфокальной отражательной микроскопии к стекловидному телу. По сравнению с предыдущими стратегиями визуализации стекловидного тела, этот подход сохраняет нативную структуру, ориентацию и распределение коллагеновых волокон стекловидного тела без экзогенных красителей или артефактов обезвоживания. Конфокальная отражательная микроскопия может исследовать структурную основу жесткости стекловидного геля в норме и при заболеваниях.

Введение

Стекловидное тело — это внеклеточный матрикс между хрусталиком и сетчаткой глаза. Тракция из стекловидного тела на сетчатке играет важную роль в потере зрения при таких заболеваниях, как отслоение сетчатки, макулярное отверстие и витреомакулярное вытяжение 1,2,3,4. Способность стекловидного тела передавать тяговые силы сетчатке определяется его жесткостью геля, которая в свою очередь зависит от свойств его основных компонентов, коллагена и гиалуроновой кислоты5. Жесткость геля стекловидного тела, вероятно, зависит от особенностей сети коллагеновых волокон, поскольку жесткость искусственных коллагеновых гелей обусловлена такими характеристиками сети, как плотность, выравнивание и ширина волокон6.

Сеть коллагеновых волокон стекловидного тела трудно визуализируется из-за высокого содержания воды инизкой концентрации коллагена7, что приводит к артефактным искажениям при обработке для микроскопии или просвечивающей электронной микроскопии. Традиционная гистология и просвечивающая электронная микроскопия требуют обработки для упрочнения стекловидного тела для тонкого среза. Обезвоживание, необходимое для гистологического встраивания, приводит к тому, что волокна стекловидного тела агрегируются в сотовую конфигурацию8, а образование кристаллов льда во время замораживания увеличивает размер пор во внеклеточном матриксе9. Пластиковое встраивание8 и быстрое замораживание10 были применены к стекловидному телу для минимизации артефактов, хотя, вероятно, некоторые остаточные артефакты, вероятно, остаются. Фазово-контрастная микроскопия – это метод, который не требует секционирования и был применен к стекловидному телу, но требует удаления небольшого кусочка стекловидного тела из глаза, тем самым теряя первоначальное положение и ориентацию сети11. Совсем недавно количественная поляризационная световая микроскопия была использована для отображения средней ориентации волокон на сильно разрезанном свином глазу, но отдельные волокна не моглибыть разобщены. Кроме того, подходы к мечению на основе красителей (например, трипановый синий, красный пикрозиус, 5-(4,6-дихлортриазинил) аминофлуоресцеин) могут приводить к артефактам или неспецифическому мечению, и поэтому их избегают для сохранения нативной коллагеновой сети.

Мы применили метод пробоподготовки, используемый Filas et al. для исследования в микроскопии поляризованного света, т.е. грубую диссекцию в агарозном блоке12, и визуализировали образец с помощью конфокальной отражательной микроскопии, которая ранее не применялась к стекловидному телу. Используя этот метод, мы получили изображения сети коллагеновых волокон стекловидного тела в гидратированном, близком к физиологическому состоянии. Это дает ряд преимуществ по сравнению с предыдущими методами, включая уменьшение артефактов по сравнению с подходами, основанными на замораживании-разрушении или обезвоживании10,13. Для этого протокола требуется инвертированный конфокальный микроскоп с иммерсионным объективом не менее 30-кратного увеличения, числовой апертурой более 0,9 и рабочим расстоянием более 200 мкм. Мы прилагаем ключевые рекомендации по подготовке образцов и получению изображений, чтобы обеспечить четкое разрешение волокон. Поддерживая почти нативное состояние коллагенового матрикса стекловидного тела, этот подход позволяет исследователям количественно анализировать ориентацию, плотность и пространственное распределение волокон — параметры, которые, вероятно, имеют решающее значение для понимания жесткости стекловидного тела и ее патологических изменений. Этот метод особенно подходит для исследователей, интересующихся сетью коллагена стекловидного тела, ее структурой и патогенезом витреоретинальных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Препарирование тканей и диссекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Данное исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями. В нашем учреждении не требовалось одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию для проведения экспериментов на глазах свиней ex vivo .

  1. Получите ex vivo свиные глаза с мясоперерабатывающего завода. Используйте глаза в течение 48 часов после смерти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя внешний вид стекловидного тела не меняется с увеличением посмертного времени, сетчатка и сосудистая оболочка деградируют, что приводит к рассеиванию клеточного и пигментированного мусора во время диссекции. Этот мусор может мешать визуализации и анализу волокон.
  2. Удалите лишнюю мышечную и соединительную ткань из глазного яблока.
  3. Поместите пьедестал с тремя зубцами на основание формы для кубиков, например, очень большой формы для кубиков силиконового льда (Рисунок 1A и Рисунок 2).
  4. Поместите глобус на пьедестал с тремя зубцами, расположив его так, чтобы лимб опирался на зубцы.
  5. Приготовьте 3% агарозный гель, добавив 3 г агарозы общего назначения в 100 мл дистиллированной воды, а затем нагрейте раствор до его растворения. Когда раствор остынет примерно до 37 °C, вылейте его в форму, пока глаз не погрузится в агарозу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом глаз будет встроен в агарозный гель, чтобы стабилизировать глаз для вскрытия.
  6. Охладите кубик агарозы не менее 4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это увеличивает адгезию геля к глазу и гарантирует, что глаз останется неподвижным во время диссекции.
  7. После охлаждения выньте кубик агарозы из формы. Затем снимите постамент с куба (рисунок 1B).
  8. Соберите трехстороннюю раму тех же размеров, что и агарозный куб, используя комбинацию кубиков, тарелок и плиток Lego размером 1 x 8 (рис. 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это закрепит куб на месте и обеспечит направляющую для лезвия во время препарирования. Высота рамы Lego определит место, где будет разрезан глаз. Это можно визуализировать с помощью полупрозрачного агарозного геля.
  9. Поместите остывший кубик агарозы в рамку Лего. Держите высокопрофильное лезвие микротома за тупые края и выровняйте лезвие с верхней частью рамы Lego. Слегка надавите вниз на верхнюю часть куба и осторожно проведите лезвием микротома вперед и назад по всему кубу и встроенному глазу (Рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это создаст участок ткани глаза, который будет встроен в агарозу, который будет называться «глазным колпачком».

2. Монтажный образец для визуализации

  1. С помощью лезвия микротома обрежьте примерно 1 мм агарозы со всей поверхности среза кубика (рисунок 4А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом останется небольшой участок глазного колпачка, выступающий над поверхностью разреза агарозного куба
  2. Используйте тканевую салфетку или небольшую треугольную целлюлозную губку, чтобы высушить поверхность среза агарозного кубика, особенно возле границы глазного колпачка.
  3. Добавьте примерно одну чайную ложку универсального силиконового герметика в небольшой пластиковый пакет для бутербродов и прорежьте отверстие диаметром 3 мм в одном из нижних углов пакета, чтобы создать кондитерский мешок для герметика.
  4. С помощью кондитерского мешка нанесите тонкую бусину герметика на поверхность разреза агарозного кубика, прямо по краю глазного колпачка, создав водонепроницаемую границу вокруг образца (рисунок 4В). Это предотвратит вытекание стекловидного геля из глазного колпачка.
  5. Наденьте на крышку проушину большое покровное стекло и прижмите так, чтобы поверхность разреза наглазника соприкасалась с покровным стеклом без попадания воздуха или жидкости (Рисунок 4C). Убедитесь, что силиконовый шарик обеспечивает непрерывное уплотнение с помощью покровного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если силиконовый герметик не образует сплошного уплотнения, стекловидная жидкость может вытекать и пропускать воздух внутрь образца. Воздействие воздуха приведет к тому, что стекловидное тело сморщится, в результате чего волокна станут более яркими и плотными, а также появится жидкая область без волокон. Если стекловидное тело не соприкасается с покровным стеклом, его будет трудно визуализировать.
  6. Держа в руках агарозный куб, переверните образец и поместите его на большой адаптер покровного стекла для получения изображений на перевернутом микроскопе (Рисунок 4D и Рисунок 5).

3. Получение изображения

  1. Используйте инвертированный конфокальный микроскоп, который не является вращающимся диском. Используйте водяной объектив (с водой или глазным лубрикантом в качестве муфты) или масляный объектив с числовой апертурой не менее 0,90, увеличением от 30x до 60x и рабочим расстоянием не менее 200 мкм.
  2. Отрегулируйте параметры пути света для конфокального микроскопа, чтобы получить изображения отражательной способности. Вместо дихроичного зеркала, используемого для перенаправления возбуждающего света и пропускания излучаемого света для флуоресцентной визуализации, убедитесь, что имеется зеркало с расщеплением луча, которое перенаправляет часть освещающего лазера и пропускает часть отраженного света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал отражения от коллагеновых волокон стекловидного тела несколько слабый, поэтому фоновый шум может повлиять на способность визуализировать волокна. Улучшенное соотношение сигнал/шум наблюдалось при длине волны 473 нм, но мы смогли визуализировать коллагеновые волокна стекловидного тела с длиной волны от 405 нм до 635 нм.
  3. Установите длину волны обнаружения, включив в нее длину волны осветительного лазера.
  4. Чтобы сориентировать положение Z в образце, уменьшите мощность лазера до минимально возможного значения и определите вспышку отраженного света от покровного стекла. Это произойдет внизу и в верхней части покровного стекла (Рисунок 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рядом с покровным стеклом на заднем плане виден значительный отражающий сигнал. По мере удаления от покровного стекла сигнал от отраженного света от коллагеновых волокон уменьшается.
  5. Отрегулируйте положение по оси z так, чтобы оно располагалось над верхней частью покровного стекла и внутри образца.
  6. Увеличьте мощность лазера до уровня, превышающего уровень, обычно используемый для флуоресцентного применения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует артефакт отражающего кольца, который будет находиться в центре поля изображения. Сочетание увеличения и децентрирования поля изображения может помочь исключить этот артефакт (рисунок 7).
  7. Используйте усреднение линий и увеличьте время задержки пикселей в настройках получения изображений, которые являются стандартными методами увеличения отношения сигнал/шум в конфокальных микроскопах.

4. Анализ изображения ширины волокна с помощью CT-FIRE 14

  1. Установите CT Fire, следуя инструкциям на этом веб-сайте: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались версии "CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b" и среда выполнения MATLAB "MCR-2018b-win64". Оба должны быть загружены для работы программного обеспечения.
  2. Преобразуйте изображения в 8-битный tif и откройте 8-битные изображения tif в CT-FIRE.
  3. Убедитесь, что программное обеспечение настроено на CT-Fire в правом верхнем углу, а затем выберите «Выполнить».
  4. CT-FIRE автоматически загрузит результаты анализа в папку с именем «ctfireout», расположенную в той же папке, что и исходное изображение. Проверьте качество извлечения, сравнив файл, начинающийся с имени «OL_ctFIRE», с исходным изображением. Чтобы следовать этому протоколу, используйте следующие стандартные настройки для сегментации изображений (т. е. идентификации волокон): thresh_im2: 5; s_xlinkbox: 8; thresh_ext: 70; thresh_dang_L: 15; thresh_short_L: 15; s_fiberdir: 4; thresh_linkd: 15; thresh_linka: -150; thresh_flen:15
    1. Если волокна не определены точно, отрегулируйте параметры, нажав кнопку «Обновить » в разделе параметров в правом верхнем углу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство по настройке параметров можно найти на странице 20 в разделе «3 примечания» руководства CT-FIRE, которое находится в папке приложения CTFIRE. Дополнительные советы можно найти в статье Liu et al. в разделе 3.5.215.
  5. При необходимости отрегулируйте параметры вывода, чтобы ограничить количество волокон, которые появляются на выходных изображениях. Чтобы следовать этому протоколу, используйте следующие настройки по умолчанию: Минимальная длина волокна [пикселей]: 30; Разрешение изображения [dpi]: 300; Ширина волоконной линии [0-2]: 0,5; Максимальная ширина волокна [пикселей]: 15
  6. Чтобы преобразовать единицы ширины из пикселя в μм, откройте исходное изображение на Фиджи. Используйте размеры изображения, отображаемые как в пикселях, так и в μм в верхнем левом углу окна дисплея, чтобы рассчитать соотношение.

5. Анализ изображений плотности, кривизны, выравнивания, лакунарности, единицы роста гиф и фрактальной размерности волокон с помощью TWOMBLI16

  1. Загрузите TWOMBLI с https://github.com/wershofe/TWOMBLI.
  2. Следуйте инструкциям в файле: TwombliDocumentation в разделе "Установка и зависимости".
  3. Откройте папку TWOMBLI_v1/programs и замените AnamorfProperties.xml файл на файл AnamorfPropertiesEH.xml (Supplemental File 1).
  4. В папке TWOMBLI_v1/programs замените файл Twombli_v1.ijm на файл Twombli_v2.ijm (Supplemental File 2).
  5. Создайте папку с пустыми папками под названием "test HDM", "test masks", "HDM" и "masks".
  6. Конвертируйте изображения в 8-битный tif.
  7. Поместите 3-5 изображений в папку "test set input".
  8. Поместите все изображения для анализа в одну папку без подпапок под названием «приемлемые».
  9. На Фиджи нажмите Плагины | Макросы | Бег | выберите Twombli_v2.ijm в twombli/Programs.
  10. Следуйте инструкциям, чтобы запустить TWOMBLI. Чтобы следовать этому протоколу, используйте следующие параметры: Контрастная насыщенность, 0,35; минимальная ширина линии, 3; максимальная ширина линии, 3; Окно минимальной кривизны, 40; окно максимальной кривизны, 40; минимальная длина ветви, 10; максимальный дисплей HDM, 100; Минимальный диаметр зазора, 0
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется настроить параметры изображений. Программное обеспечение проведет пользователя через выбор параметров, а дополнительные инструкции можно найти в файле TwombliDocumentation.docx, который шел в комплекте с программой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

По одному глазу каждой из трех молодых взрослых свиней (4-месячной самки, 5-месячного самца и 6-месячной самки) был сфотографирован после разрезания глаза в осевой плоскости через нижний лимб. Шесть точек съемки были получены в плоскости сечения X-Y, расположенных на расстоянии 4 мм друг от друга. В каждом месте съемки была получена непрерывная сетка 4 x 4 из изображений размером 70 мкм x 70 мкм (рис. 8). Для каждой свиньи каждое изображение анализировалось отдельно по нескольким параметрам ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие методы визуализации стекловидного тела показали артефактную агрегацию волокон13, потерю организации, ориентации и местоположения волокон17 или полагались на гораздо более высокое разрешение с меньшим полем зрения, что ограничивало понимание распределения волокон10. Конфокальная отражательная микроскопия ex vivo, грубо срезанной свежей ткани позволяет получить изображения коллагеновых волокон стекловидного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы не сообщают о соответствующих конфликтах интересов.

Благодарности

Основной грант Национальных институтов здравоохранения EY014800; Неограниченный грант от организации «Исследования по предотвращению слепоты», Нью-Йорк, Департамент офтальмологии и визуальных наук, Университет штата Юта; NIH NEI K08 EY034549; Фонд первичной детской больницы; Фонд Матильды Зиглер; Мы благодарим докторов Гийома Л. Оаро и М. Остина Джонсона за свиные глаза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агароза IVWR0710-500G
Универсальный силиконовый герметик 1, прозрачныйGE2795576
Целлюлозная губка (Weck-Cel Eye Spear)Бобр — Visitec000865
Кастомный трёхконтактный пьедестал  NANA
Кастомный адаптер для крепления большого стекла с накладкойNANA
Большое стекло с прикрытием, 1.42" x  2.36" No1Тед Пелла260460-100
Lego (классическая основа, 1 x 8 плиток, 1 x 8 кирпичей, 1 x 6 пластин)Лего11023, 3008, 3666, 4162
Микротомные лопасти (высокопрофильные) Lieca Biosystems14035838926
Olympus UPlanSApo 30x силиконовый объективОлимпUPLSAPO30XS
Силиконовый большой лоток для льда (Samuelworld)Амазонка713243280060
Салфеточные салфетки (Kimwipes) Кимберли Кларк34120

Ссылки

  1. Sebag, J. Vitreous and vision degrading myodesopsia. Prog Retin Eye Res. 79, 100847(2020).
  2. Phillips, J. D., Hwang, E. S., Morgan, D. J., Creveling, C. J., Coats, B. Structure and mechanics of the vitreoretinal interface. J Mech Behav Biomed Mater. 134, 105399(2022).
  3. Seider, M. I., Conell, C., Melles, R. B. Complications of acute posterior vitreous detachment. Ophthalmology. 129 (1), 67-72 (2022).
  4. Ketkar, M., et al. Vitreomacular traction - a review. Eye. 39 (4), 710-717 (2025).
  5. Filas, B. A., Zhang, Q., Okamoto, R. J., Shui, Y. -B., Beebe, D. C. Enzymatic degradation identifies components responsible for the structural properties of the vitreous body. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 55(2014).
  6. Taufalele, P. V., VanderBurgh, J. A., Muñoz, A., Zanotelli, M. R., Reinhart-King, C. A. Fiber alignment drives changes in architectural and mechanical features in collagen matrices. PLoS One. 14 (5), e0216537(2019).
  7. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19 (3), 323-344 (2000).
  8. Los, L. I., van Luyn, M. J. A., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: Lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'Alae canalis Cloqueti'. Exp Eye Res. 69 (3), 343-350 (1999).
  9. Voytik-Harbin, S. L., Brightman, A. O., Waisner, B. Z., Robinson, J. P., Lamar, C. H. Small intestinal submucosa: A tissue-derived extracellular matrix that promotes tissue-specific growth and differentiation of cells in vitro. Tissue Eng. 4 (2), 157-174 (1998).
  10. Bos, K. J., et al. Collagen fibril organisation in mammalian vitreous by freeze etch/rotary shadowing electron microscopy. Micron. 32 (3), 301-306 (2001).
  11. Bembridge, B. A., Crawford, G. N. C., Pirie, A. Phase-contrast microscopy of the animal vitreous body. Br J Ophthalmol. 36 (3), 131-142 (1952).
  12. Filas, B. A., et al. Quantitative imaging of enzymatic vitreolysis-induced fiber remodeling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8626-8637 (2014).
  13. Los, L. I. The rabbit as an animal model for post-natal vitreous matrix differentiation and degeneration. Eye. 22 (10), 1223-1232 (2008).
  14. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19 (1), 016007(2014).
  15. Liu, Y., Keikhosravi, A., Mehta, G. S., Drifka, C. R., Eliceiri, K. W. Methods for quantifying fibrillar collagen alignment. Methods Mol Biol. 1627, 429-451 (2017).
  16. Wershof, E., et al. A FIJI macro for quantifying pattern in extracellular matrix. Life Sci Alliance. 4 (3), e202000880(2021).
  17. François, J., Victoria-Troncoso, V., Albarran, E. The histochemical structure of the vitreous fibers studied by phase-contrast microscopy. Am J Ophthalmol. 69 (5), 763-773 (1970).
  18. Hwang, E. S., Morgan, D. J., Sun, J., Hartnett, M. E., Toussaint, K. C., Coats, B. Confocal reflectance microscopy for mapping collagen fiber organization in the vitreous gel of the eye. Biomed Opt Express. 14 (2), 932(2023).
  19. Harris, J. R. Visualizing in vitro type I collagen fibrillogenesis by transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 1627, 367-383 (2017).
  20. Arevalo, R. C., Urbach, J. S., Blair, D. L. Size-dependent rheology of type I collagen networks. Biophys J. 99 (8), L65-L67 (2010).
  21. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Коллагеновая сеть стекловидного теладиссекция свиного глазавизуализация стекловидного геляорганизация коллагеновых волоконперевернутый микроскопвстраивание в агарозуотслойка сетчаткианализ сети волоконжесткость геля
Подготовка свиных глаз к конфокальной отражательной микроскопии для визуализации сети коллагеновых волокон стекловидного тела
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.