Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Совершенствование производства OnePot PURE и сырых рибосом для воспроизводимого бесклеточного синтеза белка

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем обновленный протокол производства системы OnePot «Синтез белка с использованием рекомбинантных элементов» (PURE) и сырых рибосом для бесклеточного синтеза белка, уделяя особое внимание контролю роста клеток для минимизации вариаций от партии к партии.

Аннотация

Последние достижения позволили экономично и с меньшим трудозатратами производить бесклеточную систему синтеза белка с использованием рекомбинантных элементов (PURE) в отдельных лабораториях. Тем не менее, получение 36 белковых компонентов и рибосом, входящих в состав PURE, по-прежнему является сложным мероприятием, в котором есть много вариаций и ошибок. Мы представляем подробную и обновленную процедуру производства PURE на основе недавно опубликованного протокола OnePot, который включает в себя регулирование ряда ключевых этапов, в частности, инокуляцию культур с использованием запасов глицерина, нормализованных по оптической плотности (OD), тщательный мониторинг роста клеток и контроль конечных концентраций глицерина. Используя этот подход, мы сообщаем о воспроизводимых препаратах PURE от нескольких биологических репликатов и пользователей. Этот протокол служит ориентиром и отправной точкой для других лабораторий для производства и устранения неполадок в своих собственных системах PURE, тем самым способствуя демократизации многих приложений, которые позволяет PURE, таких как восходящее построение биомолекулярных систем и разработка синтетических клеток.

Введение

Синтез бесклеточного белка (CFPS) созрел как технология для различных применений, включая биопроизводство, биосенсорику и диагностику, прототипирование генетических и метаболических частей и путей, быструю белковую инженерию и образование 1,2. Системы CFPS, использующие очищенные компоненты, первоначально разработанныекак система 3 «синтеза белка с использованием рекомбинантных элементов» (PURE), имеют ряд преимуществ по сравнению с альтернативами на основе лизата. Системы PURE имеют определенный состав, состоящий из 36 белковых факторов, рибосомы 70S E. coli и определенной смеси химических субстратов, включая нуклеозидтрифосфаты (NTP), аминокислоты и тРНК, которые могут быть адаптированы по желанию к требуемому применению. Таким образом, они хорошо подходят для таких исследований, как неканоническое включение аминокислот, механистическое моделирование и восходящее построение биомолекулярных систем и синтетическихклеток. Хотя PURE доступен у коммерческих поставщиков, его стоимость ($0,34-$1,63 за 1 мкл реакции) непомерно высока для крупномасштабных экспериментов; а альтернативная стратегия производства PURE собственными силами до сих пор затруднялась трудоемкими протоколами, включающими параллельную очистку 36 белков и рибосом4, которые сложно выполнить надежно и воспроизводимо, особенно для неопытных пользователей.

Последние разработки помогли домашнему производству PURE. Например, Wang et al. сконструировали штаммы E. coli для включения геномно интегрированных гекса-гистидиновых меток в механизм трансляции, облегчая одноступенчатую очистку. Гены, кодирующие все белки PURE, были собраны в небольшое количество плазмид, которые аналогичным образом были использованы дляснижения трудозатрат на очистку. Villareal et al. разработали элегантные консорциумы штаммов PURE, которые уравновешивают экспрессию для производства белков в правильном соотношении, в то же время обеспечивая одноступенчатуюочистку.

Инновационная система OnePot PURE, разработанная Lavickova et al., имеет большие перспективы для простоты использования 8,9. В этой системе исходные штаммы PURE подвергаются совместному культивированию и очистке с помощью одного этапа хроматографии. Несмотря на то, что невозможно точно определить состав полученной системы PURE, авторы продемонстрировали, что несколько партий системы в значительной степени воспроизводимы, а грубый уровень контроля может быть достигнут путем варьирования объема инокуляции каждого штамма. Компромисс между точным контролем состава и простотой производства будет приемлем для многих пользователей, учитывая, что общий выход синтеза белка из системы OnePot аналогичен тому, который получен коммерчески. Однако, несмотря на то, что существуют подробные протоколы для системы OnePot, было сложно полностью воспроизвести результаты Lavickova et al. в других лабораториях. Например, наблюдалась нестабильность вектора экспрессии, медленно растущие штаммы и протеолиз10.

В этой работе мы представляем подробный и усовершенствованный протокол OnePot PURE, который контролирует рост клеток с использованием стандартизированных запасов глицерина и корректировки среды, дает рекомендации по мониторингу роста и сбора OD, а также нормализует количество глицерина при окончательной очистке. Во-вторых, мы представляем оптимизированную процедуру очистки сырых рибосом с использованием только дифференциального ультрацентрифугирования, которая уравновешивает компромисс между активностью рибосом и стоимостью и сложностью более сложных методов.

Несмотря на то, что это вводит больше шагов в протокол OnePot, они дают пользователю больше возможностей для более тщательного устранения неполадок в процедуре, если это необходимо, а также для ее модификации в соответствии со своими потребностями. Мы демонстрируем воспроизводимость процесса, показывая множественные биологические реплики, выполненные несколькими пользователями в одной и той же лаборатории. Мы считаем, что контроль как над компонентами PURE, так и над препаратом рибосом имеет решающее значение для обеспечения высоких характеристик системы CFPS.

Препарат PURE и рибосома занимает 4 или 5 дней соответственно и может выполняться либо последовательно одним пользователем, либо одновременно двумя пользователями. Препарат PURE включает 4x500 мл жидкой культуры, каждая из которых дает ~2 г клеточной гранулы и ~1 мл белков PURE в концентрации ~15 мг/мл. Препарат рибосом включает 4 × 500 мл = 2 л жидкой культуры, что приводит к получению в общей сложности ~3 г клеточной гранулы и получению ~1 мл сырых рибосом в концентрации ~17 мкМ. Текущий протокол позволяет создавать системы PURE с выходом синтеза до ~100 μг/мл GFP или ~130 μг/мл mCherry в течение 2 часов периодической реакции11, что выгодно отличается от оригинального OnePot, а также от коммерческих систем (~140-160 μг/мл)8,12. Таким образом, он является подходящей отправной точкой для дальнейшей оптимизации за счет добавления или модуляции чувствительных компонентов, таких как соли, агенты скученности и отдельные белковые факторы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол разделен на три части. Для краткости и ясности мы подчеркиваем важные изменения, характерные для этой работы, и поэтому здесь упоминаются детали, которые совпадают с теми, которые существуют в других публикациях.

Предварительные работы нужно провести только один раз. Четыре секции включают в себя подготовку запасов глицерина и стартовых планшетов для белков PURE, а также проверку и измерение времени экспрессии штаммов. Использование стартовых пластин устраняет вариативность, связанную с прямым посевом из скребковых запасов глицерина. Очень важно убедиться, что эта работа выполнена тщательно, прежде чем приступать к этапу производства. Из-за большого количества различных запасов глицерина, участвующих в получении PURE, важно проверить целостность плазмид и экспрессию каждого штамма, прежде чем пытаться создать систему.

Схема рабочего процесса приведена на рисунке 1, а рекомендуемое расписание — в таблице 1. Необходимые материалы и этапы их использования приведены в Таблице материалов, а описание буферов и сред, необходимых на каждом этапе, обобщено на дополнительном рисунке S1.

1. Подготовительные работы

  1. Генерация запасов глицерина
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все плазмиды доступны в Addgene.
    1. В соответствии со стандартной процедурой9 генерируют 25% мас./в. запасов глицерина всех штаммов, перечисленных в таблице 2, и хранят в криовиалах при -80 °C.
  2. Подготовка заквасок PURE (на ночь)
    1. Приготовьте 20 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (LB+АМФ).
    2. Маркировка 36x стерильных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл от #1-#36.
    3. Добавьте 500 μL LB+AMP в каждую пробирку. Инокулируйте каждую пробирку соответствующим штаммом, используя наконечник пипетки, чтобы соскоблить небольшое количество из исходного глицеринового запаса. Следите за тем, чтобы запасы глицерина не оттаяли. Вихрь тщательно перемешать.
    4. Аликвота 300 мкл из каждой инокулированной пробирки в соответствующую лунку стерильного глубоколуночного планшета объемом 1 мл 96 в соответствии со схемой, показанной на рисунке 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На всех последующих этапах, связанных с пластинами, сохраняйте одну и ту же раскладку пластин по всей длине.
    5. Инкубируйте планшет в течение ночи в встряхивателе при температуре 37 °C, 1 000 об/мин в течение 15 часов.
    6. На следующий день приготовьте 25 мл LB среды с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (LB+АМФ) и 15 мл стерильного 50% глицерина.
    7. Перенесите по 30 мкл каждой культуры из глубоколуночного планшета на дно оптического 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Добавьте 270 мкл среды LB+AMP в каждую лунку, содержащую культуры, чтобы добиться 10-кратного разбавления каждой культуры.
    8. Измерьте внешний диаметр600 каждой культуры с помощью планшетного ридера. Рассчитайте объем каждой культуры, необходимый для инокуляции 650 мкл свежего LB+AMP с начальным наружным диаметром600 0,2. Электронная таблица, помогающая в расчетах, представлена в виде дополнительной таблицы S1.
    9. Приготовьте три новых стерильных глубоколуночных планшета объемом 1 мл 96. В одну чашку добавьте 650 мкл LB+AMP в 36 лунок и в каждую лунку закиньте рассчитанным объемом ночной культуры для получения OD600 = 0,2.
    10. Переложите по 300 мкл инокулированной культуры в каждую из двух других пластин. Одна пластина будет представлять собой культуру, а другая будет использоваться для мониторинга OD. Инкубируйте две пластины в встряхивателе при 37 °C, 1000 об/мин, пока культуры не достигнут наружного диаметра600 ~ 1 (~1,5-2 ч). Контролируйте внешний диаметр через 1 ч, а затем снова по мере необходимости, удаляя 30 мкл образцов со второго планшета и добавляя к 270 мкл LB+AMP для 10-кратного разбавления.
    11. Когда отдельные лунки достигнут наружного диаметра600 ~ 1, снимите их с шейкера. Добавьте равное количество стерильного 50% глицерина в каждую культуру для достижения конечной концентрации наружного диаметра600 = 0,5 в 25% глицерина. Тщательно перемешайте и храните эти трубочки на льду. Это основные оборотные запасы.
    12. Распределите максимум 40 мкл каждого эталонного материала в 96-луночные ПЦР-планшеты, сохраняя исходную схему лунок. Распределите по как можно большему количеству тарелок в зависимости от емкости хранения. Запечатайте пластинами из фольги и храните эти стартовые пластины PURE при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти стартовые пластины следует размораживать не более 3 раз. Замените пластины на свежие, если превышает этот предел, чтобы сохранить целостность и воспроизводимость деформации.
  3. Определение времени роста закваски (за ночь)
    1. Разморозьте закваску PURE на льду.
    2. Добавьте 50 мкл 100 мг/мл ампициллина к 50 мл стерильной среды LB в стерильной конической пробирке (LB+AMP).
    3. Пометьте 36 стерильных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл от #1 до #36 и добавьте 1 мл LB+AMP в каждую пробирку.
    4. Добавьте по 10 мкл каждого из запасов глицерина в соответствующую маркированную пробирку и хорошо перемешайте путем вортексирования.
    5. Добавьте 300 мкл инокулированной культуры из каждой пробирки в соответствующую лунку стерильного луночного планшета глубиной 1 мл 96. Запечатайте планшеты дышащим уплотнителем и инкубируйте культуральную пластину в вибростенде при 1000 об/мин, 37 °C. Определите и запишите время, необходимое для достижения культурами наружного диаметра600 ~ 2-3, не превышая наружного диаметра600 = 3. Установите этот параметр, прежде чем продолжить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории это занимает 15 часов.
  4. Испытание экспрессии штаммов PURE
    1. Приготовьте 38 мл LB среды с добавлением 100 мкг/мл ампициллина (LB+AMP), 10 мМ запаса IPTG и 1x реагента для экстракции белка.
    2. Разморозьте закваску PURE на льду.
    3. Добавьте по 1 мл LB+AMP в каждую из 36 лунок стерильного глубоколуночного планшета объемом 2 мл 96. Инокулируйте в каждую лунку 20 мкл соответствующей закваски. Инкубируйте планшет в встряхивателе при 1000 об/мин, 37 °C, в течение примерно 1 часа или до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр600 = 2.
    4. Индуцируйте экспрессию белка путем добавления 10 мкл 10 мМ IPTG в каждую лунку с конечной концентрацией IPTG 0,1 мМ. Продолжайте инкубацию в течение 3 ч при 1000 об/мин, 37 °C.
    5. По истечении 3-часового периода сцеживания перенесите по 700 мкл каждой культуры в 36 стерильных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 20 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
    6. Ресуспендируйте каждую гранулу в 70 мкл 1x реагента для экстракции белка. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании для обеспечения лизиса клеток.
    7. Центрифугируйте лизаты при 20 000 × г в течение 10 мин при 4 °C для гранулирования нерастворимой фракции.
    8. Проведите мелкомасштабную очистку каждого белка His-tag с помощью магнитных гранул Ni-NTA в соответствии с инструкциями производителя.
    9. Анализ очищенных белков с помощью SDS-PAGE для подтверждения экспрессии каждого белка и/или перекрестного загрязнения между штаммами9.
      Штаммы, экспрессирующие белок, будут демонстрировать отчетливые полосы на SDS-PAGE, соответствующие ожидаемой молекулярной массе белка-мишени. Если полосы не обнаружены, штамм может не экспрессировать белок. В таких случаях изолируют и секвенируют плазмиду для подтверждения идентичности и целостности последовательности, а также при необходимости заменяют плазмиду.

2. Очищение белка OnePot PURE (4 дня)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки одной системы PURE требуется обработка 500 мл жидкой культуры. Рекомендуется производить 4 препарата по 500 мл одновременно, чтобы получить четыре независимые партии PURE за один прогон. Затем эти партии могут быть количественно определены независимо друг от друга или объединены, если это целесообразно. 4-дневный протокол может быть сокращен до 3 дней, если провести этап инкубации смолы в течение ночи, но это включает в себя долгий третий день. Оба варианта подробно описаны ниже.

  1. День 1: подготовка материалов и выращивание заквасок
    1. Приготовьте исходные растворы и буферы для препарата PURE, как описано в Таблице S2 и Рисунке S1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте соответствующие среды и буферы, необходимые непосредственно перед выполнением каждой части протокола, и храните их только в течение максимального количества дней перед использованием, как указано.
    2. Разморозьте закваску PURE на льду.
    3. Добавьте 50 мкл 100 мг/мл ампициллина к 50 мл стерильной среды LB в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл (LB+AMP).
    4. Промаркируйте 36 стерильных микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл от #1 до #36 и добавьте 1 мл LB+AMP в каждую пробирку.
    5. Добавьте по 10 мкл каждого из запасов глицерина в соответствующую пробирку с этикеткой и хорошо перемешайте путем вортексирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы легко отслеживать инокуляцию каждого штамма, после добавления штамма в каждую пробирку извергните наконечник пипетки в соответствующую лунку стартовой пластины PURE. Повторите этот процесс для всех сортов. По завершении осторожно снимите наконечники пипеток с планшета перед повторным запечатыванием фольгой и автоклавной лентой и хранением при температуре -80 °C.
    6. Добавьте 300 мкл инокулированной культуры из каждой пробирки в соответствующую лунку стерильного планшета глубиной 1 мл 96 лунки, за исключением штамма #25 (EF-Tu). Уплотнительные пластины с дышащим уплотнительным устройством. Инкубируйте культуральную тарелку в встряхивателе при 1 000 об/мин, 37 °C, в течение 14 часов.
    7. Добавьте 1 мл инокулированной культуры из пробирки #25 до 10 мл LB в коническую пробирку объемом 50 мл для приготовления закваски EF-Tu. Инкубируйте пробирку в инкубаторе при 260 об/мин, 37 °C в течение 14 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм #25, EF-Tu, требуется в гораздо более высокой концентрации, чем другие компоненты, и поэтому обрабатывается отдельно, как описано в исходном протоколе8.
    8. Поместите 2 л стерильной среды 2x YTP в стеклянную бутылку объемом 2 л и поместите в статический инкубатор при температуре 37°C для предварительного нагрева на ночь.
  2. День 2: рост и гранулирование
    1. Подготовьте необходимые реагенты:
      1. 2 л стерильной предварительно подогретой среды 2x YTP (с 1-го дня)
      2. 2 мл 100 мг/мл ампициллина
      3. 100 мМ ИПТГ, стерильная
      4. 100 мл PBS, стерильный, ледяной
      5. 10 мл LB медиа
    2. С помощью многоканальной пипетки переведите 30 мкл каждой закваски из глубинной луночной пластины стартера и стартовой пробирки EF-Tu на дно оптической 96-луночной пластины.
    3. Добавьте 270 мкл LB среды в каждую лунку, содержащую культуры, чтобы добиться 10-кратного разбавления каждой культуры.
    4. Измерьте внешний диаметр600 каждой культуры с помощью планшетного ридера. Все деформации должны быть при OD600 = 2-3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура разрослась выше OD600 = 3, разбавьте до OD600 = 3, используя 2x YTP+AMP (Дополнительная таблица S1). Разбавление разросшихся заквасок может быть трудоемким и подверженным ошибкам. В связи с этим рекомендуется установить точное время инкубации, необходимое для достижения внешнего диаметра600 2-3, как описано в разделе 1.3 предварительных работ.
    5. Перелейте 500 мл предварительно подогретой среды 2x YTP и 500 мкл 100 мг/мл ампициллина в стерильную колбу с перегородкой объемом 2,5 л (2x YTP+AMP).
    6. В одну стерильную коническую пробирку объемом 15 мл добавьте по 55 мкл каждой культуры из стартового планшета для культивирования и 1675 мкл культуры EF-Tu. Хорошо перемешайте вортексом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это культура OnePot, которая объединяет в себе все сорта PURE. Именно на этой стадии могут быть созданы нокаутные (ΔPURE) системы путем исключения некоторых штаммов или могут быть добавлены другие компоненты, требующие совместной очистки.
    7. Добавьте содержимое этой пробирки в колбу объемом 2,5 л, содержащую 500 мл 2x YTP+AMP. Повторите шаги 5-7 для получения 4x независимых культур.
    8. Инкубируйте колбы при 260 об/мин, 37 °C, в течение 1,5-2 ч, до OD600 = 0,2-0,3.
    9. Как только будет достигнут OD600 = 0,2-0,3, инокулируйте каждую колбу 500 мкл 100 мМ IPTG для конечной индукционной концентрации 0,1 мМ IPTG.
    10. Инкубируйте культуры в течение еще 3 ч при 260 об/мин, 37 °C.
    11. Во время инкубации взвесьте и промаркируйте четыре стерильные конические пробирки объемом 50 мл.
    12. При необходимости предварительно охладите центрифуги до 4 °C, а также наклейте этикетки и охладите четыре бутылки центрифуг на основе сополимера полипропилена.
    13. Поместите четыре стеклянные бутылки объемом 500 мл с маркировкой в ванну с ледяной водой.
    14. В конце 3-часовой инкубации тщательно сцедите каждую культуру в стеклянную бутылку на льду, чтобы прекратить рост.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос культур в охлажденные бутылки необходим для быстрой остановки роста: помещение горячих колб непосредственно в ледяную водяную баню не приведет к эффективному прекращению роста. Все последующие шаги выполняются на льду, если не указано иное.
    15. Добавьте по 250 мл каждой культуры в соответствующие центрифужные флаконы и центрифугируйте при температуре 3220 × г, 4 °C, в течение 10 минут, а остальные 250 мл выдерживайте на ледяной водяной бане.
    16. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость и промокните насухо на бумажных полотенцах.
    17. Добавьте оставшиеся 250 мл каждой культуры в соответствующие центрифужные флаконы и снова центрифугируйте при 3220 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    18. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость и промокните насухо на бумажных полотенцах.
    19. Добавьте 20 мл стерильного ледяного PBS в каждую бутылку центрифуги и тщательно суспендируйте клеточную гранулу.
    20. Переложите каждую ресуспензию в подготовленные конические пробирки объемом 50 мл.
    21. Центрифугируйте пробирки при температуре 2 000 × г, 4 °C, в течение 8 минут.
    22. Удалите надосадочную жидкость, осторожно декантировав.
    23. Снова центрифугируйте пробирки при температуре 2 000 × г, 4 °C, в течение 2 минут.
    24. Удалите остаточный надосадочный слой с помощью пипетирования и держите гранулы клеток на льду.
    25. Каждая пробирка теперь содержит клеточную гранулу из одной культуры объемом 500 мл. Взвесьте каждую пробирку, рассчитайте массу гранул клетки (обычно ~2 г), вычитая пустой вес каждой пробирки, и запишите.
    26. Защелкните гранулы из морозильной камеры и храните при температуре -80 °C до лизиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, протокол может быть завершен за 3 дня, перейдя непосредственно к этапу лизиса на этом этапе.
  3. День 3: лизис, очищение и диализ
    1. Подготовьте необходимые реагенты:
      1. Приготовьте 50 мл буфера для ресуспендирования.
      2. Приготовьте 0,5 м ТЦЭП.
    2. Разморозьте клеточные гранулы на льду.
    3. Добавьте 50 мл ресуспендирующего буфера в коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 100 мкл 0,5 М TCEP. Хорошо перемешайте вортексом.
    4. Ресуспендируйте клеточные гранулы в Reсуспензионный буфер + TCEP в соотношении 2 мл на 1 г клеточной гранулы. Вихрь тщательно подсушить.
    5. Распределите ресуспензию клеток по коническим пробиркам объемом 50 мл таким образом, чтобы в каждой пробирке было 5 мл суспензии. Пометьте пробирки по мере необходимости, чтобы отслеживать 4 независимые культуры. Хранить на льду.
    6. Лизируйте клетки с помощью ультразвуковой обработки с амплитудой 30%, 20 с включено, 20 с выключено, в течение 10 циклов на ледяной водяной бане с использованием охлажденного ультразвукового зонда (рис. 3A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время ультразвуковой обработки в каждую трубку должно быть передано около 1000 Дж энергии. Используйте защищенную подставку, чтобы удерживать трубку на месте во время ультразвуковой обработки, чтобы обеспечить равномерность передачи энергии.
    7. Распределите лизат по 2 мл стерильных микроцентрифужных пробирок таким образом, чтобы каждая пробирка содержала 1 мл лизата. Повторите шаги 2.3.6 и 2.3.7 для лизиса всех четырех культур. Следующие действия выполняются для 4 лизатов параллельно.
    8. Центрифуга при 15 923 × г, 4 °C, в течение 20 мин.
    9. Во время центрифугирования промойте и уравновесьте 5 мл смолы для очистки белка (подготовьте четыре колонки для четырех лизатов):
      1. Добавьте 2 мл свежей смолы для очистки белка в колонку для гравитационной хроматографии.
      2. Дважды промойте колонку 30 мл стерильной дистиллированной воды, чтобы удалить накопленный этанол.
      3. Добавьте 30 мл ресуспензионного буфера с 60 мкл 0,5 М TCEP до конечной концентрации 1 мМ.
      4. Поскольку объем колонки составляет 30 мл, залейте буферы непосредственно в колонну, чтобы заполнить ее. Убедившись, что клапан закрыт, уравновесьте колонну, добавив 30 мл буфера для ресуспензии + TCEP.
      5. Откройте клапан, чтобы пропустить ~25 мл буфера, прежде чем закрыть клапан колонны, оставив ~5 мл буфера над слоем смолы для предотвращения высыхания. Теперь колонка готова к использованию.
    10. После центрифугирования смешайте всю осветленную негранулированную надосадочную жидкость из каждой культуры в 4 свежие конические пробирки объемом 50 мл на льду.
    11. Повторно суспендируйте смолу в оставшиеся 5 мл ресуспендирующего буфера + TCEP в каждой колонке и добавьте буфер и смолу в каждую из конических пробирок, содержащих надосадочную жидкость лизата.
    12. Закройте и запечатайте крышку парапленкой и выдерживайте в шейкере при температуре 4 °C в течение 5 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если лизис был выполнен сразу после роста, этот лизат можно инкубировать со смолой в течение ночи.
    13. Подготовьте необходимые реагенты:
      1. Добавьте TCEP в конечной концентрации 1 мМ в буферы для промывки и элюирования и храните при температуре 4 °C до использования.
      2. Держите наготове 20% (v/v) этанола.
    14. После инкубации кратковременно измельчите пробирки в центрифуге, чтобы собрать смолу на дно пробирки.
    15. Повторно суспендируйте смолу с помощью пипетки и добавьте смолу обратно в колонну для очистки белка.
    16. Как только смола остановится в слое в нижней части колонны, дайте буферу пройти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально собирайте проточные и промывочные материалы во время очистки белка для анализа с помощью SDS-PAGE для устранения неполадок в процедуре очистки
    17. Промывочная колонка с объемом одной колонки Wash Buffer + TCEP.
    18. Добавьте в колонку 5 мл элюирующего буфера + TCEP, несколько раз повторно суспендируйте смолу пипеткой и выдерживайте в течение 10 минут.
    19. После инкубации соберите элюирование в пробирку с маркировкой объемом 5 мл и храните на льду.
    20. Очистите и храните смолу для очистки белка:
      1. После завершения элюирования промойте колонку 30 мл элюирующего буфера, чтобы удалить все оставшиеся связанные белки.
      2. Промойте смолу 30 мл стерильной дистиллированной воды, повторите 3 раза.
      3. Пропустите 30 мл 20% (v/v) этанола через колонку один раз.
      4. Заполните колонку 20% этанолом и закройте крышкой или парапленкой. Хранить при температуре 4 °C до следующего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется только очистка - не пытайтесь удалить никель со смолы. Очищенная смола пригодна для повторного использования в стандартных составах системы PURE; однако для вариантов системы ΔPURE всегда используйте свежую смолу, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    21. Замочите диализную кассету объемом 15 мл 2 кДа в буфере HT (без TCEP) на 10 минут.
    22. Добавьте в диализную кассету 5 мл элюированного белкового раствора.
    23. Удалите как можно больше воздуха из кассеты, прежде чем снова надеть крышку.
    24. Диализируйте 5 мл элюированного белка в сравнении с 1 л Buffer HT (без TCEP) в течение 2 ч, а затем еще 1 л свежего Buffer HT в течение ночи при 4 °C при осторожном перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При комбинировании элюирования от нескольких очисток можно диализовать до 10 мл элюирования против 2 л буфера HT в течение 2 ч, а затем еще 2 л буфера HT в течение ночи при 4 °C. Если инкубация смолы проводилась в течение ночи, диализ может быть выполнен в течение дня с использованием протокола продолжительностью 2 часа, за которым следует 4 часа, после чего сразу же следуют этапы концентрации белка, описанные ниже.
  4. День 4: концентрирование и хранение
    1. Приготовление необходимых реагентов:
      1. Подготовьте буфер HT Refresh + TCEP.
      2. Подготовьте бульон-60 + TCEP.
    2. После завершения диализа извлеките 5 мл диализованного образца из кассеты и распределите 500 мкл аликвот по 5 стерильным микроцентрифужным пробиркам по 2 мл.
    3. Вращайте для гранулирования любых осажденных белков при 14 000 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    4. Повторно комбинируйте надосадочную жидкость без гранул и добавьте в центробежный фильтр MWCO мощностью 3 кДа, а затем долейте объем 10 мл Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Центрифугируйте при 3 220 × г, 4 °C, в течение 30 мин ИЛИ до тех пор, пока объем образца не уменьшится до 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение белка на этапах концентрации может значительно снизить общую производительность CFPS. После каждого 30-минутного цикла центрифугирования с помощью пипетки объемом 1 мл повторно суспендируйте образец в трубке центробежного фильтра, чтобы удалить все осажденные белки со дна фильтра.
    6. Извлеките образец из центробежного блока и распределите 500 мкл аликвот по 3 стерильным микроцентрифужным пробиркам объемом 2 мл.
    7. Вращайте для гранулирования любых осажденных белков при 14 000 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    8. Повторно комбинируйте надосадочную жидкость без гранул в свежую стерильную микроцентрифужную пробирку на льду.
    9. Определите концентрацию белков в растворе с помощью теста Брэдфорда, следуя инструкциям производителя.
    10. Сконцентрируйте белковый раствор, добавив его в свежий фильтр MWCO мощностью 3 кДа, и центрифугируйте при 14 862 × г, 4 °C, в течение 15 мин ИЛИ до тех пор, пока не будет достигнут объем образца для получения конечной концентрации 25-30 мг/мл.
    11. Извлеките образец из центробежного блока и распределите 500 мкл аликвот по стерильным микроцентрифужным пробиркам объемом 2 мл.
    12. Вращайте для гранулирования осажденных белков при 14 000 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    13. Определите концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда. Переходите к следующему этапу только в том случае, если концентрация составляет от 25 до 30 мг/мл.
    14. Повторно комбинируйте надосадочную жидкость без гранул в свежую микроцентрифужную пробирку на льду.
    15. Добавьте равный объем Stock-60 + TCEP в концентрированный белковый раствор и перемешайте с помощью щадящего пипетирования.
    16. Определите конечную концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок теперь находится в буфере HT + 30% глицерина, и любое дополнительное разведение Stock-30 не изменяет концентрацию глицерина.
    17. При необходимости разбавьте образец Stock-30 + TCEP до достижения конечной концентрации примерно 12,5 мг/мл.
    18. Раствор белка Aliquot PURE в ПЦР-пробирки при 20 мкл аликвот, мгновенно заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно точно определить концентрацию белка перед добавлением Stock-60, так как концентрирование белковых растворов, содержащих глицерин, может привести к нестабильной производительности CFPS из-за переменного количества глицерина в конечной реакции CFPS. Поэтому Stock-60 следует добавлять только после подтверждения того, что концентрация белка находится в оптимальном диапазоне 25-30 мг/мл.

3. Подготовка сырой рибосомы (5 дней)

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол очистки рибосом был оптимизирован для обработки 2 л (4 колбы по 500 мл) жидкой культуры, что приводит к получению в общей сложности ~3 г клеточной гранулы и получению ~1 мл сырых рибосом в концентрации 15-24 мкМ.

  1. День 1: подготовка и выращивание заквасок
    1. Приготовьте исходные растворы и буферы для получения рибосом, как описано в Дополнительной таблице S2 и Дополнительном рисунке S1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: подготовьте соответствующие среды и буферы, необходимые непосредственно перед выполнением каждой части протокола, и храните их только в течение максимального количества дней перед использованием, как указано.
    2. Подготовьте две конические пробирки по 50 мл: добавьте 10 мл среды LB в одну пробирку и 5 мл среды LB в другую.
    3. Извлеките глицериновый бульон BL21 (DE3) из морозильной камеры при температуре -80 °C и положите на лед, убедившись, что следующие шаги выполнены до того, как бульон оттает.
    4. Инокулируйте 10 мл LB-среды путем соскабливания клеток с глицеринового запаса, чтобы создать «мини-культуру» LB. Инкубируйте при температуре 37 °C, 220 об/мин вместе с другой (неинокулированной) пробиркой для проверки на загрязнение среды, так как все новообразования обрабатываются без антибиотиков.
    5. Замените запасы глицерина в морозильной камере при температуре -80 °C.
    6. Поместите 2,2 л стерильного бульона Terrific Broth (TB) в стерильные стеклянные бутылки и храните в статическом инкубаторе при температуре 37 °C для предварительного нагрева в течение ночи.
  2. День 2: рост и гранулирование
    1. Перед началом работы извлеките культуры из инкубатора и убедитесь, что в неинокулированной пробирке или предварительно нагретой бутылке с фильтрующим материалом нет загрязнений.
    2. Приготовьте 10-кратное разведение, добавив 100 μL мини-культуры к 900 μL LB в кювете 1 см, и измерьте OD600 с помощью спектрофотометра (убедитесь, что он составляет ~4-6).
    3. Добавьте 200 мл предварительно подогретого ТБ в стерильную коническую колбу объемом 500 мл и инокулируйте соответствующим объемом мини-культуры до получения начального наружного диаметра600 = 0,05 (Дополнительная таблица S1). Это и есть «миди-культура».
    4. Инкубируйте миди культуру при 37 °C, 220 об/мин до OD600 = 1, что должно занять примерно 1,5-2 часа.
    5. Добавьте по 500 мл ТБ в каждую из 4 стерильных колб объемом 2,5 л. Инокулируйте каждый из них соответствующим объемом миди культуры, чтобы получить начальный OD600 = 0,05 (Дополнительная таблица S1). Это 4 «макси-культуры».
    6. Инкубируйте макси-культуры при 37 °C, 220 об/мин до OD600 = 0,7-0,8, что должно занять примерно 1,5-2 ч.
    7. Тем временем наклейте этикетку и поместите четыре чистые бутылки из полипропиленового сополимера и 4 чистые стеклянные бутылки объемом 500 мл на лед для охлаждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте плотность макси-культуры каждые 15 минут после 1 ч роста, чтобы не превысить OD600 = 0,7.
    8. Как только OD600 = 0,7 будет достигнуто, быстро переложите культуры в охлажденные стеклянные бутылки и поместите на ледяную водяную баню на 20 минут, чтобы остановить рост.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос культур в охлажденные бутылки необходим для быстрой остановки роста: помещение колб непосредственно в ледяную водяную баню не приведет к эффективному прекращению роста. Все последующие шаги выполняются на льду, если не указано иное.
    9. Пока культуры охлаждаются в ледяной водяной бане, предварительно охладите центрифугу для гранулирования клеток и поместите 500 мл раствора PBS на лед для охлаждения.
    10. Через 20 минут перелейте по 250 мл каждой культуры в соответствующую предварительно охлажденную центрифужную бутылку и центрифугируйте при температуре 3220 × г, 4 °C, в течение 10 минут, сохраняя остальные 250 мл на льду.
    11. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость и промокните насухо на бумажных полотенцах.
    12. Добавьте оставшиеся 250 мл каждой культуры в соответствующую бутылку центрифуги и снова центрифугируйте при 3220 × г при 4 °C в течение 10 минут.
    13. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и промокните флаконы насухо на бумажных полотенцах, прежде чем положить гранулы клетки обратно на лед.
    14. Добавьте 30 мл стерильного ледяного PBS в каждую бутылку центрифуги и тщательно повторно суспендируйте клеточную гранулу.
    15. Взвесьте и промаркируйте 4 чистые конические пробирки объемом 50 мл.
    16. Перенесите клеточную суспензию в конические пробирки объемом 4 x 50 мл.
    17. Снова центрифугируйте при 3 220 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    18. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и промокните пробирки насухо на бумажных полотенцах, прежде чем положить гранулы клеток обратно на лед.
    19. Добавьте 30 мл стерильного ледяного PBS в каждую коническую пробирку и тщательно повторно суспендируйте клеточную гранулу путем вортексирования.
    20. Снова центрифугируйте при 3 220 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    21. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и промокните пробирки насухо на бумажных полотенцах, прежде чем положить гранулы клеток обратно на лед.
    22. Добавьте 30 мл стерильного ледяного PBS в каждую коническую пробирку и тщательно повторно суспендируйте клеточную гранулу путем вортексирования.
    23. Снова центрифугируйте при 3 220 × г, 4 °C, в течение 10 минут.
    24. Удалите надосадочную жидкость путем декантации и промокните флаконы насухо на бумажных полотенцах, прежде чем положить гранулы клетки обратно на лед.
    25. Центрифугируйте в последний раз при 3 220 × г, 4 °C, в течение 2 минут.
    26. Удалите избыток надосадочной жидкости с помощью пипетирования.
    27. Взвесьте и запишите массу каждой конической трубки. Масса гранул ячейки представляет собой разницу между этими значениями и массой пустых пробирок (должна составлять ~1 г).
    28. Защелкните гранулы в морозильной камере, используя жидкий азот, и храните при температуре -80 °C.
  3. День 3: лизис, ультрацентрифугирование и замачивание в буфере B
    1. Разморозьте клеточные гранулы на льду.
    2. Добавьте 50 мл рибосомного буфера А в чистую коническую пробирку.
    3. Возьмите 100 мкл рибосомного буфера А из конической пробирки и добавьте во флакон без взвешивания DTT. Полностью растворите гранулу DTT, чтобы получить 0,5 М запас DTT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте последующие 0,5 млн DTT-акций, как описано здесь, но с использованием соответствующего буфера для каждого шага.
    4. Добавьте 100 мкл 0,5 М DTT обратно в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы получить конечную концентрацию 1 мл DTT в 50 мл рибосомного буфера A. Держите раствор на льду.
    5. Ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в рибосомном буфере А + DTT в соотношении 2 мл на 1 г клеточной гранулы путем тщательного вортексирования. Объедините все ресуспендированные клетки в одну коническую пробирку, чтобы проверить общий объем ресуспендированной суспензии, который должен составлять 10 мл из 2 л культуры. При необходимости долейте объем до 10 мл с помощью дополнительного рибосомного буфера A + DTT.
    6. Разделите суспензию на 2 образца по 5 мл в отдельных конических пробирках.
    7. Лизируйте клетки в каждой пробирке с помощью ультразвуковой обработки с амплитудой 30%, 20 с включено, 20 с выключено в течение 10 циклов (общая продолжительность программы 3 мин 20 с) на ледяной водяной бане, используя охлажденный зонд ультразвука (рис. 3A, 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время ультразвуковой обработки на одну трубку должно быть передано около 1000 Дж энергии. Используйте защищенную подставку, чтобы удерживать трубку на месте во время ультразвуковой обработки, чтобы обеспечить постоянство передачи энергии.
    8. Долейте объем каждого лизированного образца до 25 мл с помощью рибосомного буфера А + DTT и кратковременно перемешайте.
    9. Переложите содержимое в 2 охлаждаемые центрифужные пробирки S30.
    10. Центрифугируйте при 30 000 × г в течение 1 ч при 4 °C (рис. 3E).
    11. Соберите не более 75% надосадочной жидкости, не содержащей гранул (чтобы избежать загрязнения мембраны гранулами) из каждой пробирки S30 в две чистые предварительно охлаждаемые пробирки S30.
    12. Центрифуга при 30 000 × г в течение 30 мин при 4 °C.
    13. Соберите максимум 75% надосадочной жидкости, не содержащей гранул, в две чистые конические пробирки объемом 50 мл и долейте объем каждой до 25 мл с помощью рибосомного буфера A + DTT.
    14. Перенесите образец в две чистые предварительно охлажденные пробирки S100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед ультрацентрифугированием убедитесь, что пробирки точно сбалансированы (максимальная разница 0,01 г между противоположными пробирками) и заполнены до объема 25 мл (максимальная емкость пробирки S100).
    15. Центрифугируйте при 100 000 × г в течение 4 ч при 4 °C (рис. 3F).
    16. За тридцать минут до окончания прогона S100 приготовьте 0,5 М DTT с использованием ледяного рибосомного буфера B в соответствии с приведенными выше инструкциями и сгенерируйте окончательный раствор 1 мМ DTT в 50 мл рибосомного буфера B.
    17. Удалите надосадочную жидкость из ультрацентрифужных пробирок путем декантации. Добавьте 5 мл ледяного рибосомного буфера B + DTT в каждую пробирку S100, содержащую рибосомальную гранулу. Храните оставшийся рибосомный буфер B + DTT при температуре 4 °C для использования на следующий день.
    18. Инкубируйте пробирки на льду в холодном помещении, чтобы гранулы рибосомы впитались в буфер рибосом B + DTT на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рибосомная гранула полностью погружена в рибосомный буфер B + DTT. Этого можно достичь, поместив трубки в лед под углом (рис. 3D).
  4. День 4: ультрацентрифугирование и замачивание в буфере C
    1. На следующий день добавьте еще 5 мл ледяного рибосомного буфера B + DTT в каждую пробирку S100, содержащую замоченную на ночь гранулу рибосомы.
    2. Осторожно попытайтесь повторно суспендировать гранулу с помощью пипетирования. С помощью наконечника пипетки соскребите гранулу со стенки трубки и снова подвесьте таким образом. Перелейте содержимое в две чистые предварительно охлажденные пробирки S30.
    3. Добавьте еще 10 мл ледяного рибосомного буфера B + DTT в каждую пробирку S100, содержащую гранулу рибосомы, и повторите шаги ресуспензии, как описано выше.
    4. Соберите ресуспензию в ту же трубку S30, что и ранее.
    5. Центрифугируйте при 30 000 × г в течение 1 ч при 4 °C (рис. 3G).
    6. Соберите максимум 75% надосадочной жидкости без гранул в две чистые конические пробирки объемом 50 мл и долейте объем до 25 мл с помощью рибосомного буфера B + DTT.
    7. Переложите этот образец в две чистые предварительно охлажденные пробирки S100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед ультрацентрифугированием убедитесь, что пробирки точно сбалансированы и заполнены до объема 25 мл (максимальная емкость пробирки S100).
    8. Центрифугируйте при 100 000 × г в течение 4 ч при 4 °C (рис. 3H).
    9. За тридцать минут до окончания прогона S100 приготовьте 0,5 М DTT с использованием ледяного рибосомного буфера C в соответствии с приведенными выше инструкциями и сгенерируйте окончательный раствор 1 мМ DTT в 5 мл рибосомного буфера C. Держите этот буфер на льду.
    10. После ультрацентрифугирования отбросьте надосадочную жидкость и удалите остатки буфера с помощью пипетирования. Работайте быстро, чтобы не оставлять гранулу незакрытой буфером слишком долго.
    11. Добавьте 400 μL ледяного рибосомного буфера C + DTT в каждую ультрацентрифужную пробирку, содержащую рибосомальную гранулу.
    12. Инкубируйте пробирки на льду в холодном помещении, чтобы гранулы рибосомы впитались в Ribosome Buffer C + DTT на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рибосомная гранула полностью погружена в рибосомный буфер C + DTT. Этого можно добиться, поместив трубки в лед под углом.
  5. День 5: сбор
    1. На следующий день осторожно суспендируйте гранулу рибосомы с помощью пипетки объемом 1 мл и путем осторожного вращения полностью растворите прозрачную гранулу рибосомы ореола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гранула рибосомы должна полностью раствориться в буфере: на этом этапе не должно быть нерастворимой гранулы, но если осталась желтая нерастворимая гранула, не пытайтесь повторно суспендировать ее: только ресуспендированную прозрачную гранулу рибосомы ореола.
    2. Перелейте раствор рибосомы в две стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл и центрифугируйте при температуре 20 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы удалить оставшийся нерастворимый материал.
    3. Соберите надосадочную жидкость без гранул в чистую пробирку и храните на льду (рисунок 3I).
    4. Создайте 100-кратное разведение раствора рибосом, добавив 2 мкл к 198 мкл рибосомного буфера С в трех экземплярах.
    5. Измерьте концентрацию РНК на длине волны 260 нм; 10 единиц поглощения разбавленного образца равняется 24 мкМрибосом13.
    6. Растворы аликвот рибосом (например, в 50 мкл аликвот, в зависимости от потребностей пользователя) замораживаются в жидком азоте при максимальной концентрации 24 мкМ и хранятся при температуре -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол должен приводить к получению примерно 1 мл рибосом в концентрации 12-18 мкМ. Если рибосомы слишком разбавлены, концентрация может быть достигнута с помощью фильтра MWCO мощностью 3 кДа8.

4. Настройка экспериментов по CFPS

  1. Подготовительные работы
    1. Подготовьте матрицу ДНК (линейную или плазмиду) в соответствии с установленными протоколами9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашей лаборатории мы используем матрицы ДНК на основе системы экспрессии T7p14, оптимизированной для бесклеточной экспрессии14. Очищенные продукты ПЦР могут быть использованы в качестве линейных шаблонов. Важно отметить, что плазмиды должны быть очищены после miniprep, и что различные коммерческие наборы даютразные результаты.
    2. Приготовьте 5-кратный энергетический раствор, как описано в таблице 3.
    3. Приготовьте 6-кратный матричный раствор, как описано в таблице 4.
  2. Настройка и мониторинг реакции PURE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает настройку тройного измерения с использованием мастер-микса. Количество реакций может быть увеличено или уменьшено по мере необходимости с помощью таблицы, приведенной в Дополнительной таблице S3, но мы рекомендуем минимум тройных повторов для одного экспериментального условия.
    1. Для размораживания необходимы аликвоты PURE, рибосомы, энергетический раствор и матричный раствор на льду.
    2. Приготовьте мастер-смесь для одного набора тройных реакций в ПЦР-пробирке, общим объемом 17 мкл, как показано в таблице 5, собрав компоненты в следующем порядке: энергетический раствор, ЧИСТЫЕ белки, рибосомы, матричный раствор, безнуклеазная вода до 17 мкл.
    3. Установите дозатор на 5,1 мкл и осторожно отасуньте раствор 5-6 раз, чтобы перемешать, обеспечивая однородность.
    4. Используя ту же настройку пипетки (5,1 μл), загрузите основную смесь в три отдельные лунки оптического 384-луночного планшета. Не проталкивайте пипетку дальше первого упора, чтобы предотвратить образование пузырьков. Оставьте одно луночное пространство между каждым репликатом, чтобы свести к минимуму перекрестные помехи флуоресценции.
    5. Запечатайте пластину с помощью клеевой пломбы.
    6. При необходимости выполните последующие измерения инкубации или считывателя планшетов.
      Примечание: При включении дополнительных компонентов, содержащих глицерин (например, белков-энхансеров), убедитесь, что конечный объем таких компонентов не превышает 10% от объема реакции. Например, компонент с 30% глицерина должен быть ограничен до 1,7 мкл на 17 мкл мастер-смеси.
      Не центрифугируйте 384-луночный планшет после загрузки. Центрифугирование может привести к разделению компонентов, богатых глицерином (например, в системе PURE), что приводит к нестабильным уровням экспрессии. Конструкция планшета поддерживает реакции малого объема, а тщательное пипетирование обеспечивает адекватное осаждение без центрифугирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рабочий процесс для препаратов PURE и рибосом показан на рисунке 1, а рекомендуемый график работы приведен в таблице 1. Как правило, реакции контролируются с помощью производства флуоресцентных белков, таких как GFP или mCherry, а показания RFU могут быть преобразованы в концентрации путем калибровки11. Тем не менее, выход CFPS зависит от конкретного производимого белка, и поэтому важн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили подробную процедуру, которая позволила нам получить воспроизводимые системы PURE для нескольких партий и пользователей в одной лаборатории. Для достижения этой цели необходимо предпринять ряд критически важных шагов.

Первым важным шагом является обеспечение целостности 36 штаммов PURE: в дополнение к секвенированию всех плазмид, важно провести испытание экспрессии, чтобы убедиться, что все штаммы правильно гиперэкспрессируют, поскольку потеря од...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

SL является соучредителем и техническим директором компании Biophoundry Inc., которая разрабатывает бесклеточную технологию для фаговой инженерии.

Благодарности

NL, SL, AB и NZ поддерживаются стипендией UKRI Future Leaders Fellowship NL (MR/V027107/1). SL также поддерживается Biophoundry Inc. SY поддерживается стипендиатом Darwin Trust PhD из Эдинбургского университета. CW поддерживается аспирантурой BBSRC Eastbio PhD. Авторы благодарят А. Помпу за помощь в использовании ультрацентрифуги, которая была поддержана финансированием исследовательской платформы Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Кроме того, мы благодарим B. Lavickova и S. J. Maerkl за помощь в настройке оригинального протокола OnePot. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии Авторской рукописи, полученной в результате этой заявки. Рисунок 1 был частично создан в BioRender. Лаохакунакорн, Н. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 раза на YouTubeСигмаY2377-250G
аминокислотыСигмаLAA21-1KT
РНК без ацетата аммонияThermo ScientificAM9070G
нашатырьСигма09718-1KG
АмпициллинСигмаA8351-5G
BL21(DE3) компетентный E. coliКЛЮВC2527H
бутылка, центрифуга (Nalgene)Thermo Scientific3120-9500Бутылка с полипропиленовым сополимером
бутылка, стекло (Duran) 250 мл, 500 мл, 1 л, 2 лVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Брэдфордский анализ, Quick Start 1x Красительный реагентБио-Рад5000205
центрифугаThermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
центрифуга, микроЭппендорф5424R 
Колонка хроматографииБио-Рад7321010
креатинфосфатСигма27920
Кюветы, полумикро 1,6 млФишербрандFB55147
ди-натрий-водород ортофосфат дигидратФишер КемикалS/4450/60
диализная кассета, Slide-A-Lyzer G3, 2 кДа MWCO, 15 млThermo ScientificA52962
Дикалиев ортофосфат безводныйФишер КемикалP/5240/60
DTT без весаThermo ScientificA39255
фильтрующий блок, центробежный 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD МиллипорUFC900324
колба, 500 млVWR214-1133
фляжка, запутанная 2,5 L TunairSS-5013
Фолиновая кислотаСигмаF7878-100MG
глицеринСигмаG5516-1L
Список совместимого оборудованияФишербрандH/1200/PB17
Буфер HEPES, pH раствора 1 млн 7,3Thermo ScientificBP299
имидазолСигмаI2399-500G
инкубаторЭппендорфNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermo ScientificR0392
Пеллеты KOHThermo ScientificP1767-500G
L-глутаминовая кислота, гемимагниева-соль тетрагидратаСигма49605-250G
Моногидрат монокалийной соли L-глутаминовой кислотыСигма49601-500G
Тетрагидрат магний-ацетатаСигмаM5661-50G
хлорид магнияFluka63020-1L
Магнитная перемешивающая установкаСтюартUS152
НанодропThermo ScientificNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Mag БусиныКЛЮВS1423S
ПарафильмСигмаP7543-1EA
пипетка, многоканальный Eppendorf Research Plus 30-300 &Micro; LЭппендорф3125000052
Клейковая пломба для считывателя пластинExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Стерильный)
Дышащий уплотнение пластиныСтарлабE2796-3005
Уплотнение фольгиExcelScientificFCS-25
Считыватель пластинBioTekСинергия H1
Шейкер для пластинАллшэнMBI100-4A
Пластина, 384 колодецThermo Scientific242764
плита, глубокая скважина 96 млThermo Scientific736-0601
пластина, глубокая скважина 96, 2 млСарштедт82.1972.002
Пластина, 96-луночная ПЦРСарштедт721,978
Пластина, оптическая 96-я колодцаThermo Scientific10057581
хлорид калияСигмаP5405-500G
Ортофосфат диводорода калияФишер КемикалP/4800/53
Реагент для экстракции белка (BugBuster)EMD Миллипор70584-3
Смола для очистки белка (cOmplete)Рош5893682001
Шейкер на грилеСтарлабRM-Multi 1
хлорид натрияФишер КемикалS/3105/70
зонд, FisherBrand 15-50 млThermo Scientific12931181
СоникаторFisher ScientificFB120
спектрофотометрДженвейGenova Plus
спермидинСигмаS2626-1G
TCEP 0,5 мSupelco646547
Thermo Fisher NTP, буферизованный TrisThermo ScientificR1481
тРНК из E. coli MRE600Рош10109541001
ТриптонFormediumTRP02
трубка, 0,2 мл ПЦР-классаСарштедт72,737,002
трубка, бижу Стерилин 7 мл полистиролаThermo Scientific129A
трубка, коническая (Falcon) 15 млСарштедт62.554.502
трубка, коническая (Falcon) 50 млСарштедт62.547.254
трубка, микроцентрифуга (Eppendorf) 1,5 млСарштедт72.690.001
трубка, микроцентрифуга (Eppendorf) 2 млСарштедт72.695.700
трубка, центрифугирование S100 Бекман-Коултер355619
трубка, центрифугирование S30 Thermo Scientific3118-0050
ультрацентрифугаБекман-КоултерOptima XPN-100
Ультрацентрифугный роторБекман-КоултерРотор с фиксированным углом 70Ti
Дистиллированная вода UltraPure DNase/RNase FreeThermo Scientific10977049
вихрьVWR444-2791
Экстракт дрожжейОксоидLP0021T

Ссылки

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Система PUREподготовка рибосомсинтетическая биологияультрацентрифугированиефлуоресценция GFPнормализация оптической плотностиконцентрация глицеринаэкспрессия белков
Совершенствование производства OnePot PURE и сырых рибосом для воспроизводимого бесклеточного синтеза белка
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.