Методическая статья

Развертываемая в полевых условиях безлинзовая платформа визуализации для быстрого безмаркерного анализа активации естественных клеток-киллеров

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68834

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает безмаркерный метод быстрого анализа количества и активности естественных клеток-киллеров (NK) с использованием технологии визуализации теней без линз. Этот метод количественно оценивает морфологические изменения в отдельных NK-клетках путем компьютерного анализа их дифракционных картин.

Аннотация

Естественные киллеры (NK) являются важными эффекторами врожденного иммунитета, которые уничтожают инфицированные вирусом и злокачественные клетки. Мониторинг активности NK-клеток имеет важное значение для оценки иммунной функции. Однако традиционные методы, такие как проточная цитометрия, являются трудоемкими и длительными. Этот протокол описывает безметочный метод экспресс-анализа активности естественных киллеров (NK) клеток с использованием технологии визуализации теней без линз (LSIT). NK-клетки, выделенные из периферической крови и стимулированные запатентованным активатором, анализировали с помощью платформы LSIT в течение 5 минут. Платформа LSIT захватывает голографические изображения, известные как теневые изображения, созданные интерференцией света с NK-элементами, и отслеживает состояние их активации, анализируя изменения параметров тени. Ключевые параметры, полученные на основе изображений теней, включая расстояние от пика до пика (PPD) и стандартное отклонение ширины вторичных максимумов (WSM-SD), количественно отражали морфологию клетки и внутреннюю сложность. Эти параметры были интегрированы в комбинированный теневой параметр (CSP) и индекс врожденного иммунитета (I3) для обеспечения всесторонней оценки и количественной оценки активности NK-клеток на основе морфологических изменений в клетках. I3, рассчитанный как процентное изменение CSP после активации, служил прямым измерением активности NK-клеток. NK-клетки здоровых лиц неизменно демонстрировали значительно более высокие значенияI3 , чем у лиц с ослабленным иммунитетом. Платформа LSIT обеспечивает быстрое и экономичное иммунное профилирование, подходящее для диагностики на месте оказания медицинской помощи.

Введение

Морфология клеток становится ключевым индикатором молекулярных механизмов. Он не только обеспечивает визуальное представление клеточной структуры, но и дает ценную информацию о процессах, лежащих в основе и функцияхотдельных клеток. Анализ формы, размера и активности иммунных клеток на уровне отдельных клеток дает решающее представление об их поведении, гетерогенности и роли в здоровье и болезнях 2,3,4,5,6.

К числу этих важнейших клеток относятся естественные киллеры (NK), которые являются центральным компонентом врожденной иммунной системы 7,8. Они уничтожают инфицированные вирусом и раковые клетки и регулируют адаптивный иммунный ответ за счет высвобождения цитокинов 9,10,11. Рак, вирусные инфекции и иммунодефициты часто снижают количество NK-клеток и нарушают их функции 12,13,14. Таким образом, активация NK-клеток служит важным биомаркером и дает информацию об общем состоянии здоровья иммунной системы. Следовательно, быстрая оценка активации NK-клеток отдельными клетками имеет важное значение для прогноза, диагностики, мониторинга заболевания и стратификации пациента 15,16,17,18.

В настоящее время активность NK-клеток оценивается на основе их цитотоксической способности (способности убивать клетки-мишени) и продукции цитокинов 19,20,21,22. Традиционные методы измерения клеточно-опосредованной цитотоксичности23, такие как анализы высвобождения хрома-51 (51Cr)24,25, проточные цитометрические анализы26,27 и иммуноферментные анализы (ИФА) для количественного определения интерферона-гамма (ИФН-γ), секретируемого NK-клетками после стимуляции 28,29,30 имеют несколько ограничений. К ним относятся отсутствие стандартизации, длительные протоколы (например, ночная инкубация методом ИФА), зависимость от маркировки клеток ивысокая стоимость оборудования. Эти проблемы подчеркивают потребность в инновационных методах, которые обеспечивают быстрые результаты, экономическую эффективность, анализ без этикеток и высокую производительность. Кроме того, оценка активации NK-клеток на уровне одиночных клеток дает подробное представление о популяционной гетерогенности и индивидуальных клеточных реакциях на стимуляцию.

Среди новых технологий, направленных на преодоление этих ограничений, особенно эффективным решением является технология безлинзовой визуализации теней (LSIT) 34,35,36. LSIT, упрощенная цифровая встроенная голография (DIH), обеспечивает быстрый, безмаркерный, высокопроизводительный анализ активации NK-клеток с разрешением 37,38,39 для одной клетки. DIH захватывает интерференционные картины между рассеянным лазерным светом и коллинеарным опорным лучом на цифровом датчике для реконструкции трехмерной (3D) информации о микроскопических объектах40,41. LSIT упрощает этот подход, используя частично когерентный светодиод, микроотверстие и КМОП-сенсор для захвата дифракционных картин (т.е. теневых изображений) ячеек 42,43,44,45. Обоснование этого метода основано на наблюдении, что активация иммунных клеток часто вызывает морфологические изменения, включая вариации в размере, форме, цитоплазматической зернистости и структуре ядра 46,47,48,49,50. LSIT очень чувствителен к этим изменениям, которые оказывают непосредственное влияние на дифракционные картины 51,52,53.

Основываясь на чувствительности LSIT к этим морфологическим изменениям и их влиянии на дифракционные картины, данный протокол представляет собой новый метод быстрой и точной количественной оценки количества NK-клеток и функциональной активности на уровне одиночных клеток с использованием платформы Cellytics NK, далее именуемой LSIT-платформой54. Как показано на рисунке 1A, платформа LSIT объединяет обработку образцов, активацию и визуализацию теней в компактный многоканальный рабочий процесс. NK-клетки были выделены из цельной крови, стимулированы специально разработанным коктейлем стимулятора активации (ASC) и загружены в специальный чип для анализа. ASC вызывает морфологические изменения в NK-клетках в течение 1 ч после воздействия, такие как увеличение размера клеток и внутренняя сложность, которые могут быть точно обнаружены с помощью платформы LSIT55,56.

Платформа LSIT использует светодиодный источник света и CMOS-датчик для захвата паттернов DIH (теней) отдельных клеток (рис. 1B). Затем специальный алгоритм анализирует эти теневые паттерны и извлекает ключевые параметры, такие как расстояние от пика до пика (PPD), которое коррелирует с размером клетки, и стандартное отклонение ширины вторичного максимума (WSM-SD), которое коррелирует со сложностью и неравномерностью цитоплазмы (рис. 1C, D). Сравнивая значения до и после стимуляции, платформа рассчитывает составные индексы: комбинированный параметр тени (CSP = PPD × WSM-SD) и индекс врожденного иммунитета (I³), которые отражают процентное изменение CSP после активации. Причина введения CSP заключается в том, что иммунная активация включает в себя как увеличение клеток, так и повышение цитоплазматической сложности. Если полагаться только на один из двух критериев, можно пропустить пограничную активацию или пострадать от шума, такого как мусор или неравномерное освещение. CSP улучшает классификацию, требуя последовательных сдвигов в обеих метриках. Эти индексы классифицируют состояния активации различных клеточных популяций без флуоресцентного мечения или сложной обработки образцов.

Этот протокол особенно полезен для исследователей и клиницистов, которым требуется быстрый, количественный и безмаркерный метод мониторинга морфологических изменений в иммунных клетках, вызванных активацией. Он подходит для фундаментальных иммунологических исследований, доклинического скрининга лекарственных препаратов и оценки иммунотерапии, а также может использоваться в качестве диагностического или прогностического инструмента в клинических условиях, где важна быстрая оценка иммунного статуса. Этот метод требует изолированных клеточных популяций, доступа к платформе LSIT и специфического коктейля активации NK-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и были одобрены Институциональным наблюдательным советом больницы Анам при Корейском университете (номер одобрения: 2021AN0040). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Сбор и обработка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте все образцы крови человека, используя стандартные меры биобезопасности и соответствующие средства индивидуальной защиты.

  1. Соберите периферическую цельную кровь пациента в стерильную гепариновую пробирку асептическим способом.
  2. Аккуратно переверните пробирку 8-10 раз, чтобы смешать антикоагулянт с кровью.
  3. Анализируйте образец крови сразу после сбора. Если анализ откладывается, храните образец в гепаринизированной пробирке при температуре 2-8 °C и используйте в течение 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте цельную кровь. Используйте свежие образцы для сохранения клеточной целостности.

2. Выделение и активация NK-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол представляет собой оптимизированный и всеобъемлющий рабочий процесс для выделения и активации NK-клеток непосредственно из цельной крови человека с использованием набора NK Prep Kit, который состоит из набора NK Sep для выделения клеток и набора для активации NK для стимуляции. Этот набор включает в себя отрицательный отбор и стимуляцию на основе магнитных шариков, что обеспечивает быструю фенотипическую оценку с помощью платформы безлинзовой визуализационной цитометрии.

  1. Предтестовая настройка
    1. Достаньте наборы из холодильника и доведите их до комнатной температуры (15-28 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В комплект NK Sep входят следующие компоненты:
      (a) Зеленая крышка: Реакционная трубка, содержащая коктейль антител.
      b) Красная крышка: Разделительная трубка 1, содержащая магнитные частицы в разбавляющей среде (1,5 мл).
      c) Фиолетовая крышка: Разделительная трубка 2, содержащая магнитные частицы.
      (d) Серая крышка: Восстановительная трубка (чистая и пустая).
      В комплект активации NK входят следующие компоненты:
      (a) Транспортное средство: Восемь прозрачных трубок в герметичном алюминиевом пакете.
      (b) ASC: Восемь желтых трубок в герметичном алюминиевом пакете.
      Извлеките из запечатанных пакетов только необходимые трубки. Запечатайте и охладите все неиспользуемые компоненты.
    2. Подготовьте необходимое оборудование: магнитный сепаратор, пипетки со стерильными наконечниками, а также откалиброванный инкубатор или нагревательный блок, установленный на 37 °C.
  2. Процедура выделения NK-клеток
    1. Добавьте 0,5 мл цельной крови в реакционную пробирку с зеленым колпачком, содержащим коктейль антител. Аккуратно перемешайте, перевернув трубку 2-3 раза, и выдерживайте 5 минут.
    2. Переложите все содержимое в разделительную трубку 1 с красной крышкой. Аккуратно перемешайте 2-3 раза.
    3. Поместите пробирку на магнитный сепаратор и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Установив магнит, перенесите примерно 1,5 мл надосадочной жидкости в сепараторную трубку 2 с фиолетовым колпачком. Аккуратно перемешайте 2-3 раза.
    5. Поместите разделительную трубку два на магнитную подставку и инкубируйте в течение 10 минут.
    6. Не снимая магнита, перенесите примерно 1,0 мл надосадочной жидкости в восстановительную пробирку с серой крышкой. Тщательно перемешайте.
  3. Активация NK-клеток
    1. Добавьте 100 мкл выделенной суспензии NK-клеток в пробирку транспортного средства и еще 100 мкл в пробирку ASC
    2. Тщательно перемешайте содержимое двух тюбиков.
    3. Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте откалиброванный нагревательный блок для поддержания постоянной температуры инкубации.

3. Визуализация и анализ с помощью платформы LSIT

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки следует анализировать сразу после инкубации. Если немедленный анализ невозможен, храните инкубированные клетки при температуре 2-8 °C и анализируйте их в течение 6 часов. Платформа LSIT оценивает морфологию и количество клеток в образцах крови человека с помощью DIH. Для анализа иммунной активности как нестимулированные, так и ASC-стимулированные NK-клетки были загружены на специальное предметное стекло, вставлены в устройство и автоматически визуализированы.

  1. Настройка и калибровка устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда выполняйте фоновую калибровку перед анализом образца.
    1. Включите платформу LSIT. Убедитесь, что светодиод, вентилятор и камера работают.
    2. Запустите программное обеспечение LSIT Capture . Авторизуйтесь, введя свой ID и пароль.
    3. Перейдите в раздел «Настройки » и выберите «Калибровать».
    4. Нажмите кнопку «Открыть» на сенсорном экране или используйте физическую кнопку раздвижной двери, чтобы открыть дверь. Когда ящик откроется, снимите калибровочный слайд и уберите его на хранение.
    5. Убедитесь, что тестовое стекло отсутствует. Закройте ящик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только оптические салфетки для очистки поверхностей предметных стекол.
    6. Нажмите « Установить фон », чтобы откалибровать оптическую интенсивность.
    7. Установите на место калибровочный слайд и закройте ящик.
    8. Нажмите « Начать калибровку».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на устройство пролилась жидкость, немедленно выключите его. Протрите его начисто. Не разбирайте устройство.
  2. Подготовка и загрузка предметного стекла
    1. Извлеките предметное стекло из пакета, пометьте его данными образца и положите на чистую плоскую поверхность.
    2. Пипетка 10 мкл транспортного (нестимулированного) образца в каналы А и В.
    3. Пипетка 10 мкл ASC-стимулированного образца в каналы C и D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков и переполнения.
    4. Нажмите «Открыть », чтобы извлечь ящик, снимите калибровочный слайдер и поместите его в ящик для хранения.
    5. Вставьте подготовленное предметное стекло и нажмите Закрыть.
  3. Получение изображения: Тестовое меню 1 - Активность NK-клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение изображения не удается, проверьте освещенность и громкость образца. При необходимости выполните повторную калибровку.
    1. Войдите в систему LSIT и выберите тест активности NK-клеток на главном экране.
    2. Введите идентификатор образца или воспользуйтесь сканером штрих-кода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить идентификатор образца из архивного списка, используйте кнопку Восстановить.
    3. Нажмите кнопку Захват, чтобы начать запись.
    4. После захвата изображения нажмите «Анализировать»
    5. Проверьте активность NK-клеток (%) и количество клеток, отображаемых на экране.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимые результаты отображаются в числовом виде. Если I3 находится ниже диапазона, отображается "≤100%". Над диапазоном отображается «>300%».
    6. Загрузите результаты на USB-накопитель или распечатайте их с помощью меню с сенсорным экраном.
  4. Получение изображения: Тестовое меню 2 - подсчет ячеек
    1. Выберите опцию «Подсчет ячеек» в меню «Тест» 2 в главном интерфейсе.
    2. Загрузите 10 μл образца в новый канал для анализа.
    3. Вставьте предметное стекло, закройте ящик и введите идентификатор образца.
    4. Введите коэффициент разрежения, если применимо.
    5. Нажмите Count.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если результат находится в пределах испытательного диапазона, количество NK-ячеек отображается в виде числового значения на экране системы. Для результатов ниже испытательного диапазона отображается «≤ 10 клеток/мкл», для результатов выше «> 1 000 клеток/мкл».
    6. Отображение результатов в виде клеток/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переключите черное поле результата, чтобы просмотреть фактическое количество ячеек на изображениях.
    7. Просмотрите результаты и загрузите или распечатайте их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что введен правильный коэффициент разбавления для получения точных результатов.

4. Очистка после анализа

  1. Откройте ящик с помощью кнопки «Открыть » или физического тумблера.
  2. Снимите использованное предметное стекло.
  3. Поместите калибровочный слайдер обратно в ящик, чтобы защитить датчик.
  4. Закройте ящик.
  5. Утилизируйте использованные пробирки, наконечники и предметные стекла в соответствии с правилами утилизации лабораторных отходов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя этому протоколу, платформа LSIT позволяет количественно оценить активацию NK-клеток без меток на основе морфологических изменений в клетках. На рисунке 2А показаны окрашенные гема-3 цитоспиновые препараты первичных NK-клеток от здоровых доноров после 2-часовой инкубации с ASC или без него. Активация с помощью ASC приводит к заметным изменениям, в первую очередь к увеличению клеток и увеличению внутренней сложности или гранулярности, по сравнению с контрольной группой с носителем (без ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой стандартизированный, не требующий меток метод количественной оценки активации NK-клеток, который сочетает в себе выделение и активацию клеток с помощью набора NK Prep Kit с анализом с помощью платформы LSIT. Он предлагает быструю и количественную альтернативу традиционным анализам, таким как высвобождение 51Cr, проточная цитометрия и ИФА. Протокол разработан для лабораторий, оснащенных платформой LSIT, и позволяет получить простые резу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

I.L., S.H., H.S.J. и S.S. являются аффилированными лицами Metaimmunetech Inc., компании, участвующей в разработке и коммерциализации платформы LSIT, представленной в этом исследовании. В частности, H.S.J. является основателем и генеральным директором, S.H. — генеральным директором, а S.S. — техническим директором компании. Тем не менее, авторы утверждают, что результаты и интерпретации в этой рукописи представлены объективно и не подвержены влиянию коммерческих интересов любого рода. Все остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Данное исследование было поддержано Программами фундаментальных научных исследований Национального исследовательского фонда (NRF) Кореи (Грант #: RS-2024-00353675, Грант #: 2021R1I1A3056109), Программой поддержки ITRC (Исследовательский центр информационных технологий) под надзором IITP (Институт планирования и оценки информационных и коммуникационных технологий) и Агентством по содействию коммерциализации результатов исследований и разработок (COMPA), финансируемым Министерством науки и ИКТ (MSIT). Корея (Грант #: IITP-2025-RS-2023-00258971 (50%), Грант #: 2710084652), Программа поддержки Корейского института содействия морской науке и технологиям (KIMST), финансируемая Министерством океанов и рыболовства Кореи (Грант #: 20210660), и Грант Корейского университета. Авторы выражают признательность компании Metaimmunetech Inc. за их сотрудничество, основанное на технологии, переданной из Корейского университета, в разработке устройства Cellytics NK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 млАКСИГЕНMCT-175-CСтерильный, без ДНКазы/РНКазы
Предметное стеклоМетаиммунтекАС050-ГСпециальный слайд для Cellytics system
50 слайдов в коробке
Система Cellytics с программным обеспечениемМетаиммунтекКС001Безлинзовая платформа для съемки теней
Центрифуга (ротор с качающимся ковшом)ЛАБОГЕН1580Р300– 500 &крат; Диапазон G
CMOS-матрицаВ комплекте с устройством CellyticsИнтегрированныйИспользуется для дифракционной визуализации
Центрифуга CytospinНаско КореяTXT3 Центрифуга для цитотерапииДля окрашивания цитоспином
Цифровой нагревательный блок (37 °°; C)Дайхан СайентификDH. WHB00349Для инкубации клеток
Набор ИФА (ИФН-γ)НИР Система DDIF50CИФН-&гамма человека; Набор для ИФА
Guava easyCyte Flow ЦитометрМногородность0500-5005Для анализа экспрессии CD107a
Набор характеристик Hema 3ТермоФишер122-911Для окрашивания цитоспином
ИЛ-12 (Рекомбинантный человек)НИР Система DКомпонент ASC
ИЛ-2 (Рекомбинантный человек)Пепротех200-02Компонент ASC
Магнитная разделительная решеткаМетаиммунтекМ13Р8Для отделения валиков
Предметные стекла для микроскопаМариенфельд1000612Для препаратов цитоспина
Комплект активации NKМетаиммунтекMIT2301V, MIT2301AДля активации NK-клеток
Комплект NK SepМетаиммунтекMIT2301-500Для выделения NK-клеток
PE Мышь против человека CD107a, 100тестBD бионауки555801Для анализа экспрессии CD107a
Отверстие для отверстия в глазуреВ комплекте с устройством CellyticsИнтегрированныйИспользуется в освещении трапа LSIT
Пипетки (2– 20 &микро; L, 20– 200 &микро; L)АКСИГЕНТ-200-УРегулируемый объем
Слайд калибровки тенейМетаиммунтекАС050-ГДля калибровки прибора.
1 калибровочный предметный стекал в 1 коробке с пробирными стеклами
Вихревой смесительMerck СИ-0246АДля ресуспензии

Ссылки

  1. Alizadeh, E., et al. Cellular morphological features are predictive markers of cancer cell state. Comput Biol Med. 126, 104044(2020).
  2. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single cell sequencing. Clin Transl Med. 13 (1), e1159(2023).
  3. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  4. Karetin, Y. Morphometry of cellular behavior of coelomocytes from starfish Asterias amurensis. PeerJ. 9, e12514(2021).
  5. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single-cell sequencing. Clin Transl Discov. 2 (4), e162(2022).
  6. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  7. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  8. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  9. Mujal, A. M., Delconte, R. B., Sun, J. C. Natural killer cells: From innate to adaptive features. Annu Rev Immunol. 39 (1), 417-447 (2021).
  10. Paolini, R., Bernardini, G., Molfetta, R., Santoni, A. NK cells and interferons. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (2), 113-120 (2015).
  11. Cook, K. D., Waggoner, S. N., Whitmire, J. K. NK cells and their ability to modulate T cells during virus infections. Crit Rev Immunol. 34 (5), 359-388 (2014).
  12. Kaur, G., Sandeep, F., Olayinka, O., Gupta, G. Morphologic changes in circulating blood cells of COVID-19 patients. Cureus. 13 (2), e13416(2021).
  13. Hammer, Q., Cuapio, A., Bister, J., Björkström, N. K., Ljunggren, H. G. NK cells in COVID-19-from disease to vaccination. J Leukoc Biol. 114 (5), 507-512 (2023).
  14. Frutoso, M., Mortier, E. NK cell hyporesponsiveness: More is not always better. Int J Mol Sci. 20 (18), 4514(2019).
  15. Dufva, O., et al. Single-cell functional genomics reveals determinants of sensitivity and resistance to natural killer cells in blood cancers. Immunity. 56 (12), 2816-2835.e13 (2023).
  16. Song, P., Li, W., Guo, L., Ying, J., Gao, S., He, J. Identification and validation of a novel signature based on NK cell marker genes to predict prognosis and immunotherapy response in lung adenocarcinoma by integrated analysis of single-cell and bulk RNA-sequencing. Front Immunol. 13, 850745(2022).
  17. Viel, S., et al. Monitoring NK cell activity in patients with hematological malignancies. Oncoimmunology. 2 (9), e26011(2013).
  18. Strauss-Albee, D. M., et al. Human NK cell repertoire diversity reflects immune experience and correlates with viral susceptibility. Sci Transl Med. 7 (297), 297ra115(2015).
  19. Liu, S., Galat, V., Galat, Y., Lee, Y. K. A., Wainwright, D., Wu, J. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. J Hematol Oncol. 14 (1), 7(2021).
  20. Kim, J. M., et al. Assessment of NK cell activity based on NK cell-specific receptor synergy in peripheral blood mononuclear cells and whole blood. Int J Mol Sci. 21 (21), 8112(2020).
  21. Lorenzo-Herrero, S., Sordo-Bahamonde, C., González, S., López-Soto, A. Evaluation of NK cell cytotoxic activity against malignant cells by the calcein assay. Methods Enzymol. 631, 483-495 (2020).
  22. Nederby, L., Jakobsen, A., Hokland, M., Hansen, T. F. Quantification of NK cell activity using whole blood: Methodological aspects of a new test. J Immunol Methods. 458, 21-25 (2018).
  23. Meza Guzman, L. G., Nicholson, S. E. Determining activation status of Natural Killer cells following stimulation via cytokines and surface receptors. Methods Mol Biol. 2463, 181-194 (2022).
  24. Elsner, L., Dressel, R. 51Cr-release to monitor NK cell cytotoxicity. Methods Enzymol. 631, 497-512 (2020).
  25. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  26. Zarcone, D., Tilden, A. B., Cloud, G., Friedman, H. M., Landay, A., Grossi, C. E. Flow cytometry evaluation of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 94 (1-2), 247-255 (1986).
  27. Ogino, T., Wang, X., Ferrone, S. Modified flow cytometry and cell-ELISA methodology to detect HLA class I antigen processing machinery components in cytoplasm and endoplasmic reticulum. J Immunol Methods. 278 (1-2), 33-44 (2003).
  28. Lion, E., Smits, E. L. J. M., Berneman, Z. N., Van Tendeloo, V. F. I. Quantification of IFN-gamma produced by human purified NK cells following tumor cell stimulation: comparison of three IFN-gamma assays. J Immunol Methods. 350 (1-2), 89-96 (2009).
  29. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  30. Clay, T., Hobeika, A., Mosca, P., Lyerly, H., Morse, M. Assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer. Clin Cancer Res. 7 (5), 1127-1135 (2001).
  31. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry. PLOS ONE. 10 (10), e0141074(2015).
  32. Rico, L. G., Ward, M. D., Bradford, J. A., Petriz, J. Flow cytometric quantification of cytotoxic activity in whole blood samples. Curr Protoc. 1 (8), e215(2021).
  33. Kang, H., Choi, A. R., Ryu, J. H., Oh, E. J. Establishing a reference interval for flow cytometry-based NK activity (FC-NKA) assay in healthy Korean population. Lab Med Online. 13 (4), 349-355 (2023).
  34. Baik, M., et al. Label-free CD34+ cell identification using deep learning and lens-free shadow imaging technology. Biosensors. 13 (12), 993(2023).
  35. Cheon, H., et al. Cellytics: A digital inline holography platform for single cell analysis in biomedical and environmental applications. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  36. Roy, M., Jin, G., Seo, D., Nam, M. H., Seo, S. A simple and low-cost device performing blood cell counting based on lens-free shadow imaging technique. Sens Actuators B Chem. 201, 321-328 (2014).
  37. Kim, J., Lee, S. J. Digital in-line holographic microscopy for label-free identification and tracking of biological cells. Mil Med Res. 11 (1), 38(2024).
  38. Wu, Y., Ozcan, A. Lensless digital holographic microscopy and its applications in biomedicine and environmental monitoring. Methods. 136, 4-16 (2018).
  39. Baker, M., Gollier, F., Melzer, J. E., McLeod, E. Lensfree air-quality monitoring of fine and ultrafine particulate matter using vapor-condensed nanolenses. ACS Appl Nano Mater. 6 (13), 11166-11174 (2023).
  40. Palacios, F., Ricardo, J., Palacios, D., Gonçalves, E., Valin, J. L., De Souza, R. 3D image reconstruction of transparent microscopic objects using digital holography. Opt Commun. 248 (1-3), 41-50 (2005).
  41. Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (20), 11301-11305 (2001).
  42. Shin, S., et al. Field-portable seawater toxicity monitoring platform using lens-free shadow imaging technology. Water Res. 230 (119585), 119585(2023).
  43. Su, T. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  44. Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T. W., Tseng, D., Ozcan, A. Lensless on-chip imaging of cells provides a new tool for high-throughput cell-biology and medical diagnostics. J Vis Exp. (34), e1650(2009).
  45. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Kim, Y. J., Seo, S. Low-cost telemedicine device performing cell and particle size measurement based on lens-free shadow imaging technology. Biosens Bioelectron. 67, 715-723 (2015).
  46. Vaghashiya, R., et al. Machine learning based lens-free shadow imaging technique for field-portable cytometry. Biosensors. 12 (3), 144(2022).
  47. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Seo, S. Staining-free cell viability measurement technique using lens-free shadow imaging platform. Sens Actuators B Chem. 224, 577-583 (2016).
  48. Cheon, H., et al. Multichannel Cellytics for rapid and cost-effective monitoring of leukocyte activation. Biosensors. 15 (3), 143(2025).
  49. Lee, A., et al. Quantification of natural killer cell activation using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac Rim. CMP15A_02. , (2022).
  50. Seo, D., Oh, S., Lee, M., Hwang, Y., Seo, S. A field-portable cell analyzer without a microscope and reagents. Sensors. 18 (1), 85(2017).
  51. Seo, D., et al. Field-portable leukocyte classification device based on lens-free shadow imaging technique. Biosensors. 12 (2), 47(2022).
  52. Baik, M., et al. Machine learning based CD34+ cell detection using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac. 2022, 1-2 (2022).
  53. Roy, M., Seo, D., Oh, S., Chae, Y., Nam, M. H., Seo, S. Automated micro-object detection for mobile diagnostics using lens-free imaging technology. Diagnostics. 6 (2), 17(2016).
  54. Lee, I., et al. Use of a platform with lens-free shadow imaging technology to monitor natural killer cell activity. Biosens Bioelectron. 261 (116512), 116512(2024).
  55. Jang, H., et al. Investigation of NK cell activity in healthy and immunocompromised individuals using lens-free shadow imaging technology. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  56. Lee, A., Lee, I., Nam, M. H., Jun, H. S., Seo, S. Single cell-based rapid natural killer cell activity measurement by using lens-free shadow imaging technology. Proc SPIE Biophotonics Immune Responses. 123800H, (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NK

Похожие статьи