Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сверхинформативная химическая визуализация с помощью широкополосной когерентной антистоксовской рамановской микроскопии и двухфотонной флуоресцентной микроскопии в течение жизни

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье демонстрируется мультимодальная платформа визуализации, сочетающая широкополосное когерентное антистоксово-рамановское рассеяние (BCARS), двухфотонную возбуждающую флуоресценцию (TPEF) и двухфотонную флуоресцентную микроскопию в течение жизни (2p-FLIM), что позволяет проводить химическую биовизуализацию со сверхвысоким содержанием информации.

Аннотация

Спектроскопия комбинационного рассеяния света и флуоресцентная визуализация в течение жизни являются новыми инструментами для изучения метаболических профилей биологических образцов. В то время как спектроскопия комбинационного рассеяния света обнаруживает собственные молекулярные колебания, отражающие молекулярный состав и химическое окружение образца, флуоресцентная визуализация измеряет изменения времени жизни флуорофоров в возбужденном состоянии, чувствительных к их микроокружению. В данной работе мы представляем мультимодальную платформу визуализации, сочетающую широкополосное когерентное антистоксово-рамановское рассеяние (BCARS) и двухфотонную флуоресцентную микроскопию времени жизни (2p-FLIM), которая может получать биологически значимые спектры комбинационного рассеяния света и флуоресцентные сигналы жизни in vivo и одновременно. Огромная химическая информация, полученная из пространственно совмещенных изображений BCARS и 2p-FLIM, позволяет нам охарактеризовать тонкие различия между субклеточными компартментами и проверить потенциальные ложноположительные результаты, полученные только при флуоресцентной визуализации. Это демонстрируется путем прямого сравнения сигналов BCARS, 2p-FLIM и двухфотонной возбуждающей флуоресценции (TPEF), одновременно полученных от одной и той же окрашенной красителем органеллы в живой, неповрежденной C. elegans , экспрессирующей маркер зеленого флуоресцентного белка (GFP). В этой работе мы представляем схему настройки BCARS/2p-FLIM/TPEF, этапы получения изображений, обработку данных и репрезентативные результаты, показывающие, что метод кросс-модальной визуализации обеспечивает точную характеризацию и обнаружение in vivo при субклеточном разрешении. Этот протокол обеспечивает основу для одновременной химической и флуоресцентной визуализации в течение жизни для повышения точности биологической интерпретации в сложных живых системах.

Введение

Одной из задач биологических исследований является точное обнаружение биологических строительных материалов в их естественном состоянии и в неповрежденной архитектуре клеток и тканей. Рамановская спектроскопия демонстрирует беспрецедентный потенциал для обнаружения внутренних метаболитов и химических веществ в биологических образцах и недавно была признана новым инструментом для метаболического профилирования биологических образцов1. Анализируя пики различных метаболических групп, показанных в спектрах комбинационных отпечатков пальцев, все больше доказательств показывает, что признаки отпечатков пальцев могут быть использованы для выявления ранних стадий таких заболеваний, как рак 2,3,4, сердечныерасстройства 5,6 и нейродегенеративные заболевания 7,8 и особенно полезны для решения фундаментальных биологических проблем 9,10 включая визуализацию внутриклеточных структур без каких-либо возмущений11, дифференцировку различных состояний клеток12,13 и классификацию типов клеток 14,15,16. Большая часть химической информации (> 90%), закодированной в спектрах комбинационного рассеяния, находится в области отпечатков пальцев (от 500 до 1800 см-1), что делает эту область наиболее полезной для различения химических составов в биологических образцах. Однако слабый комбинационный сигнал в этом диапазоне частот затрудняет применение спектроскопии отпечатков пальцев комбинационного рассеяния света в биологических исследованиях, особенно для живых, неповрежденных биологических образцов1.

Подходы когерентной комбинационной визуализации (CRI) значительно сокращают время регистрации сигналов комбинационного рассеяния, но большинство из них приобретают относительно узкие спектральные сегменты и оптимизированы для сильных сигналов растяжения CH в диапазоне от 2800 до 3100 см-1. Узкополосные CARS и вынужденное комбинационное рассеяние (SRS) (рис. 1A, B) используют два пикосекундных импульса, обычно для получения узкой части сильного сигнала CH 18,19,20,21,22,23. Мультиплексные подходы CRI, такие как мультиплексные CARS (рис. 1C), используют комбинацию пикосекундных импульсов и импульсов ~100 фс для получения умеренного спектрального диапазона (обычно ≤ 400 см-1), обычно в области CH 24,25,26,27,28,29,30. Получение полного биологически значимого спектра комбинационного рассеяния света (от 600 до 3200 см-1) на пиксель с использованием этих подходов к визуализации обычно является непомерно трудоемким, поскольку большинство сигналов отпечатков пальцев в 10-100 раз слабее, чем сигналы CH-растяжения31. В отличие от большинства подходов CRI, широкополосное когерентное антистоксово комбинационное рассеяние (BCARS) оптимизировано для одномоментного широкополосного сканирования, которое охватывает области отпечатков пальцев и CH-растяжения 31,32,33. BCARS использует внутриимпульсные взаимодействия импульса ~10 фс для эффективного возбуждения низкочастотных (отпечатков пальцев) вибраций (Рисунок 1D) и использует тот же механизм, что и мультиплексный CARS, комбинацию импульса fs с импульсом ps для генерации колебательной когерентности в области растяжения CH (Рисунок 1C)32,33. Кроме того, сигналы BCARS по своей сути калибруются благодаря их взаимодействию с нерезонансным фоном (NRB), что приводит к количественному и инструментально-инвариантному полному спектру комбинационного рассеяния света на лазерный импульс в каждом пикселе31, с возможностью быстрого получения высокоинформативных данных от клеток, интактных тканей и живых биологических организмов 32,34,35,36,37.38,39.

Полученные исходные спектры BCARS содержат сильный так называемый «нерезонансный фон» (NRB). NRB — это вклад электронного отклика на лазерные импульсы, который не является химически специфичным. NRB когерентно интерферирует с вибрационно резонансным сигналом, действуя как гетеродинный усилитель32. NRB также искажает лежащий в основе спектр комбинационного рассеяния света (рисунок 2A), но спектр комбинационного рассеяния может быть восстановлен при условии получения значительных смежных спектральных сечений. В настоящее время не существует метода постобработки, позволяющего отделить резонансный сигнал CARS от нерезонансной составляющей с помощью узкополосного подхода CARS. Извлечение комбинационного сигнала из широкополосного сигнала CARS может быть достигнуто с помощью соотношения Крамерса-Кронига во временной области (или преобразования Гильберта)33,40 (рис. 2B), максимальной энтропии41,42 или машинного обучения 43,44,45,46,47,48 Подходы. Обратите внимание, что первые два метода аналитически извлекают фазу (резонансный сигнал комбинационного рассеяния) из необработанных спектров BCARS, подходы машинного обучения могут сильно зависеть от приборов и обучающих моделей.

В то время как микроскопия BCARS позволяет без меток охарактеризовать метаболическое профилирование биологических образцов, тот же суперконтинуумный лазер (950 - 1200 нм для установки BCARS, представленной в данной работе), используемый для генерации сигналов BCARS, может также возбуждать широкий спектр красителей, таких как красители на основе родамина, бодипи, алекса фтора и цианина, а также различные флуоресцентные белки, включая GFP и mCherry49. 50. По сравнению с однофотонным возбуждением с использованием лазеров видимой непрерывной волны (CW), многофотонная флуоресцентная микроскопия, такая как двухфотонная флуоресцентная микроскопия с визуализацией в течение жизни (2p-FLIM) и флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением (TPEF), с использованием ближнего инфракрасного (NIR) света обеспечивает большую глубину проникновения образца, возможность 3D-среза, высокую контрастность изображений и хорошее разрешение, сравнимое с современной конфокальной микроскопией, что делает ее привлекательным инструментом для биологической микроскопии. исследования 51,52. Флуоресцентная микроскопия с визуализацией в течение жизни (FLIM) с использованием метода коррелированного по времени метода подсчета одиночных фотонов (TCSPC) обнаруживает сигналы затухания флуоресценции, многократно возбуждаемые лазерным источником 53,54 с временной модуляцией53,54. Спектр флуоресценции данного флуорофора может изменяться в зависимости от факторов окружающей среды, таких как полярность растворителя, но эти изменения обычно незначительны. С другой стороны, время жизни флуоресценции часто изменяется в два или более раз в зависимости от изменений окружающей среды, таких как значения pH55, вязкость56, полярность57 и концентрация ионных частиц58,59, взаимодействия связывания, наличие гасителей или структурные изменения53,54. Это уникальное свойство времени жизни флуоресценции обеспечивает дополнительный контраст сигнала при флуоресцентной визуализации и успешно решает проблемы автофлуоресцентной интерференции при визуализации клеток и тканей60, расмешивания множественных флуорофоров с использованием спектрально разрешенного подходаFLIM 61, диагностики и мониторинга лечения рака62, безмаркерного обнаружения клеточной гетерогенности63 и метаболических изменений64,65.

В этой работе мы представляем мультимодальную платформу визуализации, объединяющую BCARS, 2p-FLIM и TPEF. Насколько нам известно, это первый раз, когда представлена платформа визуализации, позволяющая одновременно получать изображения BCARS и 2p-FLIM/TPEF. Мы демонстрируем возможности визуализации этого инструмента in vivo с использованием широко используемого генетически управляемого модельного организма Caenorhabditis elegans (C. elegans). Мы показываем, что спектры BCARS, распады 2p-FLIM красного Нила (жизненно важного липидного красителя) и двухфотонные флуоресцентные сигналы GFP зарегистрированного липидного маркера (DHS-3::GFP) могут быть одновременно получены in vivo от червей, окрашенных в красный цвет Нила. Представленное здесь практическое руководство по подходу к визуализации включает в себя: (i) образец должен быть оптически прозрачным и иметь толщину, как правило, менее 100 мкм; (ii) условия окрашивания могут быть различными в зависимости от красителей и образцов. В приведенных здесь результатах окрашивания C. elegans в нильском красном концентрация нильского красного находится на уровне ~μM, а время окрашивания может варьироваться от нескольких часов до ночи66; (iii) для предотвращения утечки видимого света в детекторы 2p-FLIM/TPEF требуется темная среда для отбора проб. Эти условия визуализации идентичны условиям визуализации большинства нелинейных оптических и флуоресцентных микроскопий. Кроме того, наша система, продемонстрированная здесь, может быть применена для обнаружения других красителей и флуоресцентных репортеров в дополнение к Nile Red и GFP путем введения дополнительного лазера Ti:Sapphire fs, который охватывает диапазон 700-950 нм для двухфотонного флуоресцентного возбуждения. Таким образом, в то время как репрезентативные результаты, описанные в этом протоколе, представляют собой визуализацию in vivo окрашенного красителем C. elegans, экспрессирующего GFP, платформа химической биовизуализации со сверхвысоким содержанием информации имеет широкое и далеко идущее применение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. В . Подготовка образцов elegans и окрашивание Nile Red Vital

ПРИМЕЧАНИЕ: C. elegans активно используется для различных методов визуализации из-за его прозрачности всего тела. Внутренние органы и ткани могут быть легко визуализированы у интактного животного без вскрытия. Кроме того, этическое одобрение не требуется для исследований с участием C. elegans, поскольку они не считаются позвоночными и не подпадают под те же этические нормы, что и высшие животные, такие как грызуны. В этом разделе описывается синхронизация червей C. elegans и подготовка образцов, окрашенных в красный цвет Нила, к флуоресцентной визуализации. Синхронизированные однодневные взрослые черви получают с помощью протокола откладывания яиц двух поколений и окрашивают с использованием свежеприготовленных планшетов Nile Red-OP50.

  1. Поддерживайте штаммы C. elegans (например, N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) на стандартных планшетах для роста нематод (NGM), засеянных бактериями OP50 при 20 °C.
  2. Синхронизация червей
    1. Соберите 10-20 взрослых червей на свежеприготовленную тарелку NGM, засеянную OP50.
    2. Инкубируйте тарелку при температуре 20 °C в течение 1-3 часов, чтобы дать возможность отложить яйца.
    3. Удалите всех взрослых червей, оставив на тарелке только свежеснесенные яйца.
    4. Инкубируйте планшет при температуре 20 °C до тех пор, пока черви не достигнут однодневной взрослой стадии.
    5. Повторите описанные выше шаги для создания дополнительной генерации, чтобы повысить точность синхронизации.
  3. Приготовьте раствор бульона Nile Red
    1. Растворите 15,92 мг нильского красного в 10 мл ДМСО до конечной концентрации 5 мМ.
    2. При необходимости обрабатывайте ультразвуком в течение 10-30 минут, чтобы способствовать растворению.
  4. Подготовьте пластины для окрашивания Nile Red-OP50.
    1. Тщательно перемешайте бактериальную суспензию OP50 с массой Nile Red для достижения конечной концентрации Nile Red 5 μM на планшет NGM. Например, смешайте 10 μL бульона Nile Red с 20 μL бактериальной суспензии OP50, а затем немедленно нанесите всю смесь на незасеянную 6 см (с объемом ~10 мл) агаровую пластину NGM, чтобы получить окончательную концентрацию Nile Red 5 μM на тарелку NGM.
    2. Равномерно распределите смесь по незасеянным 6 см пластинам NGM.
    3. Храните тарелки в темноте при комнатной температуре в течение ночи, чтобы обеспечить рост бактерий и впитывание красителя.
  5. Окрашивание синхронизированных червей
    1. Пересадите 30-50 синхронизированных однодневных взрослых червей на каждую подготовленную пластину Nile Red-OP50.
    2. Перед визуализацией червей инкубируйте в темноте при температуре 20 °C в течение 1-2 часов.
  6. Иммобилизация червей для визуализации
    1. Нанесите каплю 100 мМ азида натрия на 2% агарозную подушечку на предметное стекло микроскопа (примерно 10-15 мкл на 20 червей)
    2. Перенесите окрашенных червей в каплю с обезболивающим средством (азидом натрия) и накройте червей покровным стеклом перед началом микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При отборе 10-20 взрослых особей на свежеприготовленную пластину NGM OP50 на первом этапе синхронизации яйцекладки, выбирайте только взрослых особей, но не случайные яйца или личинки. Это необходимо для того, чтобы убедиться, что все оставшиеся яйца на тарелках произведены отобранными червями в течение 1-3 часов яйцекладки. Кроме того, азид натрия относится к опасным веществам, хотя для обезболивания нематод требуется его очень небольшое количество. Использование и утилизация отходов азида натрия должны осуществляться в соответствии с рекомендациями отдела охраны окружающей среды, здоровья и безопасности учреждения.

2. Генерация пучка зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол описывает генерацию пикосекундного (пс) зондирующего пучка с использованием самодельного оптического параметрического генератора (ОПГ) с последующей генерацией второй гармоники (ГСП) с помощью собственной системы обратной связи сигнала для стабилизации выходной мощности зондирующего пучка.

  1. Включите лазер накачки ОПГ с длиной волны 1030 нм (Рисунок 3А или лазер ОПГ с близкой скоростью 1 пс, ~3 Вт, показанный на Рисунке 4) и дайте не менее 2 часов для теплового равновесия. Стабильная производительность имеет решающее значение для работы ОПГ.
  2. Направьте выход в полость ОПГ
    1. Выберите подходящий период полирования на кристалле OPO PPLN (рисунок 3A) в соответствии с длиной волны целевого сигнала.
    2. Направьте луч в первое изогнутое зеркало (КМ) (рис. 3А), образующее часть линейной полости.
    3. Убедитесь, что луч проходит через периодически поляризованный кристалл ниобата лития (PPLN) OPO (Рисунок 3A) для облегчения оптического параметрического преобразования (Рисунок 3B).
    4. Убедитесь, что луч отражается от второго изогнутого зеркала (CM), а затем от торцевого зеркала (EM) (Рисунок 3A), образуя петлю полости.
    5. Сконфигурируйте выходной ответвитель (OC) (рис. 3A) для извлечения генерируемого сигнального луча из резонатора.
  3. Отрегулируйте температуру кристалла OPO PPLN с помощью регулятора температуры (TC) (рис. 3A) для выбора длины волны сигнала. Типичная длина волны сигнала составляет 1530 нм, что соответствует выходной мощности примерно 0,8 Вт при накачке 3 Вт при длине волны 1064 нм.
  4. Оптимизация выравнивания OPO
    1. Отрегулируйте положение и наклон двух CM и EM для максимизации выходной мощности и качества луча.
    2. Отрегулируйте длину резонатора, чтобы сместить спектр сигнала к нужной частоте.
  5. Направьте сигнальный луч OPO через набор коллиматорной и фокусирующей оптики и направьте его в столик ГСП.
    1. Выберите подходящий период полирования на кристалле SHG PPLN (рис. 3A) в соответствии с длиной волны целевого сигнала.
    2. Точно контролируйте температуру кристалла с помощью терморегулятора для максимальной эффективности SHG.
    3. Направьте луч в кристалл SHG PPLN для генерации второй гармоники, преобразуя сигнал OPO с длиной волны 1530 нм в сигнал с длиной волны 765 нм (рис. 3C). Типичная эффективность преобразования ГСП составляет около 30% при оптимальных условиях юстировки.
    4. Вставьте короткочастотный фильтр с длиной волны 1300 нм (SPF на рисунке 3A, технические характеристики в таблице материалов) после SHG PPLN для удаления остаточного основного света с длиной волны 1530 нм.
    5. Коллимируйте полученный луч с длиной волны 765 нм с помощью подходящей линзы (как L на рисунке 3A).
  6. Реализация стабилизации мощности
    1. Используйте клиновое окно (WW) для выборки луча SHG и направьте его на фотодиод (PD).
    2. Убедитесь, что контур обратной связи сравнивает сигнал фотодиода (PD на рисунке 3A) с эталонным значением и приводит в действие пикомотор на торцевом зеркале (EM) для регулировки длины резонатора OPO в режиме реального времени, тем самым стабилизируя выходную мощность SHG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить эталонное значение, сначала отсканируйте положение ЭМ с помощью пикомотора во время записи выходной мощности SHG. Определите пиковую интенсивность в этом профиле, затем установите эталонное значение на 90% от пика. Этот выбор обеспечивает четкое направление коррекции обратной связи, что позволяет системе компенсировать как возрастающие, так и уменьшающиеся тенденции мощности и эффективно стабилизировать выходную мощность с течением времени.

3. Генерация суперконтинуума (SC) для BCARS

ПРИМЕЧАНИЕ: Упрощенная схема мультимодальной системы на основе BCARS показана на рисунке 4. Этот протокол описывает генерацию пучка SC.

  1. Отрегулируйте pre-chirp (групповую дисперсию задержки, GDD) на фемтосекундный (fs) импульсный выход (1030 нм, 150 fs, ~1 W), чтобы получить достаточно широкую полосу пропускания SC, охватывающую сигналы области отпечатков пальцев (полоса пропускания SC ≥ 1800 см−1). Для этого необходимо отрегулировать расстояние между парой решеток (см. рис. 4), что позволяет точно контролировать дисперсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Применение предварительно компенсированного GDD имеет решающее значение для генерации желаемого импульса и оптимизации генерации SC. Требуемое значение GDD может варьироваться в зависимости от конкретных характеристик используемой лазерной системы.
  2. Используйте телескоп-луч, состоящий из двух линз с одинаковыми фокусными расстояниями, чтобы регулировать расходимость луча накачки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда луч проходит более нескольких метров перед входом в расширяющееся волокно, точный контроль расходимости луча становится необходимым. Поддержание коллимированного луча на этом расстоянии имеет решающее значение для обеспечения эффективной генерации КА.
  3. Настройте автовыравниватель (рис. 4) с помощью кинематических креплений зеркал, оснащенных пьезоприводами для управления лучом. Объедините их с оптическими призмами и детектором позиционирования (PSD) для активного мониторинга и корректировки выравнивания луча.
  4. Расположите компоненты таким образом, чтобы расстояние от призмы до первого зеркала было равно расстоянию от призмы до первого PSD. Такая симметричная конфигурация обеспечивает стабильность направления луча в расширяющееся волокно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активное выравнивание имеет важное значение для максимизации эффективности спектрального расширения и минимизации риска повреждения входного волокна.
  5. Используйте полуволновую пластину (HWP) и поляризационный светоделитель (PBS) для управления мощностью лазера перед подключением к волокну. Вращайте HWP, чтобы отрегулировать угол поляризации относительно PBS, тем самым настраивая передаваемую мощность. Хотя эти компоненты не показаны на рисунке 4, они имеют решающее значение для безопасной юстировки и управления мощностью.
  6. Соедините примерно 1 Вт мощности лазера с 10-сантиметровым фотонным кристаллическим волокном (PCF) с поддержанием поляризации большой моды (LMA-PM-5) с помощью оптоволоконного соединителя. Процедура сопряжения выглядит следующим образом:
    1. Во-первых, уменьшите мощность лазера до ~20-50 мВт во время первоначальной юстировки, чтобы избежать повреждения волокна.
    2. Направьте коллимированный луч в волокно, обеспечивая попадание света с другой стороны. Оптимизируйте траекторию луча, регулируя его положение, чтобы максимизировать выходную мощность.
    3. Вставьте асферическую линзу (рис. 4), снова точно настройте луч, чтобы максимизировать выходную мощность.
    4. Отрегулируйте Z-положение асферической линзы, чтобы обеспечить точную фокусировку на волокнистой грани.
    5. Повторяйте корректировку выравнивания и фокусировки итеративно, чтобы максимизировать эффективность соединения.
    6. Увеличьте мощность лазера до 1 Вт для работы.
  7. Коллимируйте полученный выход широкополосного суперконтинуума (SC) из PCF с помощью внеосевого параболического (OAP) зеркала с фокусным расстоянием f = 15 мм, как показано на рисунке 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отражающая оптика, такая как зеркало OAP, предпочтительна для широкополосных лучей, чтобы свести к минимуму хроматическую аберрацию, вносимую преломляющими элементами.
  8. Направьте выход коллимированного широкополосного суперконтинуума (SC) в призменный компрессор (рис. 4), состоящий из пары призм Шотта-Флинта (SF10).
    1. Направьте пучок SC в вершину первой призмы, чтобы инициировать спектральную дисперсию.
    2. Расположите вторую призму так, чтобы рассеянный луч проникал через ее вершину.
    3. Установите обе призмы на рельсовую систему, чтобы обеспечить грубую регулировку расстояния между призмами. Переместите вторую призму вдоль рельса, чтобы отрегулировать длину оптического пути и общее сжатие. Расстояние между ними для данной системы составляет 44 см.
    4. Установите первую призму на прецизионный столик линейного перевода. Отрегулируйте глубину вставки первой призмы, чтобы точно настроить компенсацию дисперсии.
    5. Итерационная регулировка как расстояния между призмами, так и длины вставки второй призмы для достижения оптимального временного сжатия импульса SC. Определение оптимальной временной компрессии путем сопоставления экспериментально наблюдаемого сигнала вырожденного четырехволнового смешивания (DFWM) с смоделированными результатами, учитывающими дисперсию групповой задержки (GDD) и дисперсию третьего порядка (TOD). Этот подход включает в себя моделирование процесса генерации суперконтинуума с учетом эффектов GDD и TOD, что обеспечивает эталон для ожидаемых временных и спектральных характеристик оптимально сжатых импульсов SC. Затем итерационно корректируйте параметры призменного компрессора для компенсации GDD и TOD, присутствующих в системе, до тех пор, пока экспериментальный сигнал DFWM не совпадет с предсказаниями моделирования. Типичный результат спектрального профиля КА показан на рисунке 5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Надлежащая компенсация дисперсии улучшает спектральную когерентность КА. При оптимальной юстировке выходной сигнал SC имеет мощность около 150 мВт, центральную длину волны около 1060 нм и охватывает спектральный диапазон от 950 до 1200 нм (что соответствует 1800 см−1). Эти значения могут незначительно отличаться в зависимости от выравнивания и эффективности оптоволоконной связи.
  9. Объедините пучки зонда и суперконтинуума с помощью дихроичного зеркала (см. DM на рисунке 4). Совместите их с помощью пары точечных отверстий, чтобы убедиться, что оба луча являются коллинеарными. Сфокусируйте объединенные лучи на высокочастотном фотодиоде (полоса пропускания 1 ГГц). Для обеспечения оптимального качества сигнала оба луча должны перекрываться как в пространственной, так и во временной областях. Процесс происходит следующим образом:
    1. Направьте выходной сигнал фотодиода на высокочастотный осциллограф (полоса пропускания 500 МГц). Используйте лазерный триггер в качестве опорного тактового сигнала.
    2. Заблокируйте луч зонда и измерьте импульсы КА. Запишите временные разности между импульсами КН и эталоном лазера.
    3. Заблокируйте пучок СК и измерьте импульсы зонда. Отрегулируйте линию механической задержки (как показано на рисунке 4) таким образом, чтобы импульсы пробника перекрывались по времени с импульсами SC. Убедитесь, что два луча достигают максимума одновременно.
    4. Снимите фотодиод и позвольте лучу проникнуть в микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные шаги описывают грубую регулировку перекрытия луча. Дальнейшая оптимизация для более точного выравнивания описана в шагах с 6.1 по 6.9.

4. Настройка детекции флуоресценции для 2p-FLIM и TPEF и внедрение дополнительного лазера Ti:Sapphire fs

  1. Включите лазер Ti:Sapphire и дайте ему достичь теплового равновесия. Подождите около 2 часов, чтобы обеспечить стабильную выходную мощность и наведение луча.
    Примечание: В данном исследовании визуализация TPEF и FLIM проводилась с использованием источника SC, который обеспечивает широкий спектральный охват и достаточную мощность для флуорофоров, таких как GFP и Nile Red. Ti:Sapphire лазер включен в систему в качестве дополнительного источника возбуждения для флуорофоров с двухфотонными пиками поглощения ниже 950 нм, которые могут быть неэффективно возбуждены SC.
  2. Активируйте механизм блокировки режимов на лазере Ti:Sapphire. Подтвердите стабильную блокировку режима с помощью встроенного монитора.
  3. Предварительное чирканье импульсов Ti:Sapphire для оптимального временного сжатия образца с помощью призматического компрессора. Расположите призмы в конфигурации, аналогичной описанной в шаге 3.8, и отрегулируйте длину вставки второй призмы для точной настройки длительности импульса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное временное сжатие обеспечивает пиковую интенсивность и эффективное двухфотонное возбуждение в плоскости образца.
  4. (Дополнительный) Соедините луч Ti:Sapphire с одномодовым волокном, поддерживающим поляризацию, если лазер расположен на отдельном оптическом столе. Отрегулируйте входную оптику связи и контролируйте выходное напряжение волокна, чтобы свести к минимуму потери на связь.
  5. Объедините пучок Ti:Sapphire с суперконтинуумом (SC) и зондирующими пучками с помощью дихроичного зеркала (см. точку объединения на PBS, показанную на рисунке 3). Тщательно выровняйте лучи, чтобы обеспечить пространственное перекрытие в дихроичной точке и совместное распространение по направлению к микроскопу.
  6. Направляйте объединенные пучки в микроскоп и точно настраивайте их пространственное перекрытие. Используйте флуоресцентный образец (например, предметное стекло с флуоресцентными полистирольными шариками размером 1 мкм) для проверки выравнивания пучка Ti:Sapphire относительно пути возбуждения BCARS. Отрегулируйте юстировочные зеркала Ti:Sapphire, чтобы гарантировать, что флуоресцентное излучение локализовано совместно с фокусной точкой BCARS в пределах одного и того же поля изображения. Подтвердите колокализацию путем визуализации перекрытия между изображениями BCARS и TPEF, полученными одновременно, где пространственное смещение должно быть меньше одного пикселя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение пространственного перекрытия между сигналами флуоресценции и BCARS имеет важное значение для мультимодальной регистрации изображений.
  7. Вставьте дихроичное зеркало перед входом микроскопа, чтобы отразить обратно рассеянную флуоресценцию в направлении пути обнаружения. Выберите дихроичный с подходящей длиной волны среза для эффективного отделения флуоресценции от возбуждающих пучков.
  8. Вставьте второе дихроичное зеркало ниже по потоку в пути излучения, чтобы разделить сигнал флуоресценции на две ветви детектирования:
    1. Передают длины волн ≥ 550 нм на детектор FLIM.
    2. Отражение длин волн ≤ 550 нм в направлении фотоумножителя (ФЭУ) для аналогового детектирования двухфотонной возбужденной флуоресценции (TPEF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите полосовые фильтры в каждой ветви обнаружения, чтобы блокировать остаточный возбуждающий свет и изолировать определенные полосы излучения.
  9. Подключите выход PMT к предусилителю и подайте усиленный аналоговый сигнал в устройство сбора данных (DAQ). Предоставьте общий доступ к глобальному триггеру синхронизации от программируемой пользователем вентильной матрицы (FPGA) с системой сбора данных, чтобы обеспечить временное выравнивание между модальностями визуализации (рис. 7).
  10. Подключите выход детектора FLIM к модулю коррелированного по времени однофотонного счета (TCSPC).
    1. Подключите сигнал FLIM детектора к пусковому входу модуля TCSPC.
    2. Подключите выход синхронизации лазера Ti:Sapphire (или BCARS SC) к опорному входу модуля TCSPC.
    3. Подключите глобальный триггер камеры (генерируемый FPGA) к входу синхронизации кадров модуля TCSPC для синхронизации с получением изображений с помощью линейного сканирования.

5. Настройка пути детектирования BCARS

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает настройку десканированного пути обнаружения для гиперспектральной визуализации с линейным сканированием. 1D гальваническое зеркало сканирует возбуждающий луч по оси y с временем задержки 2-4 мс на пиксель для достаточной интеграции сигнала. После каждого линейного сканирования предметный столик образца перемещается на один шаг вперед по оси X. Десканирование с помощью синхронизированного вторичного гальвозеркала имеет важное значение для поддержания постоянной пространственной регистрации спектрального сигнала на камере во время сканирования с быстрым лучом, устранения перекрестных помех сигнала между соседними пикселями и сохранения пространственно-спектральной точности39.

  1. Введите суперконтинуум (SC) и зондирующие пучки в одномерный (1D) гальвосканер (как показано на рисунке 4 и более подробно в ссылке39). Расположите сопряженное с гальваническим зеркалом заднюю апертуру фокусировочного объектива, чтобы обеспечить точное сканирование луча по полю зрения.
  2. Расширьте каждый луч с помощью расширителя отражающего луча (как показано на рисунке 4) в соответствии с задней апертурой объектива возбуждения. Это обеспечивает оптимальную фокусировку и максимальное пространственное разрешение в плоскости образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отражающую оптику для минимизации хроматической аберрации и поддержания широкополосного спектрального состава пучка SC.
  3. Поместите юстировочную мишень в плоскости задней апертуры объектива возбуждения. Отрегулируйте лучи SC и зонда таким образом, чтобы оба проходили через центр мишени, обеспечивая совмещение по оптической оси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точное пространственное перекрытие максимизирует мощность сигнала BCARS и обеспечивает максимальное пространственное разрешение в фокусной точке.
  4. Сфокусируйте пучки на образце с помощью объектива с высоким уровнем возбуждения NA (например, 1,2 NA, 60-кратный водно-иммерсионный объектив), установленного на инвертированном микроскопе.
  5. Подготовьте образец для выравнивания, поместив каплю воды между двумя покровными стеклами, чтобы создать герметичное предметное стекло микроскопа. Поместите подготовленное предметное стекло на предметный столик микроскопа и отрегулируйте фокус так, чтобы образец оказался в поле зрения.
  6. Соберите сгенерированный антистоксов сигнал при передаче с помощью объектива сбора, расположенного напротив пути возбуждения.
  7. Реализуйте систему десканирования 4f (как показано на рисунке 4) для сохранения пространственного отображения антистоксова сигнала на фиксированные ряды детектора.
    1. Ретранслируйте заднюю фокальную плоскость (BFP) собирательного объектива на ось десканирующего гальванического зеркала с помощью оптической системы 4f. Он состоит из двух прецизионных тубусных линз (см. Таблицу материалов), расположенных таким образом, чтобы:
      1. Первый объектив ставится на одно фокусное расстояние (200 мм) после BFP коллекционного объектива.
      2. Вторая линза ставится на одно фокусное расстояние перед гальваническим зеркалом.
    2. Синхронизируйте десканирующий гальванический станок с сканирующим гальваническим устройством с помощью генератора сигналов, управляемого FPGA.
    3. Интеграция 7-разрядного цифрового потенциометра в систему управления FPGA для регулировки амплитуды десканирующего гальванического излучения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Десканирующее гальваническое зеркало компенсирует угловые отклонения, создаваемые первичным сканирующим гальваническим устройством. Динамически регулируя его угол синхронно, он противодействует движению луча, гарантируя, что антистоксовский сигнал остается выровненным вдоль оптической оси, ведущей в спектрометр. Такая стабилизация необходима для поддержания пространственной регистрации на детекторе и предотвращения бокового смещения спектрального изображения во время сканирования.
  8. Настройте систему FPGA (см. Таблицу материалов) для синхронизации сканирования гальванического сканирования и запуска камеры.
    1. Генерация аналоговых выходов для сканирования и расшифровки гальванических приборов.
    2. Примите триггер входного каскада для обозначения начала каждого сканирования строки.
    3. Сигналы захвата выходного кадра подаются на научную комплементарную камеру металл-оксид-полупроводник (sCMOS) в каждой позиции сканирования.
    4. Независимое управление амплитудой десканирующего сканирования в соответствии с различными целями сбора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная последовательность импульсов FPGA включает в себя сканирующий сигнал гальванического привода, сигнал десканирующего гальванического привода, вход триггера Stage и пиксельную тактовую частоту для синхронизации кадров.
  9. Пропустите коллимированный антистоксовый сигнал через два фильтра короткого пропуска для блокировки остаточного насоса и индикатора возбуждения SC.
  10. Сфокусируйте отфильтрованный антистоксов сигнал через входную щель спектрометра на детектор sCMOS. Отрегулируйте углы сканирования и расшифровки гальвоприемников, чтобы луч сканировался параллельно длинной оси щели, выравнивая плоскость оптического изображения с резью. Такое точное выравнивание обеспечивает максимальное спектральное разрешение и минимизирует перекрестные помехи бокового сигнала в рядах детекторов.
  11. Настройте спектрометр на рассеивание антистоксова спектра по вертикали вдоль рядов камер. Выберите подходящую решетку (например, 300 линий/мм, светящуюся на длине волны 700 нм) для оптимального спектрального покрытия.

6. Оптимизация сигнала и калибровка спектрального разрешения

  1. Запустите собственное программное обеспечение для сбора данных и начните мониторинг сигнала в режиме реального времени с камеры sCMOS. Программное обеспечение для сбора данных создано на базе Python 3.8+ (Windows 10) с зависимостями, включающими драйверы Hamamatsu DCAM-API и Measurement Computing Universal Library, выводящие данные в формате HDF5. Программное обеспечение предоставляется по обоснованному запросу от автора, отвечающего за переписку.
  2. Подготовьте образец для спектральной калибровки, поместив каплю бензонитрила между двумя покровными стеклами, чтобы сформировать герметичное предметное стекло. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и сфокусируйте его с помощью объектива возбуждения.
  3. Найдите сигнал BCARS на камере sCMOS. Отрегулируйте z-положение объектива сбора, чтобы максимизировать интенсивность антистоксова сигнала.
  4. Отрегулируйте боковое положение объектива сбора, чтобы убедиться, что антистоксовый свет правильно сфокусирован через входную щель спектрометра. Такое выравнивание обеспечивает оптимальную связь со спектрометром и улучшенную спектральную точность.
  5. Оптимизируйте пространственное перекрытие между пучками суперконтинуума (SC) и зонда в плоскости выборки. Используйте зеркала на пути луча преобразователя для точной регулировки его бокового положения и угла падения.
  6. Преобразуйте оптическую линию задержки на пути луча зонда, чтобы обеспечить временное перекрытие импульсов КА. Контролируйте интенсивность сигнала и регулируйте до тех пор, пока антистоксов сигнал не станет максимальным, подтверждая надлежащую временную синхронизацию.
  7. Определите сильный, резкий рамановский пик бензонитрила (например, 1002 см-1) на изображении sCMOS.
  8. Запишите длину волны щупа и его соответствующее положение пикселей на камере. Используйте линию Рэлея (0 см-1 на длине волны зонда) и известные пики бензонитрильного комбинационного рассеяния света на 1002 см-1 и 3073 см-1 для установления линейного сопоставления пикселей и волновых чисел на детекторе sCMOS. Линия Рэлея обеспечивает нулевое волновое число, в то время как бензонитрильные пики определяют приращение волнового числа на пиксель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку для анализа требуется только информация об относительном волновом числе (отображение положения пикселя и комбинационного сдвига), абсолютная калибровка длины волны с использованием эмиссионных ламп не требуется.
  9. Введите сопоставление пикселей и волновых чисел в программное обеспечение для сбора данных. Эта калибровка должна оставаться действительной, если не будут внесены изменения в оптический путь, настройку решетки в спектрометре или юстировку.

7. Регистрация сигналов

  1. Загрузите образец C. elegans , приготовленный на шагах с 1.1 по 1.6, на предметный столик микроскопа. Найдите интересующую вас область и сфокусируйте ее с помощью цели возбуждения.
  2. Определите область на слайде, в которой отсутствует активный сигнал Рамана (водяной фон или покровное стекло без стекла), которая будет служить в качестве эталона нерезонансного фона (NRB).
  3. Найдите сигнал BCARS на детекторе sCMOS. Выполните точную настройку z-положения объектива сбора, чтобы максимизировать интенсивность антистоксова сигнала.
  4. Отрегулируйте боковое положение объектива для сбора данных, чтобы убедиться, что антистоксовый свет правильно выровнен через входную щель спектрометра.
  5. Запустите синхронизированное сканирование и десканирование зеркальных зеркал с помощью FPGA. Регулируйте амплитуду десканирующего гальванометра с помощью цифрового потенциометра до тех пор, пока угловое отклонение от первичного сканирования не будет полностью компенсировано. Антистоксовый сигнал должен оставаться ограниченным в пределах ~12 рядов на камере по всему диапазону сканирования.
  6. Определение временной последовательности сбора данных
    1. Получение сигнала взаимной корреляции между импульсами КН и зондом путем задержки импульса зонда. Чтобы получить эти данные, построите график зависимости интегрированного трехцветного сигнала BCARS от временной задержки импульса зонда. Самый сильный сигнал появится в момент времени 0, когда импульсы СК и зонда временно перекрываются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку системы обнаружения FLIM и TPEF используют тот же триггер, что и BCARS, их сигналы регистрируются одновременно в течение этого момента времени.
    2. Запись с более поздней задержкой пучка зонда (например, 1-2 пс) для BCARS и более поздней задержкой пучка SC для нерезонансного фона (спектры NRB на рисунке 6A). Когда к узкополосному импульсу (пробнику) применяется временная задержка, NRB в трехцветном сигнале CARS может быть эффективно подавлено, и, таким образом, отношение сигнал/шум может быть улучшено67.
    3. Получение темного изображения без временного перекрытия между SC и пробником для захвата базового шума детектора (темновой эталон).
    4. Сохраните все изображения BCARS, NRB и темные изображения, включая метаданные, в одном файле h5.
  7. Протокол обработки сигналов BCARS
    1. Откройте программное обеспечение CRIkit268.
    2. Загрузите все необходимые наборы данных с помощью инструмента Open HDF, как показано на рисунке 6B: Загрузите гиперспектральные данные BCARS, ссылку NRB и темную ссылку. Выберите частотную область в полосе генерации сигнала BCARS с помощью инструмента Freq Window (от 400 см-1 до ≥ 3200 см-1 для продемонстрированной здесь системы BCARS).
    3. Выполните шаги предварительной обработки:
      1. Используйте инструмент Anscombe (как показано на рисунке 6B) для стабилизации дисперсии наборов данных BCARS и NRB.
      2. Используйте инструмент «Подавление шума » для выполнения разложения сингулярных значений (SVD): Сохраняйте главные компоненты на основе визуального осмотра. Сохраните компоненты, пространственное распределение которых соответствует морфологии образца, и отбросьте компоненты, в которых преобладают неструктурированные или похожие на спеклы шумы. Этот шаг шумоподавления улучшает отношение сигнал/шум (SNR), особенно для спектральных особенностей низкой интенсивности.
      3. Используйте инструмент Инвертировать Анскомб для восстановления данных в исходном домене.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги могут быть пропущены при выполнении обработки данных в режиме реального времени при сборе данных.
    4. Получение спектров, подобных Рамане, с помощью преобразования Крамерса-Кронига (КК):
      1. Откройте инструмент KK (как показано на рисунке 6B).
      2. Включите Norm в NRB, чтобы обеспечить соответствующую нормализацию спектрального эталона.
      3. Задайте параметры, включая смещение NRB, коэффициент контактной площадки и усреднение пикселей по краям.
      4. Выполните преобразование KK для получения извлеченных спектров комбинационного рассеяния.
    5. Исправление ошибок после KK
      1. Исправление фазовых ошибок с помощью сглаживания Савицкого-Голея: Откройте инструмент коррекции фазовых ошибок (рисунок 6B). Отрегулируйте размер окна сглаживания и порядок полиномов. Проверьте исходные и скорректированные спектры с помощью панели предварительного просмотра .
      2. Исправление ошибок шкалы: Откройте инструмент коррекции ошибок шкалы (Рисунок 6B). Нормализация спектров для коррекции масштабирования относительной интенсивности по набору данных. Обеспечьте согласованность пространственных и спектральных измерений.
    6. Калибровка спектральной оси (необязательно, если она смещена): Откройте инструмент калибровки (Рисунок 6B). Сравните измеренные волновые числа с известными опорными пиками. Примените скорректированный наклон/пересечение для повторного выравнивания спектральной оси.
    7. Определение и извлечение данных из областей интереса (ROI)
      1. Используйте ROI Spect. или Pt Spect. (Рисунок 6B) для обозначения пространственных областей интереса или точек интереса на изображении BCARS.
      2. Визуализируйте и сравнивайте спектральное содержание различных ROI.
      3. Экспортируйте полученные спектры для дальнейшего количественного или хемометрического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 5 представлены измеренные спектры узкополосного зонда и импульсов широкополосного суперконтинуума (СК), используемых для возбуждения BCARS. Зондирующий импульс, генерируемый с помощью генерации второй гармоники сигнала ~1530 нм от самодельного оптического параметрического генератора (OPO, рис. 3), центрируется на длине волны 764,2 нм с полной шириной на полумаксимуме (FWHM) 0,2 нм, обеспечивая спектральное разрешение на длине волны ~6,8 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе подробно демонстрируется архитектура BCARS и платформы визуализации 2p-FLIM/TPEF. В то время как в нашей текущей установке используется лазер с двойным выходом 1030 нм, большинство мощных волоконных лазеров fs 1030 нм могут быть использованы в качестве основного лазерного источника для создания микроскопа BCARS. Тщательно выбирая длину и период кристаллов OPO/SHG PPLN, можно получить зондирующий импульс в несколько пс с помощью накачки OPO 1030 нм sub-ps. Несмотря на то, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать и у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

W-W.C. выражает признательность за поддержку со стороны NIH (R21AG086974). M.T.C. выражает признательность за поддержку со стороны Министерства энергетики США (DOE BERDE-SC0022121).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ФотоаппаратХамамацуКОСАТКА-ФЬЮЖНsCMOS, 2304× 2304 пикселей
Цель сбора данных  Олимп  LUMPLFLN60XW  Погружение в воду, 1,0 NA
Сбор данных  Прилежный  MCC USB-1208HS  Карта сбора данных
Линия задержки  Ньюпорт  ДЛ225  Механическая задержка импульса зонда
Дихроичный  Семрок  ФФ925-ДИ01  комбинированный зонд и SC
Дихроичный  Семрок  ФФ705-ДИ01  Детектирование эпимодовой флуоресценции
Дихроичный  Торлабс  DMLP550R  разделение сигнала FLIM и сигнала TPEF
Цель возбуждения  Олимп  UPLSAPO60XWIR  Погружение в воду, 1,2 NA
Фильтр  Семрок  ФФ01-1326/СП-25  Отбраковка фундаментального лазера после ГВГ
Фильтр  Семрок  ФФ01-758/СП  Отказ от фундаментального лазера перед камерой BCARS
Фильтр  Торлабс  FESH0650  Отклонение основного лазера перед модальностью флуоресценции
FLIM PMT  ПикоКвант  Гибридный PMA  Однофотонный детектор FLIM
ПЛИС  Редпитайя  STEMlab 125-14  Синхронизация и запуск сканирования
Гальво  Торлабс  ГВС101  Для сканирования и десканирования
Решётка  Когерентный  LightSmyth 1040 нм  1000 Гробов/мм, предварительное чирикование для SC
Полуволновая пластина  Торлабс  AHWP05M-980  Контроль поляризации
К-куб  Торлабс  КПА101 PSD драйвер для автовыравнивателя
Лазер  Перспективные инструменты  Система FSX-Dual  Фемтосекундный лазер с двойным выходом
Лазер  Когерентный  Мира-900  Фемтосекундный лазер для возбуждения флуоресценции
ПБС  Торлабс  ПБС255  Комбинация луча для СК и преобразователя
ПКФ  Торлабс  ЛМА-ПМ-5  Фотонное кристаллическое волокно 10 см для генерации SC
ПД  Торлабс  PDA100A2  Контур обратной связи OPO
Крепление для пьезозеркала  Торлабс  ПОЛЯРИС-К1С2П  Пьезоэлектрический регулятор для автовыравнивателя
Предусилитель  ЭдмундОптикс  59-179  Предусилитель TPEF
Призма  Оптика Lambda Research  ЭКП-30СФ10  Сжатие SC
СДП  Торлабс  ПДК80А  Позиционно-чувствительный детектор для автовыравнивания
Спектрометр  Теледайн Принстон Instruments  ИзоПлоскость 160  Решетка 300 г/мм, с центром под углом волны 700 нм
Сцена  АСИ  МС-2000  Моторизованная 3-осевая сцена
TCSPC  ПикоКвант  Мультиарфа 150  Устройство для подсчета фотонов для FLIM
ТФЭУ ФЭУ  Хамамацу  Х9305-03  Детектор ТФЭФ
Тубусная линза  Торлабс  ТЛ200-2П2  Используется в системе сканирования

Ссылки

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Визуализация времени жизни флуоресценциирамановская спектроскопия «отпечатков пальцев»двухфотонная микроскопияметаболическое профилированиесубклеточное разрешениевизуализация in vivoC. elegansзеленый флуоресцентный белок
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.