Усиливающее влияние механической стимуляции на хондрогенную функцию инфрапателлярных стволовых клеток жировых пакетов

Summary

Данное исследование направлено на разработку мультимодальной технологии, сочетающей циклическую механическую стимуляцию на растяжение (10% деформации, 1 Гц) с терапией стволовых клеток, полученных из инфрапателлярных жировых пакетов (IPFP-SC), изучение их синергетического влияния на стимулирование хондрогенной дифференцировки IPFP-SC и создание более эффективной регенеративной стратегии для инженерии хрящевой ткани.

Abstract

Инфрапателлярный жировой пакет (IPFP), специализированная фиброжировая структура в переднем отделе коленного сустава, характеризуется уникальной микроархитектурой с вкраплениями коллагеновых пучков и жировых долек, которые в совокупности определяют его вязкоупругие биомеханические свойства. Новые данные подчеркивают отличительный транскрипционный профиль IPFP-SC, в частности, их связь с медиаторами деградации хряща во время прогрессирования остеоартрита. Недавние исследования показывают, что динамическое сжатие и гидростатическое давление эффективно усиливают хондрогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, полученных как из костного мозга, так и из IPFP, ингибируя отложение кальцификации. В этом исследовании использовалась система растяжения клеток для моделирования циклических механических нагрузок в коленном суставе, продемонстрировав, что динамическая стимуляция растяжения (10% деформации, 1 Гц) значительно повышает хондрогенную дифференцировочную способность IPFP-SC. Это усиление проявлялось в повышении экспрессии хондрогенных маркеров, включая SOX9 и COMP, что подтверждает, что механическое микроокружение, специфичное для суставов, играет решающую регуляторную роль в терминальной дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток. Эти результаты предоставляют важные экспериментальные данные о стратегиях регенерации хрящевой ткани, подчеркивая важность биомеханической модуляции в регенеративной терапии для восстановления хряща.

Introduction

Регенерация и восстановление хрящевой ткани представляют собой центральную проблему в лечении остеоартрита, поскольку традиционная клеточная терапия часто не может реконструировать функциональные хрящевые матрицы из-за недостаточной регуляции микросреды. В последние годы мультимодальные^{стратегии,} объединяющие физическую механическую стимуляцию с клеточной терапией, стали горячей точкой исследований1, направленными на повышение потенциала хондрогенной дифференцировки стволовых клеток путем моделирования биомеханических микросред in vivo . Данное исследование направлено на разработку мультимодальной технологии, сочетающей циклическую механическую стимуляцию на растяжение (10% деформации, 1 Гц) с терапией IPFP-SCs, изучение их синергетического влияния на стимулирование хондрогенной дифференцировки IPFP-SC и создание более эффективной регенеративной стратегии для инженерии хрящевой ткани.

Основной целью данного исследования является повышение хондрогенной способности IPFP-SC за счет динамического растягивающего воздействия. Предыдущие исследования показали, что механические сигналы могут управлять хондрогенной дифференцировкой мезенхимальных стволовых клеток (МСК), регулируя реорганизацию цитоскелета, активацию ионных каналов (например, Piezo1) и нисходящие сигнальные пути (например, ось YAP-SOX9)². Существующая литература дает критические представления о синергетических эффектах мультимодальной стимуляции. Buckley and Kelly et al. подтвердили, что периодическое гидростатическое давление стабилизирует хондрогенные фенотипы, увеличивая sGAG и отложение коллагена II типа³. Guo et al. сообщили, что динамическое культивирование в сочетании с соответствующей механической стимуляцией способствует эффективному наращиванию клеток-предшественников, позволяя генерировать клинически значимые суставные хондроциты для восстановления хрящевого дефекта. Тем не менее, напряжение сдвига само по себе приводило к более низкой хондрогенной дифференцировке hMSCs по сравнению со статическими условиями, в то время как дополнительная сжимающая нагрузка повышала регуляцию хондрогенных маркеров, таких как Sox9, аггрекан и коллаген II типа⁴. Примечательно, что напряжение сдвига само по себе не может вызвать значительную экспрессию генов, специфичных для хряща⁵. Zhang et al. также продемонстрировали, что сочетание механической стимуляции с экзогенными факторами (например, SOX-9) значительно повышает эффективность дифференцировки⁶. Исследования показывают, что динамическое сжатие индуцирует хондрогенную дифференцировку, в то время как ингибирование пути ERK1/2 устраняет эту реакцию. И наоборот, ингибирование ERK1/2 при динамической компрессии усиливает остеогенную дифференцировку, отмеченную повышенной экспрессией щелочной фосфатазы (ЩФ), коллагена I типа (COLI) и остеокальцина (OCN)⁷. Основываясь на этих выводах, в данном исследовании растяжение рассматривается в качестве основного вмешательства, изучая ее синергетическую роль с эндогенными сигнальными путями в IPFP-SC (например, пьезо1-опосредованная активация кальциневрином)². Этот подход более тесно согласуется с мультимодальной механической средой движения суставов. Кроме того, недавние исследования, подчеркивающие пространственно-временную специфику механической^{стимуляции8} , послужили основой для разработки протокола поэтапной нагрузки в данном исследовании.

По сравнению с традиционной статичной культурой, эта технология имеет инновации в двух ключевых аспектах. Во-первых, реализуется протокол отсроченной стимуляции, чтобы избежать раннего тормозящего влияния механической нагрузки на дифференцировку. Например, Luo et al. продемонстрировали, что динамическая компрессия, применяемая через 21 день после инкапсуляции клеток, значительно усиливает хондрогенез в BMSCs⁹, принцип, интегрированный в текущий протокол загрузки. Во-вторых, прецизионная система механической стимуляции позволяет точно контролировать параметры растягивающего напряжения (интенсивность, частоту и продолжительность), воспроизводя физиологически значимые биомеханические условия. Точное управление параметрами имеет решающее значение для получения надежных результатов, так как чрезмерная механическая нагрузка может привести к повреждению клеток¹⁰, в то время как чрезмерно упрощенные механические среды могут привести к контрпродуктивным результатам¹¹. Вдохновленный передовыми мультимеханическими системами сопряжения⁵, разработанный аппарат обеспечивает стабильную и воспроизводимую стимуляцию с высокой масштабируемостью для трансляционных приложений. Кроме того, использование уникальных преимуществ IPFP-SC, включая их гомологию развития с суставным хрящом и высокий хондрогенный потенциал3, повышает клиническую осуществимость технологии.

Это исследование продвигает механистическое понимание хондрогенеза IPFP-SC и поддерживает разработку клинических стратегий восстановления хряща. Интегрируя мультимодальную механическую стимуляцию с клеточной терапией, эта технология устраняет ограничения традиционных методов и дает представление о протоколах послеоперационной биомеханической реабилитации. Таким образом, благодаря инновационной интеграции стимуляции на растяжение и терапии IPFP-SCs, данное исследование направлено на создание эффективной и контролируемой стратегии регенерации хряща. Его дизайн в значительной степени опирается на предыдущие механобиологические исследования, открывая новые возможности для клинического применения технологий тканевой инженерии.

Protocol

Исследование выполнено в соответствии с Институциональными руководящими принципами и было одобрено Комитетом по этике Народной больницы автономного района Внутренняя Монголия (SC-07/01KT2024008). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Размораживание и расширение IPFP-SC

1. Размораживание IPFP-SC.
   1. Быстро разморозьте криоконсервированные IPFP-SC (P2-P5) на водяной бане при температуре 37 °C.
   2. Перенесите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую предварительно подогретую полную питательную среду (α-DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин/стрептомицин).
   3. Центрифугировать при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежей питательной среде.
2. Разверните ячейки.
   1. Высейте клетки в две 10-сантиметровые чашки для культивирования с плотностью 5000-8000 клеток/^см2. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2.
   2. Заменяйте среду каждые 2-3 дня до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% конфлюенции.
   3. Пропускают клетки с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА и сохраняют в культуре для последующих этапов.

2. Посев клеток для хондрогенной дифференцировки

1. Приготовьте клеточную суспензию.
   1. Расщепляйте клетки с 0,25% трипсин-ЭДТА при 37 °C в течение 5 минут, когда они достигнут 80%-90% конфлюенции.
   2. Добавьте полную среду в соотношении 1:1, чтобы завершить переваривание.
   3. Центрифугировать при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежей питательной среде.
2. Засейте клетки.
   1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
   2. Разбавляют ресуспендированные клетки до плотности 4 × 10-5 клеток на камеру специализированной чашки для культивирования.
   3. Поместите камеры в инкубатор с температурой 37 °C и 5%_CO2 на 12-16 часов, чтобы обеспечить полное прикрепление клеток.

3. Хондрогенная предкультура

1. Инициируйте предварительную дифференцировку.
   1. Удалите питательную среду из камер.
   2. Дважды промойте клетки 1× DPBS (предварительно подогретым до 37 °C) для удаления остатков сыворотки и мусора.
   3. Дважды промойте клетки предварительно смешанной хондрогенной индукционной средой (без факторов роста).
   4. Замените промывочный материал на полную хондрогенную индукционную среду.
   5. Поддерживайте культуру при температуре 37 °C с 5%_CO2 в течение 3 дней.
2. Следите за морфологией клеток.
   1. Подтвердите адгезию клеток и раннюю агрегацию с помощью микроскопии.

4. Циклическая механическая стимуляция на растяжение (7-й день)

1. Подготовьте устройство для механической стимуляции.
   1. Стерилизовать устройство и камеры для культивирования 75% этанолом с последующим ультрафиолетовым облучением.
   2. Откалибруйте систему растяжения одноосных ячеек для обеспечения 10% деформации с частотой 1 Гц.
2. Инициируйте стимуляцию.
   1. Применяйте циклическое растягивающее напряжение (деформация 10%, 1 Гц) в течение 1 часа в день в течение 7 дней подряд.
   2. Поддерживайте условия окружающей среды на уровне 37 °C с 5%_CO2 в течение всего периода стимуляции.
   3. Заменяйте хондрогенную индукционную среду каждые 72 ч.
3. Настройка управления
   1. Включите параллельные камеры статического контроля без механического воздействия в идентичных условиях культивирования.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Подготовка образцов и резка
   1. Разрежьте механически стимулированную клеточную мембрану стерильными хирургическими ножницами или скальпелем в соответствии с размером и формой конфокальной чашки.
   2. Убедитесь, что обрезанный образец полностью покрывает область визуализации чашки.
2. Закрепите клетки.
   1. Дважды промойте клетки PBS.
   2. Закрепить с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
   3. Обработать 0,1% Тритоном Х-100 в PBS в течение 10 минут при РТ.
   4. Дважды постирайте с PBS.
   5. Заблокируйте 2% BSA в PBS на 30 минут при RT.
3. Морилка для маркеров.
   1. Инкубируйте образец в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе: anti-SOX9 (1:200) и anti-COMP (1:200).
   2. Промойте образец 3 раза с помощью PBS.
   3. Разбавляйте флуоресцентно-конъюгированные вторичные антитела в PBS в соотношении 1:1000.
   4. Добавьте 100 мкл разбавленного раствора вторичного антитела, чтобы покрыть образец.
   5. Инкубировать при температуре RT в течение 1 ч на орбитальном вибростенде, защищенном от света.
   6. Промойте образец 3 раза с помощью PBS.
4. Получение изображений
   1. Визуализируйте образец с помощью флуоресцентного микроскопа.
   2. Делайте снимки с постоянными настройками экспозиции.

6. Количественный анализ ПЦР (кПЦР)

1. Экстракт РНК
   1. Лизировать клетки в реагенте TRIzol.
   2. Изолируйте общую РНК в соответствии с протоколом производителя.
   3. Измерьте концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра.
2. Синтез кДНК.
   1. Выполните обратную транскрибацию 1 г РНК в кДНК с помощью набора для синтеза кДНК с высокой емкостью.
3. Проведите кПЦР.
   1. Подготовьте реакции количественной ПЦР с использованием SYBR Green Master Mix и специальных праймеров для хондрогенных маркеров (SOX9, COMP) и домашних генов.
   2. Проводите анализы в трех экземплярах на ПЦР-системе в реальном времени. Включите элементы управления без шаблонов.

7. Воспроизводимость

1. Стерильность
   1. Выполняйте все действия под ламинарным кожухом, чтобы предотвратить загрязнение.
2. Согласованность параметров
   1. Ежедневно проверяйте настройки механической стимуляции (напряжение, частота и продолжительность).
3. Реплицирует
   1. Включите не менее трех биологических репликатов для каждого состояния.
4. Нормализация данных
   1. Нормализуйте данные количественной ПЦР в соответствии с генами уборки и статическим контролем.

Results

Репрезентативные результаты данного исследования демонстрируют, что циклическая механическая стимуляция на растяжение усиливает хондрогенную дифференцировку IPFP-SC при хондрогенной индукции. В частности, IPFP-SC, подвергшиеся 7-дневной растягивающей нагрузке, продемонстрировали значительное повышение регуляции хондрогенных маркеров на обоих транскрипционных уровнях, о чем свидетельствует повышенная экспрессия SOX9 и продукция COMP по сравнению со статическими контрольными группами. Эти скоординированны...

Discussion

Описанный протокол объединяет циклическую механическую стимуляцию на растяжение (10% деформации, 1 Гц) с IPFP-SC для усиления хондрогенной дифференцировки, решая критические проблемы регенерации хряща. Ключевые этапы включают точную экспансию клеток, стадию хондрогенной предварительной культуры (3 дня), отсроченную механическую стимуляцию (начатую на 3-й день в течение 7 дней) и анализ после стимуляции с помощью иммунофлуоресценции (SOX9, COMP) и количественной ПЦР. Мех...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% параформальдегида	Биошарп	БЛ539А
Раствор для блокировки антифлуоресценции (содержащий DAPI)	Бейотим	П0131
Решение для блокировки	Бейотим	П0260
Камера для клеточных культур	АЭРОТЕК	AZ2020062530
Бак для ячеек	КЛЕТКА & СИЛА
Первичное антитело Col II	Абкам	AB34712
E.Z.N.A. HP Полный набор РНК	ОМЕГА	Р6812-00С
F-актин Первичное антитело	Протеинтек	PF00001
Фетальная бычья сыворотка	СеллМакс	СА101.02
От козы к Rb IgG	Абкам	AB50077
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus)	ЙЕЗЕН	11202ЭС50
Набор для хондрогенной индукции мезенхимальных стволовых клеток человека	Фуюаньбио	FY200008
Инвертированный биомикроскоп Leica DMi8	LEICA	ДМи8
Прибор LightCycler 96	Рош	16056
MEM-α	Gibco	C12571500BT
ПБС	Сервисбио	Г4202
Пенициллин-стрептомицин-амфотерицин В	НКМ Биотех	С100С8
Первичное антитело Piezo1	Протеинтек	15939-1-AP
Набор реагентов PrimeScript RT (Perfect Real Time)	Такара	РР037А
Первичное антитело к SOX9	Абкам	AB185230
ТритонХ-100	СКИГЕ	ИК6193
96-луночный термоамплификатор Veriti Dx	Термо Фишер	EN61326