Методическая статья

Визуализация сегрегации хромосом в живых клетках во время мейоза ооцитов мышей

809 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68847

⸱

10 октября 2025 г.

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы обобщаем методы визуализации живых клеток для изучения сегрегации хромосом в ооцитах мышей с использованием H2B-RFP для хроматина и SiR-тубулина для визуализации веретена. Мы подробно описываем подготовку образцов, микроинъекцию, культивирование, настройку визуализации и анализ, предлагая практическое руководство по достижению визуализации мейотической хромосомы с высоким разрешением и минимальной фототоксичностью.

Аннотация

Точная сегрегация хромосом во время мейоза ооцитов имеет важное значение для обеспечения правильного эмбрионального развития и предотвращения заболеваний, связанных с анеуплоидией. Визуализация живых клеток в сочетании с методами флуоресцентного мечения стала мощным подходом к изучению мейотической динамики хромосом с высоким пространственно-временным разрешением. В этом протоколе мы обобщаем ключевые методологии визуализации сегрегации хромосом в живых ооцитах мышей, уделяя особое внимание использованию гистона H2B-RFP для мечения хроматина и SiR-тубулина для отслеживания веретена. Мы описываем процедуры подготовки образцов, микроинъекции мРНК, культивирования ооцитов, настройки камеры для визуализации живых клеток и настройки конфокальной микроскопии, оптимизированные для получения изображений с высоким разрешением при минимизации фототоксичности. Кроме того, мы выделяем критически важные экспериментальные соображения, такие как фототоксичность, обработка изображений и количественный анализ мейотических событий. Предоставляя всестороннюю оценку современных методологий, этот протокол служит практическим руководством для исследователей, стремящихся исследовать динамику хромосом в живых ооцитах и повысить точность и воспроизводимость мейотических исследований.

Введение

Точная визуализация динамики хромосом и веретена во время мейоза ооцитов имеет решающее значение для понимания механизмов, которые управляют созреванием женских гамет и риском анеуплоидии 1,2,3,4,5. Ооциты млекопитающих претерпевают высокоскоординированную серию мейотических событий, включая разрушение зародышевых пузырьков (GVBD), конденсацию хромосом, сборку веретена и асимметричное деление6. Несмотря на то, что фиксированная временная визуализация предоставила ценные снимки этих процессов, ей не хватает временного разрешения, и она не может охватить переходные или быстрые события, которые происходят между интервалами выборки. В отличие от этого, визуализация флуоресцентно меченых хромосом и микротрубочек на живых клетках предлагает эффективный подход к мониторингу этих динамических процессов в режиме реального времени 2,3,7. Это позволяет напрямую наблюдать за временем, продолжительностью и последовательностью мейотических событий в отдельных ооцитах, а также позволяет идентифицировать переходные события, которые в противном случае могли бы быть пропущены в фиксированных образцах. Тем не менее, поддержание жизнеспособности и физиологической целостности ооцитов во время микроинъекций и визуализации требует тщательного обращения и оптимизированных условий8.

Этот протокол описывает комплексный рабочий процесс микроинъекции ооцитов стадии зародышевых везикул мыши (GV) с кРНК H2B-RFP, что позволяет проводить флуоресцентное мечение хроматина с последующей покадровой конфокальной визуализацией хромосом и поведением веретена на протяжении всего мейоза4. Метод включает в себя ключевые этапы, включая гормональный прайминг, выделение ооцитов, микроинъекцию в условиях контролируемой температуры и визуализацию в реальном времени с использованием конфокальной микроскопиис контролем окружающей среды. Общая цель данной статьи состоит в том, чтобы представить надежный и воспроизводимый рабочий процесс для визуализации динамики хромосом и веретена в живых ооцитах мышей в режиме реального времени, обеспечивая платформу для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе мейотической регуляции и риска анеуплоидии.

Хотя этот протокол обеспечивает высокое временное и пространственное разрешение, он полагается на экзогенную экспрессию репортера, которая может не полностью воспроизводить динамику эндогенных белков и потенциально может вмешиваться в нативные мейотические процессы при чрезмерной экспрессии. Исследователи должны учитывать эти ограничения и проверять результаты, используя дополнительные подходы, где это возможно.

Этот протокол предназначен для поддержки исследований, изучающих мейотические механизмы, ошибки сегрегации хромосом и влияние генетических или экологических возмущений на качество ооцитов. Он обеспечивает надежную платформу как для фундаментальных исследований, так и для трансляционных приложений в репродуктивной биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с протоколами, утвержденными местным Комитетом по этике животных. Экспериментальные процедуры должны строго соответствовать принципам 3R – Замена, Редукция и Уточнение. Мыши должны содержаться в аккредитованном помещении для животных в стандартных условиях окружающей среды (22 °C, влажность 60%) со свободным доступом к пище и воде.

1. Сбор и подготовка ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все оборудование и реагенты должны быть стерильными. Выполняйте работу со всеми ооцитами с помощью ротовой пипетки под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов). Покройте все капли питательной среды минеральным маслом (рисунок 1А-Е).

  1. Гормональная стимуляция
    1. Внутрибрюшинно 3-4-недельным самкам мышей вводят 5 международных единиц (МЕ) гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG; см. Таблицу материалов) за 46-48 ч до забора ооцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: B6CBAF1 мыши (потомство F1 C57BL/6J × CBA/CaCrl) являются предпочтительными из-за более высокого выхода ооцитов и благоприятных характеристик созревания.
  2. Приготовление питательных сред
    1. Фильтрующие материалы М2 и М16 (см. Таблицу материалов) с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Дополните IBMX до конечной концентрации 100 мкМ путем разбавления из 100 мМ материала.
    2. Приготовьте 5-6 капель M2-IBMX (~30 мкл каждая) и 3 капли M16-IBMX в 35 мм пластиковых чашках для культуры тканей. Все капли обмазать минеральным маслом. Поместите чашки M2-IBMX в горячий блок при температуре 37 °C (рис. 1A), а чашки M16-IBMX — в инкубатор с температурой 37 °C и 5%CO2 не менее чем за 30 минут до выделения ооцитов (рис. 1C).
    3. Приготовьте дополнительную чашку, содержащую 800-1 000 μL M2-IBMX (без масла) для рассечения яичников. Поместите на нагревательную пластину с температурой 37 °C, установленную над стереомикроскопом (рис. 1B).
  3. Выделение ооцитов
    1. Принесите мышей в жертву при шейном вывихе. Протрите нижнюю часть живота 70% этанолом, затем сделайте небольшой горизонтальный разрез на коже и брюшине, чтобы войти в брюшную полость. Расширьте разрез, раздвинув края разреза пальцами.
    2. С помощью щипцов протяните кишечник в сторону, чтобы обнажить яичники в верхней части живота, расположенные на верхнем полюсе почек. С помощью тонких щипцов и микроножниц аккуратно иссекайте яичники, избегая при этом повреждения тканей. Немедленно перенесите яичники в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 100-200 мкл предварительно подогретой среды M2-IBMX.
    3. Перенесите яичники в 1 мл предварительно подогретой среды M2-IBMX и переместите на нагретый предметный столик для диссекционного микроскопа (рис. 1B). Тщательно удалите жировую ткань и остатки яйцеводов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обращайтесь с яичниками, чтобы предотвратить повреждение фолликулов или ооцитов. Поддерживайте яичники в теплой среде во время переноса из помещения для животных в лабораторию.
    4. Высвобождайте кумулюс-ооцитарные комплексы (КОК) путем прокола фолликулов с помощью иглы 27 G (рис. 1A-B). Соберите КОК и перенесите в капли M2-IBMX объемом 25-30 мкл (рис. 1D).
    5. Диссоциировать кумулюсные клетки путем повторного пипетирования с помощью узкой стеклянной пипетки Пастера (рис. 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как ротовое пипетирование обычно используется для работы с ооцитами, механические пипетки или микроманипуляторы являются альтернативой, особенно в условиях, когда пипетирование через рот ограничено или невозможно. Эти альтернативы были успешно использованы в аналогичных протоколах10,11.
    6. Идентификация и отбор полностью выращенных ооцитов стадии GV на основе большего диаметра и центрального расположения GV с помощью стереомикроскопа с увеличением 20x-40x. Переложите в свежие 30 мкл капель M2-IBMX на горячий блок с температурой 37 °C, защищенный от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте уровень ооцитов на уровне 37 °C на протяжении всех процедур для сохранения физиологической целостности. Предварительно нагрейте все носители и используйте столики с регулируемой температурой для всех операций с микроскопом и микроинъекций.
    7. Дайте ооцитам восстановиться в течение 20 минут при температуре 37 °C перед микроинъекцией.

2. Получение кРНК H2B-RFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги в перчатках в чистой, свободной от РНКазы среде. Используйте только воду и реагенты, не содержащие РНКазы, и желательно работать в присутствии ингибиторов РНКазы.

  1. Проверьте последовательность плазмиды H2B-RFP (см. Таблицу материалов) с помощью секвенирования по Сэнгеру с использованием праймеров, расположенных по бокам вставки. Амплифицируйте плазмиду путем трансформации компетентной кишечной палочки (например, DH5α), выбора одной колонии и выращивания ее в бульоне LB с соответствующими антибиотиками. Очистите плазмиду с помощью стандартного набора для подготовки midi или maxi. Для получения подробной информации о процедурах см. Green and Sambrook12.
  2. Очистите плазмидную ДНК с помощью коммерческого набора miniprep в соответствии с инструкциями производителя. Количественное определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра.
  3. Линеаризируйте 2-4 мкг плазмидной ДНК после вставки с помощью подходящего фермента рестрикции, который разрезает один раз в скелетной цепи (для H2B-RFP использовался NotI). Настройте реакцию разложения с использованием соответствующего буфера и концентрации фермента, как описано в таблице 1 , и инкубируйте при 37 °C в течение 1-2 часов. Подтвердите полную линеаризацию с помощью электрофореза в агарозном геле. Множественные полосы указывают на неполное пищеварение. Если вы используете коммерческий набор, следуйте инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите фермент рестрикции, который точно режет после вкладыша и при оптимальных условиях пищеварения. Проверьте линеаризацию, нанеся небольшую аликвоту на агарозный гель.
  4. Удалите загрязнение РНКазой путем инкубации реакции пищеварения с 1 мкл протеинады К (10 мкг/мл), 5,3 мкл 10% SDS и 50 мкл воды, не содержащей нуклеаз, при 50 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для устранения РНКазы и белковых загрязнителей. Используйте только реагенты, не содержащие РНКазы, и поддерживайте чистые условия труда.
  5. Экстрагируйте расщепленную ДНК с помощью фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) с последующей экстракцией хлороформа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации токсичности и оптимизации работы с образцами вместо экстракции фенолом/хлороформом также могут использоваться методы очистки на основе колонок или гранул (например, системы с кремнеземными мембранами или магнитными шариками).
  6. Осаждение ДНК путем добавления 3 М ацетата натрия и 100% этанола. Инкубировать при температуре −80 °C не менее 2 ч.
  7. Гранулируйте ДНК центрифугированием при 12 000-14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Промойте гранулу с 70% этанолом, снова центрифугируйте на той же скорости в течение 5 минут при 4 °C, кратковременно высушите на воздухе (2-5 минут) и повторно суспендируйте в 6 μл воды, не содержащей РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После осаждения этанола и центрифугирования на дне пробирки должна образоваться видимая полупрозрачная или белая гранула. Если гранулы не видны, повторите центрифугирование на более высокой скорости или повторно оцените концентрацию ДНК.
  8. Выполняйте транскрипцию in vitro с помощью набора T7 mMESSAGE mMACHINE (см. Таблицу 2), следуя протоколу производителя.
  9. Инкубируйте реакцию транскрипции при 37 °C в течение не менее 2 ч. Продлите инкубацию, если длина транскрипта превышает 5 кб.
  10. Удалить матричную ДНК путем обработки ДНКазой с использованием 1 ЕД ДНКазы I на 10 мкл реакционного объема, инкубировать при 37 °C в течение 15 мин.
  11. Очистите синтезированную кРНК с помощью осаждения хлорида лития13. После осаждения и центрифугирования на дне пробирки должна образоваться видимая полупрозрачная или белая гранула. Промойте гранулу РНК с 70% этанолом.
  12. Ресуспендируйте конечную гранулу кРНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы. Измерьте концентрацию РНК и подтвердите наличие и длину поли(А)-хвоста путем проведения ОТ-ПЦР с последующим секвенированием продукта ПЦР. Аликвотируйте кРНК в объеме 1 мкл и храните при температуре −80 °C.

3. Подготовка и микроинъекция ооцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей процедуры поддерживайте температуру ооцитов при температуре 37 °C с использованием предварительно подогретых сред и столиков микроскопа с контролируемой температурой для сохранения качества ооцитов.

  1. Подготовка
    1. Разморозьте аликвоты кРНК H2B-RFP на льду, кратковременно центрифугируйте и разбавьте до желаемой концентрации (например, 250 нг/мкл).
      Примечание: Оптимальная концентрация кРНК может варьироваться в зависимости от конструкции, системы экспрессии и целей эксперимента. Мы рекомендуем титровать концентрацию кРНК (например, в диапазоне 50-300 нг/мкл) для минимизации артефактов сверхэкспрессии при обеспечении достаточного сигнала. Пользователи также должны отслеживать мейотическое прогрессирование (например, GVBD, формирование веретена и экструзия полярного тела) в качестве функционального считывания здоровья и жизнеспособности ооцитов после экспрессии конструкции. Сообщалось, что инъекционные концентрации кРНК обычно находятся в диапазоне от 0,2 до 1 мкг/л, при этом оптимальные результаты часто достигаются при 0,5 мкг/мкл 2,3,4,5,7,8,9.
    2. Подготовьте иглы для микроинъекций из капилляров боросиликатного стекла (OD = 1,5 мм, ID = 0,86 мм, длина = 100 мм) с помощью пуллера для пипеток (рис. 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем вертикальный съемник пипеток (см. Таблицу материалов; Рисунок 2А). Оптимизируйте параметры вытягивания опытным путем. Кончик иглы должен быть достаточно тонким, чтобы свести к минимуму повреждение ооцитов, но достаточно широким, чтобы избежать закупорки и обеспечить плавную доставку кРНК.
    3. Загрузите 0,5-1,5 мкл раствора кРНК в наконечник иглы с помощью наконечников микрозагрузчика, не содержащих РНКазу. Удалите все пузырьки воздуха перед инъекцией.
  2. Настройка чашки для микровпрыска
    1. Приготовьте чашку для микроинъекций со 100 μл среды M2-IBMX и полностью покройте ее минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение и сдвиги осмолярности.
  3. Микроинъекция ооцитов
    1. Установите пипетки для удержания и впрыска на систему микроманипулятора (рис. 2B, C).
    2. Поместите чашку для микроинъекций на предметный столик микроскопа. С помощью ротовой пипетки перенесите ооциты в каплю M2-IBMX.
    3. Подведите пипетки для удержания и инъекции в одну горизонтальную плоскость с ооцитами.
    4. Захватите один ооцит с помощью мягкого отсасывания с помощью удерживающей пипетки (рис. 2B и C).
    5. Введите инъекционную иглу через пеллюцидную и оолемму, нацеливаясь на цитоплазму и избегая ядра.
    6. Подайте кРНК H2B-RFP с помощью короткого импульса отрицательной емкости через внутриклеточный электрометр (рисунок 2B-E). Объем инъекции должен составлять примерно 5% от объема ооцитов. Успешная инъекция обычно проявляется в виде небольшого, но отчетливого рассеивания цитоплазмы. Отрегулируйте давление впрыска и время впрыска, чтобы избежать повреждения мембраны.
    7. Быстро и плавно извлекайте иглу под тем же углом, чтобы свести к минимуму разрыв мембраны.
    8. Освободите ооцит от пипетки, удерживающей пипетку, и переместите его в отдельную область чашки, чтобы отличить введенные ооциты от неинъецированных (рис. 2F). Для этой конфигурации организуйте рабочий процесс, оставив неинъецированные ооциты в верхней части чашки, а введенные переместите в нижнюю часть.
    9. Повторите шаги 3.3.4-3.3.8 для всех оставшихся ооцитов. Показатели выживаемости после инъекции варьируются в зависимости от техники и свойств мРНК. Ожидайте 60%-80% жизнеспособности.
  4. Работа после впрыска
    1. Перенесите введенные ооциты в свежую каплю среды M16-IBMX в чистом питательном стакане.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 1-4 часов, чтобы обеспечить экспрессию H2B-RFP. Корректируйте продолжительность инкубации в зависимости от концентрации кРНК, размера транскрипта и эффективности экспрессии.

4. Таймлапс-визуализация H2B-RFP-меченых хромосом во время мейоза

  1. Подготовка оборудования и сред
    1. Перед использованием предварительно нагрейте столик конфокального микроскопа и климатическую камеру до 37 °C в течение ≥ 30 минут (рис. 3A). Включите газовый контроллер и инициируйте подачу газа, чтобы поддерживать в камере 5%CO2 и окружающийO2. Убедитесь, что камера увлажнена для поддержания здоровья ооцитов во время расширенной визуализации живых клеток.
    2. Приготовьте капли культуры: Поместите 5-6 капель по 50 мкл среды М16 с добавлением SiR-тубулина (конечная концентрация 100 нМ) в чашку Петри диаметром 35 мм. Покрыть минеральным маслом. В отдельную чашку со стеклянным дном поместите три капли M16 + SiR-тубулина по 5 л и посыпьте минеральным маслом. Перед употреблением разогрейте обе посуды при температуре 37 °C в течение ≥ 30 минут.
  2. Перенос и промывка ооцитов
    1. Промывка ооцитов: Последовательно перенесите введенные ооциты через капли M16 + SiR-тубулина объемом 50 мкл для смывания остатков IBMX (рекомендуется 5 промывок). Выполняйте промывания аккуратно, чтобы избежать повреждения ооцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный IBMX может препятствовать возобновлению мейоза, поэтому тщательная промывка имеет решающее значение.
    2. Заключительный перенос: После промывания перенесите 15-20 ооцитов в каплю M16 + SiR-тубулин объемом 5 мкл в предварительно подогретую чашку для визуализации со стеклянным дном.
  3. Настройка микроскопа
    1. Монтажная чашка для визуализации: Поместите чашку со стеклянным дном на предметный столик конфокального микроскопа (рис. 3A). Дайте ооцитам отстояться в течение ~10 минут.
    2. Позиционирование сцены: с помощью визуализации в светлом поле зрения центрируйте ооциты в поле зрения. Сохраняйте позиции с помощью программного обеспечения для микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали конфокальный микроскоп Leica TCS SP8 с объективом погружения в воду HC PL APO 20x/1.0 NA. Тем не менее, в зависимости от наличия можно использовать другие конфокальные системы и объективы с аналогичными характеристиками.
    3. Настройка водяного насоса для целей погружения в воду: Если используется объектив погружения в воду, используйте систему водяного насоса для периодической подачи воды с интервалом в 5-10 минут. Этот периодический поток поддерживает водяной столб между линзой и чашкой со стеклянным дном, предотвращая высыхание и обеспечивая стабильные условия визуализации во время длительных экспериментов. Для масляных иммерсионных линз такая настройка потока воды не требуется.
  4. Настройки изображения
    1. Переключитесь в режим лазерного сканирования. Установите интенсивность лазера следующим образом: 561 нм при 0,5% (~100 мкВт на объективе) для H2B-RFP (хромосом); 633 нм при 3% (~300 мкВт на объективе) для SiR-тубулина (веретенообразные микротрубочки; Рисунок 3B, E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте надлежащим правилам безопасности лазера. Сведите к минимуму воздействие лазера для защиты жизнеспособности образца.
  5. Получение Z-стека
    1. Приобретите Z-стеки с длиной 30–50 мкм с шагом 2–4 мкм (рис. 3B, C).
    2. Делайте снимки с интервалом 5–10 минут со скоростью сканирования 600 Гц (рис. 3B, D). Общая продолжительность визуализации может составлять 12-16 часов, в зависимости от контролируемой мейотической стадии, и ограничена фототоксичностью и толерантностью ооцитов к расширенному культивированию in vitro .
  6. Последовательное получение изображений
    1. На микроскопических системах выполнить последовательное сканирование с помощью двух HyD-детекторов: H2B-RFP: возбуждение на длине волны 561 нм; Выбросы улавливаются на длине волны 580-630 нм; Возбуждение SiR-тубулина при длине волны 633 нм; выбросы, собранные на длине волны 650-700 нм (рисунок 3E).
  7. Запуск покадровой съемки
    1. Прежде чем начать долгосрочную покадровую съемку, проверьте качество сигнала, сделав тестовое изображение. Флуоресцентные сигналы должны быть равномерно распределены: H2B-RFP должен четко маркировать хроматин, а SiR-тубулин должен выделять структуры микротрубочек без избыточного фона. Убедитесь в стабильности автофокусировки и минимальном фотообесцвечивании при коротких предварительных прогонах изображения.
    2. Запустите цейтраферную съемку, нажав кнопку Пуск.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GVBD, обозначающая вхождение в М-фазу, обычно происходит через 60-90 минут после вымывания IBMX (Рисунок 4A). В этой конфигурации ооциты C57BL/6 выдавливают первое полярное тельце примерно через 8-9 ч после РТС (рис. 4A). Сроки могут варьироваться в зависимости от штамма мыши и условий культивирования.

5. Пост-визуальная обработка

  1. Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений, выбрав Файл > Открыть » и выбрав файл .lif из сеанса обработки изображений.
  2. Сгенерируйте Z-проекции для каналов H2B RFP и SiR-Tubulin, выбрав «Обработка» > «Создать проекцию». Установите тип проекции на Проекция максимальной интенсивности. Выберите каналы RFP и SiR Tubulin, затем нажмите Run.
    ПРИМЕЧАНИЕ Не выполняйте Z-проекцию для канала DIC, так как это может привести к размытию изображения. Вместо этого определите и выберите одну плоскость ДИС, которая имеет наиболее четкую фокусировку. Используйте это сфокусированное изображение DIC в сочетании с проекциями максимальной интенсивности каналов H2B-RFP и SiR-тубулина для достижения оптимальной визуализации.
  3. Извлечение одной светлопольной фокальной плоскости. Вернитесь в Process Tools и выберите Edit > Crop. Выберите канал Светлого поля, используйте ползунок Z, чтобы найти оптимальную фокальную плоскость, и нажмите Применить.
  4. Объедините проекционное и светлопольное изображения, открыв Инструменты обработки и выбрав Объединить > Добавить каналы. Добавьте проекцию RFP, проекцию SiR-Tubulin и одно светлопольное изображение. Щелкните правой кнопкой мыши объединенный набор и выберите команду Применить.
  5. Экспортируйте окончательное объединенное изображение, выбрав «Файл» > «Экспортировать > изображение». Выберите формат TIFF для высококачественного несжатого вывода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспорт в формате TIFF рекомендуется для последующего анализа и подготовки рисунков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано на рисунках 4A,B, этот протокол позволяет получать высококачественную визуализацию хромосом живых клеток (H2B-RFP) и веретенообразных микротрубочек (SiR-тубулина) в ооцитах, тем самым предоставляя исчерпывающую пространственно-временную информацию на протяжении всего мейотического созревания.

Канал H2B-RFP на рисунке 4A показывает все аспекты движения хромосом от первоначального выравнивания после РТСД (<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь протокол представляет собой надежный метод микроинъекции и визуализации живых клеток ооцитов мыши, позволяющий визуализировать динамику хромосом во время мейоза с высоким временным и пространственным разрешением. Решающее значение для успеха этого подхода имеет тщательное обращение с ооцитами на каждом этапе процедуры, от сбора и микроинъекции до визуализации. Ооциты очень чувствительны к колебаниям окружающей среды, и отклонения температуры, pH или осмолярности могу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Фондом профессора Кристофера Чена, финансированием стартапа от Медицинского факультета Университета Квинсленда и грантами проекта Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (APP1078134 и APP1103689) для H.A.H.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприцы 1 млТерумоSS+01T ТуберкулинШприцы для точных инъекций PMSG.
Агарозный гельИнвитроген16500500Используется для гель-электрофореза ДНК и РНК для разделения нуклеиновых кислот по размеру, чтобы соответствовать последовательности H2B-RFP
Спиртовая горелкаЛабТекLW15557-01Используется для стерилизации и приготовления пипитки для полости рта.
Бактериальные питательные среды (бульон LB)Сигма-ОлдричЛ3022Стандартная среда, используемая для выращивания кишечной палочки и других бактериальных культур.
Чашки для клеточных культур (35 & 10 мм и 60 & 15 мм)Сигма-ОлдричCLS430165, CLS430166Используется для культивирования ооцитов; Доступны в различных размерах.
Центрифуга (настольная)Эппендорф5424РКомпактная центрифуга для небольших объемов проб, обычно используемая в исследовательских лабораториях.
Центрифужные пробирки (15 мл и 50 мл)Корнинг352096, 352070Большие пробирки для центрифугирования, обычно используемые для обработки клеток и белков.
ХлороформСигма-ОлдричС2432Растворитель, обычно используемый в протоколах молекулярной биологии, особенно при экстракции ДНК/РНК.
CO2-инкубаторSanyo (модель: MCO-18AIC)Инкубатор предназначен для поддержания контролируемой атмосферы CO2 для культивирования ооцитов.
Одноразовые ультратонкие иглы (27 G × 1/2")Ханке Сасс Вольф4710004012Тонкие иглы для забора ооцитов
ДНКаза I (без РНКазы)Thermo Fisher ScientificЕН0521Фермент используется для удаления загрязняющей ДНК из препаратов РНК.
Сухой нагревательный блокИнструменты гранта (модель: QBD4)Блок, используемый для нагрева образцов или реакций при точных температурах без необходимости использования воды.
Этанол (класс молекулярной биологии)Сигма-ОлдричЕ7023Используется для осаждения ДНК и РНК, а также в процедурах стерилизации.
Тонкие ножницы для препарированияНаучные и хирургические инструменты Met-App2235Используется для точной диссекции ооцитов мышей
Тонкие щипцыНаучные и хирургические инструменты Met-App2127Используется для точной диссекции ооцитов мышей
Система гелевого электрофорезаБио-Рад1645050Система для проведения электрофореза нуклеиновых кислот или белков в гелях.
Гентамицина сульфатСигма-ОлдричГ1264Антибиотик, используемый для предотвращения бактериального загрязнения в клеточных культурах.
Стеклянные пастеровские пипетки (230 мм)ВВР6121702Стеклянные пипетки, используемые для пипеток для рта ооцитов 
IBMXСигма-ОлдричИ5879Ингибитор фосфодиэстеразы, используемый для профилактики РТБД
Инвертированный микроскопКомпания NikonМикроскоп, предназначенный для наблюдения за живыми клетками или организмами из-под чашки для культивирования.
Легкое минеральное масло подходит для культивирования эмбрионов мышейСигма-ОлдричМ5310Используется для покрытия ооцитов в культуре для предотвращения испарения и поддержания температуры.
Хлорид литияСигма-ОлдричЛ9650Используется в методах осаждения РНК.
Система визуализации живых клетокЛейкаЛАС ХСистема визуализации, предназначенная для наблюдения за живыми клетками в режиме реального времени с использованием передовых методов микроскопии.
Среда М16 (для культивирования in vitro)Сигма-ОлдричМ7292Среда, предназначенная для культивирования ооцитов и эмбрионов мышей и других применений in vitro.
Микроцентрифужные пробирки (0,6 мл и 1,6 мл)Нептун3735.X, 3745.XПробирки малого объема для центрифугирования, часто используемые в протоколах молекулярной биологии и биохимии.
Микроцентрифужные пробирки (без РНКазы)Эппендорф / Нептун022431081 (Эппендорф)Свободные от РНКазы трубки для РНК предотвращают деградацию РНК.
Иглы для микроинъекцийИнструменты СаттераP-30 Съемник пипетокИглы для точного микроинъекционного введения в ооциты
Система микровпрыскаГарвардский аппаратФемтоДжет, ПикоПампСистемы, используемые для введения кРНК в ооциты мышей с высокой точностью.
Набор для миниподготовкиЦягэн27106 (QIAprep Набор для мини-подготовки)Набор для выделения плазмидной ДНК из бактериальных культур для применения в молекулярной биологии.
Узел трубки аспиратора для ртаСигма-ОлдричА5177для аспирационных ооцитов
Пеллетная краскаМерк Миллипор69049-3Продукт для визуализации формирования гранул во время центрифугирования.
Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спиртThermo Fisher Scientific15593031Решение, используемое в экстракции H2B-RFP для разделения фаз.
Плазмида, кодирующая H2B-RFPАддженПлазмид #20972 Плазмида, используемая для мечения хромосом красным флуоресцентным белком (RFP) 
ПМСГПроспекХОР-272Для супероваляции мыши 
Протеиназа КThermo Fisher ScientificЭО0491Фермент, используемый для переваривания белков, обычно используемый в процедурах экстракции ДНК/РНК.
Фермент рестрикции NotIБиолаборатории Новой Англии (NEB)Р3189СФермент рестрикции, используемый в клонировании ДНК и молекулярной биологии для линеаризации плазмид H2B-RFP.
Ингибитор РНКазы (опционально)Биолаборатории Новой Англии (NEB)М0314СФермент, используемый для предотвращения деградации РНК во время экспериментов, связанных с РНК.
Перчатки без РНКазыVWR / Fisher ScientificЗависит от размераПерчатки, обработанные для предотвращения контаминации РНКазы, используются в протоколах манипуляций с РНК.
Наконечники для пипеток без РНКазыAxygen / ТермофишерТ-300-Р-СНаконечники для пипеток не содержат загрязнения РНКазой для применений, связанных с РНК.
Вода без РНКазыThermo Fisher ScientificАМ9932Вода, очищенная от ферментов РНКазы, необходимых для работы РНК, предотвращает деградацию.
СДП (10%)Сигма-ОлдричЛ3771Додецилсульфат натрия используется для денатурации белков в электрофорезе и других экспериментах.
SiR-тубулинСпирохромСК002Флуоресцентный краситель, который специфически связывается с тубулином для визуализации живых клеток веретена
Ацетат натрия (3 М)Сигма-ОлдричС7899Используется в качестве буфера и для осаждения ДНК в процедурах молекулярной биологии.
СпектрофотометрТермофишер (NanoDrop)НД-ОДИН-ВПрибор, используемый для количественного определения нуклеиновых кислот, белков и других веществ путем измерения абсорбции.
СтереомикроскопLeica Microsystems   М165СМикроскоп, предназначенный для наблюдения образцов в трех измерениях при малых увеличениях, полезен для вскрытия.
Шприцевой фильтрующий блок (0,22-&микро; m)МеркSLGP033RSИспользуется для стерильной фильтрации жидкостей, особенно в микробиологии и молекулярной биологии.
Шприцы и игла в сбореТерумоSS+01T Туберкулиновые шприцыиспользуется для точной доставки PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE KitThermo Fisher ScientificАМ1344Набор для транскрипции in vitro РНК из промотора Т7 для получения кРНК H2B-RFP.
Водяная баня / нагревательный блокИнструменты грантаQBD4Используется для поддержания точных температур в экспериментах, требующих нагрева.

Ссылки

  1. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  2. Wei, Z., Greaney, J., Loh, W. N., Homer, H. A. Nampt-mediated spindle sizing secures a post-anaphase increase in spindle speed required for extreme asymmetry. Nat Commun. 11 (1), 3393(2020).
  3. Zhou, C., Hancock, J. L., Khanna, K. K., Homer, H. A. First meiotic anaphase requires Cep55-dependent inhibitory cyclin-dependent kinase 1 phosphorylation. J Cell Sci. 132 (18), jcs233379(2019).
  4. Zhou, C., Homer, H. A. The oocyte spindle midzone pauses Cdk1 inactivation during fertilization to enable male pronuclear formation and embryo development. Cell Rep. 39 (5), 110789(2022).
  5. Zhou, C., Ye, Y., Homer, H. Using FRET to define Cdk1-dependent ordering of events during exit from second meiotic M-phase in oocytes. Methods Mol Biol. 2874, 99-114 (2025).
  6. Jones, K. T. Meiosis in oocytes: Predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age. Hum Reprod Update. 14 (2), 143-158 (2008).
  7. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  8. Verlhac, M. H., Lefebvre, C., Guillaud, P., Rassinier, P., Maro, B. Asymmetric division in mouse oocytes: with or without Mos. Curr Biol. 10 (20), 1303-1306 (2000).
  9. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-Organization of MTOCs Replaces Centrosome Function during Acentrosomal Spindle Assembly in Live Mouse Oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  10. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation, and ploidy assessment. J Vis Exp. (55), e2851(2011).
  11. Yoshida, N., Perry, A. C. F. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  12. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2012).
  13. Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., Green, M. R. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA probes. Nucl Acids Res. 12 (18), 7035-7056 (1984).
  14. Wei, Z., Greaney, J., Zhou, C., Homer, H. A. Cdk1 inactivation induces post-anaphase-onset spindle migration and membrane protrusion required for extreme asymmetry in mouse oocytes. Nat Commun. 9, 4029(2018).
  15. Davydenko, O., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Increased CDK1 activity determines the timing of kinetochore-microtubule attachments in meiosis I. J Cell Biol. 202 (2), 221-229 (2013).
  16. Swain, J. E., Pool, T. B. ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update. 14 (5), 431-446 (2008).
  17. Sun, Q. Y., Schatten, H. Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction. 131 (2), 193-205 (2006).
  18. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  19. Nakagawa, S., FitzHarris, G. Quantitative microinjection of morpholino antisense oligonucleotides into mouse oocytes to examine gene function in meiosis-I. Methods Mol Biol. 1457, 217-230 (2016).
  20. Courtois, A., Solc, P., Kitajima, T. S. Triple-color live imaging of mouse oocytes. Methods Mol Biol. 1818, 89-97 (2018).
  21. Kline, D. Quantitative microinjection of mouse oocytes and eggs. Methods Mol Biol. 518, 135-156 (2009).
  22. Yamagata, K., Suetsugu, R., Wakayama, T. Long-term, six-dimensional live-cell imaging for the mouse preimplantation embryo that does not affect full-term development. J Reprod Dev. 55 (3), 343-350 (2009).
  23. Rémillard-Labrosse, G., et al. Oocyte and embryo culture under oil profoundly alters effective concentrations of small molecule inhibitors. Front Cell Dev Biol. 12, 1337937(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H2B RFPSiR Tubulin

Похожие статьи