Методическая статья

Количественная оценка поглощения эндотелиальных жирных кислот с использованием флуоресцентных аналогов жирных кислот

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описан анализ in vitro для измерения поглощения клеточных липидов в эндотелиальных клетках при стимуляции флуоресцентными аналогами длинноцепочечных и очень длинноцепочечных насыщенных жирных кислот BODIPY-C12 и BODIPY-C16 . Этот метод эффективен и адаптируется к другим типам клеток, предлагая полезный подход к изучению липидного обмена.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелиальные клетки (ЭК) играют центральную роль в регулировании транспорта жирных кислот (ЖК) из кровотока в метаболические ткани, однако инструменты для количественного определения поглощения ЭК надежным и масштабируемым образом остаются ограниченными. В данной работе мы представляем быстрый, количественный и экономически эффективный анализ для измерения поглощения FA в EC с использованием флуоресцентных аналогов FA (BODIPY-C12 и BODIPY-C16), который позволяет исследовать динамику поглощения по длине цепи в формате 96-луночного планшета. Протокол включает в себя положительный (3-гидроксизобутират, лактат) и отрицательный (никлозамид) контроль и валидирован как в первичной (HUVECs), так и в иммортализированной (EA.hy926) линиях EC. Анализ выявляет зависящее от времени и дозы поглощение FA, при этом результаты нормализуются по номеру клеток с использованием ядерного окрашивания Hoechst и корректируются на фон с использованием соответствующего контроля. Он может быть адаптирован к различным типам клеток, методам визуализации и экспериментальным условиям, включая форматы визуализации живых клеток и пульсовой погони. По сравнению с традиционным окрашиванием липидов или радиоактивными метками, этот метод обеспечивает повышенную безопасность, скорость и универсальность при одновременном захвате динамического поглощения FA в живых клетках. Этот анализ обеспечивает надежную платформу для изучения регуляции эндотелиального транспорта липидов и его вклада в метаболические заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы питательные вещества, переносимые кровью, такие как липиды, попали в метаболические ткани, такие как скелетные мышцы, они должны сначала преодолеть барьер эндотелиальных клеток (ЭК), который состоит из стенок капиллярных кровеносных сосудов. Хотя долгое время считалось, что жирные кислоты (ЖК) просто диффундируют через этот барьер и достигают подлежащих тканей, новые данные свидетельствуют о том, что ЭК активно регулируют этот процесс с помощью специализированных транспортных механизмов, эволюционировавших для перемещения гидрофобных молекул через водный вне- и внутриклеточныймир.

В кровотоке ЖК существуют либо в виде связанных с альбумином свободных жирных кислот (СЖК), либо упакованы в богатые триглицеридами липопротеины (TRL), такие как хиломикроны и липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП)2. На просветной поверхности ЭК липопротеинлипазы (ЛПЛ) гидролизует TRL, высвобождая СЖК для поглощения. В транспорте FA участвуют различные белки, в том числе CD36, который осуществляет фактическое поглощение FA в клетку; транспортные белки жирных кислот (FATP) и ацил-КоА-синтетазы (ACSL), которые опосредуют векторный транспорт; жиросвязывающие белки (FABP), которые действуют как липофильные шапероны, и бесчисленное множество других, некоторые из которых еще предстоит открыть и классифицировать 2,3. Подлежащая ткань также использует аналогичные механизмы для поглощения транспортируемого жира, хотя конкретные присутствующие изоформы часто различаются в зависимости от типа клеток.

Недавние исследования показали, что ЭК координируются с соседними клетками посредством паракринной сигнализации для модуляции транспорта ЖК в ткани-мишени. Например, скелетные миоциты секретируют набор паракринных факторов, таких как 3-гидроксизобутират (3-HIB), фактор роста эндотелия сосудов B (VEGFB) и апелин, чтобы способствовать транспортировке FA соседним эндотелием 4,5,6. Интересно, что эндокринная система также может быть вовлечена, как в случае, когда инсулин стимулирует адипоциты к высвобождению лактата, который также стимулирует ЭК к поглощению ФА7.

Таким образом, ЭК действуют как модулирующие привратники жира, предполагая, что они играют ключевую роль в нарушениях липидного обмена, таких как сердечно-сосудистые заболевания или диабет 2 типа. Последние данные показали, что сами ЭК накапливают липидные капли (ЛД) в ответ на перегрузку жиром, потенциально действуя как буфер, регулирующий доставку жирных кислот к нижележащим тканям. В случае высокого потребления жиров, как в случае с современными диетами, чрезмерное накопление этих ЛД может способствовать сосудистой дисфункции и заболеваниям, включая гипертонию. В целом, лучшее понимание того, как ЭК поглощают и транспортируют ФА, может дать нам новые терапевтические методы борьбы с липидными заболеваниями.

В этом исследовании мы описываем простой, быстрый и экономически эффективный анализ для измерения поглощения эндотелиальных ЖК с использованием флуоресцентных длинноцепочечных аналогов ЖК BODIPY-C12 и BODIPY-C16. Эти реагенты достаточно недороги и достаточно безопасны, особенно по сравнению с радиоактивными или мечеными тяжелыми изотопами ФАС, которые традиционно использовались для измерения поглощения клеточного жира11,12. Важно отметить, что эти реагенты отличаются от неконъюгированного «свободного» красителя BODIPY, который пассивно накапливается в гидрофобных областях клетки, преимущественно в LDs13. Напротив, конъюгация BODIPY с алифатической цепью FA (например, C12 или C16) дает молекулу, которая структурно имитирует нативные длинноцепочечные FA. Эта модификация позволяет проводить специфическое измерение динамического поглощения жирных кислот клетками, а не отражать внутриклеточное накопление липидов или образование капель.

Ключевым преимуществом этого подхода является его гибкость. Исследователи могут использовать другие типы клеток, переменное время инкубации и ряд BODIPY-конъюгированных аналогов FA для изучения поглощения, зависящего от длины цепи, или даже естественно флуоресцентных липидов, таких как цис-паринаревая жирная кислота14. В целом, этот протокол предоставит исследователям простой способ проверки поглощения клеточной ЖК в различных условиях и проложит путь к ответу на фундаментальные вопросы липидного обмена, биологии эндотелия и метаболических заболеваний (Рисунок 1).

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эндотелиальные клетки человека (HUVECs), использованные в этом исследовании, были получены из коммерчески доступных, обезличенных источников в соответствии с рекомендациями учреждений и поставщиков по этичному использованию биологических материалов человека. Выполняйте все действия в стерильной среде под ламинарным вытяжным шкафом. Список всех реагентов и оборудования см. в Таблице материалов .

1. Желатиновое покрытие 96-луночного планшета

  1. Приготовьте 0,1% раствор желатина, разбавив 25 мл 2% желатина в 500 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Тщательно перемешать и отфильтровать-простерилизовать с помощью вакуум-фильтра (или автоклава) размером 0,2 мкм.
  3. Добавьте 100 μл на лунку 0,1% желатина в черную 96-луночную пластину с прозрачным дном.
  4. Инкубируйте при температуре 37 °C не менее 30 минут или в идеале в течение ночи.

2. Посев клеток

  1. Приготовьте одноклеточную суспензию ЭК в готовых средах.
    1. Приготовьте полноценную среду, добавив в соответствующую базальную среду 10% фетальную бычью сыворотку и 1% пенициллин/стрептомицин (v/v для обоих).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базальная среда будет отличаться в зависимости от конкретного типа клеток; В этом исследовании для клеток HUVEC и EA.hy926 использовались эндотелиальная питательная среда (EGM-2) и модифицированная Eagle's Medium (DMEM) Дульбекко.
  2. Пипеткой вводите 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку с плотностью посева, позволяющей клеткам достичь слияния к следующему дню.

3. Подготовка и применение реагентов для лечения

  1. Приготовьте все реагенты в двухвалентном PBS (с Ca2+ и Mg2+) и предварительно подогрейте до 37 °C.
    1. Приготовьте 3-HIB (положительный контроль) в виде рабочего раствора с температурой 20 мМ. Растворить исходный раствор при температуре 1 М в воде двойной дистилляции и хранить при температуре 4 °C.
    2. Приготовьте лактат (положительный контроль) в виде рабочего раствора 20 мМ. Растворить исходный раствор при температуре 1 М в воде двойной дистилляции и хранить при температуре 4 °C.
    3. Приготовьте никлозамид (отрицательный контроль) в конечной концентрации 1 мкМ. Растворите исходный раствор при 10 мМ в ДМСО. Разложите по меньшим объемам, чтобы избежать циклического замораживания-размораживания, и храните при температуре -20 °C.
  2. Промойте клетки один раз предварительно подогретым двухвалентным PBS.
  3. Добавьте 50 μл на лунку соответствующего реагента для обработки (3-HIB, лактата или никлозамида) и инкубируйте при 37°C в течение 30 мин (для никлозамида) или 60 мин (для 3-HIB и лактата).

4. BODIPY-FA: BSA комплекс приготовления и применения

  1. Готовьте комплексы BODIPY-FA: BSA в конечных концентрациях 0,5 мкМ, 1 мкМ или 2 мкМ в PBS, используя молярное соотношение FA:BSA 2:1. Для получения раствора BODIPY-FA в дозе 2 мкМ инкубировать с 1 мкМ БСА без ЖК в PBS. Для 1 μM BODIPY-FA используйте 0,5 μM BSA и так далее. Всегда бейте комплексы от света во время инкубации.
  2. Перед использованием смесь инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут.
  3. Добавьте 50 μL комплекса в обрабатываемые лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только средние 10 столбцов, чтобы избежать эффектов краев. Зарезервируйте внешние колонны в качестве регуляторов автофлуоресценции, добавив в эти лунки только PBS.
  4. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 1 минуты, 5 минут или 10 минут.

5. Гашение флуоресценции и обнаружение внутриклеточного сигнала

  1. Приготовьте 1 мкМ БСА без FA в PBS в качестве буфера для промывки и предварительно нагрейте до 37 °C.
  2. Извлеките BODIPY-FA: BSA и дважды промойте всю пластину 50 μL предварительно нагретой 1 μM BSA без FA в PBS. Выполняйте каждое мытье в течение 1,5 мин.
  3. Добавьте 50 мкл 0,08% трипанового синего для гашения внеклеточной флуоресценции.
  4. Немедленно измерьте внутриклеточную флуоресценцию с помощью считывателя микропланшетов со следующими настройками: Возбуждение: 488 нм, Излучение: 515 нм, Пороговое значение: 495 нм, Режим: нижнее считывание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычтите автофлуоресцентный фон с использованием лунок внешней колонки, содержащих клетки, которые не были обработаны BODIPY-FA на шаге 4.

6. Ядерное окрашивание Хёхста для нормализации клеток

  1. Удалите раствор Trypan Blue и аккуратно промойте PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть несколько хрупкими и склонными к шелушению. Соблюдайте осторожность при стирке.
  2. Добавьте 4 мкг/мл Hoechst в 10% среду и инкубируйте 30 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации Hoechst может потребовать оптимизации. В зависимости от типа ячейки может потребоваться от 5 до 60 минут для достижения равномерной ядерной маркировки и достаточной интенсивности сигнала. Не добавляйте Хёхста во внешние столбцы.
  3. Вымойте тарелку один раз с помощью PBS.
  4. Добавьте свежий PBS и измерьте флуоресценцию Хёхста, используя следующие настройки: Возбуждение: 350 нм, Излучение: 461 нм, Отсечка: 455 нм, Режим: нижнее считывание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычтите автофлуоресцентный фон Хёхста с использованием внешних колонных лунок.
  5. Нормализуйте флуоресценцию BODIPY-FA по номеру клеток, разделив скорректированные по автофлуоресценции значения из шага 5.3 на соответствующие значения Хёхста, полученные на шаге 6.4. Используйте значения с коррекцией фона для сигналов BODIPY и Hoechst.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные значения представляют собой поглощение BODIPY-FA, нормализованное по номеру клетки, скорректированное на автофлуоресценцию в каналах BODIPY и Hoechst.

7. Статистический анализ

  1. Выполните статистический анализ для рисунка 2 с использованием двустороннего ANOVA для оценки влияния времени, концентрации и их взаимодействия. Примените апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений.
  2. Для рисунков 3 и 4 используйте непарный двусторонний t-критерий Стьюдента при сравнении двух условий. Для экспериментов с тремя или более условиями используйте однофакторный ANOVA с последующим тестом Даннетта для множественных сравнений.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 1, в этом анализе используется формат 96-луночных планшетов, в котором EC засеваются непосредственно в лунки. ФА, меченные BODIPY, конъюгированы с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и применяются как в экспериментальных, так и в контрольных лунках. Перед лечением ФА ЭК можно манипулировать с помощью фармакологического лечения или генетических нарушений, таких как трансфекция миРНК или редактирование гена CRISPR. Важно отметить, что такие манипуляции также позволяют включить соответствующие положительные и отрицательные меры контроля для обеспечения надежности анализа.

Явное дозозависимое и зависящее от времени увеличение внутриклеточного сигнала BODIPY-C12 наблюдалось после инкубации BODIPY-C12 в дозах 0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ в течение 1 мин, 5 мин и 10 мин как в клетках HUVEC, так и в клетках EA.hy926 (рис. 2). Чтобы учесть потенциальные вариации числа клеток в лунке, значения BODIPY-C12 были нормализованы в соответствии с ядерным окрашиванием Хёхста и измерены флуоресцентно. Фоновую автофлуоресценцию корректировали с помощью контрольных лунок no-BODIPY и no-Hoechst.

Для проверки воспроизводимости и диапазона анализа известные модуляторы метаболизма жирных кислот были протестированы в ЭК EA.hy926 с использованием BODIPY-C12 (рис. 3). 1-часовая обработка с увеличением концентраций лактата (0 мМ, 5 мМ, 20 мМ) или 3-HIB (0 мМ, 5 мМ, 20 мМ) усиливала поглощение BODIPY-C12 дозозависимым образом, подтверждая их роль в качестве положительных регуляторов поглощения ЖК. И наоборот, ранее было продемонстрировано, что химическое вещество никлозамид может ингибировать поглощение жирных кислот посредством митохондриального разъединения15. Действительно, аналогичные результаты были воспроизведены и здесь, так как 30 минут обработки никлозамидом (1 мкМ) значительно снижали сигнал BODIPY-C12 по сравнению с контролем автомобиля, подтверждая его полезность в качестве отрицательного контроля. Хотя эти данные нормализованы по Хёхсту для учета любых различий в количестве клеток, ни один из этих методов лечения не изменил жизнеспособность клеток или значения флуоресценции Хёхста.

Чтобы оценить адаптивность анализа к различным аналогам жирных кислот, BODIPY-C16, который можно считать прокси для очень длинноцепочечной жирной кислоты, был введен в HUVEC, и его поглощение было измерено после 5-минутной инкубации (рис. 4). Было отмечено, что лечение лактатом (0 мМ, 10 мМ, 20 мМ) увеличивает сигнал BODIPY-C16 дозозависимым образом, в то время как никлозамид (1 мкМ) снижает сигнал, отражая результаты, наблюдаемые при использовании BODIPY-C12.

В целом, этот анализ позволил провести надежную и воспроизводимую количественную оценку поглощения ЖК как в первичных (HUVEC), так и в иммортализированных (EA.hy926) ЭК. Кроме того, эти результаты демонстрируют универсальность анализа для ФАС различной длины цепи, а также демонстрируют валидность как положительного, так и отрицательного контроля.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема анализа поглощения жирных кислот с использованием жирных кислот, меченных BODIPY. Эндотелиальные клетки засевают в черную 96-луночную пластину с прозрачным дном и инкубируют с аналогами жирных кислот (ЖК), конъюгированными с BODIPY, чтобы обеспечить внутриклеточное поглощение. После инкубации внеклеточную флуоресценцию гасят с помощью Trypan Blue, а внутриклеточный сигнал измеряют с помощью нижнего считывателя флуоресцентных микропланшетов. Ядерный краситель Hoechst наносится после измерения флуоресценции для количественного определения количества клеток для нормализации. Фармакологическое лечение или генетические нарушения могут быть применены до инкубации BODIPY-FA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Количественная оценка поглощения BODIPY-C12 в первичных и иммортализованных эндотелиальных клетках. (A) Зависящее от времени и концентрации увеличение поглощения BODIPY-C12 в HUVEC после 1 мин, 5 мин и 10 мин инкубации при 0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ BODIPY-C12 в комплексе с 0,25 мкМ, 0,5 мкМ и 1 мкМ без ЖК БСА, соответственно. (B) Клетки EA.hy926 продемонстрировали сходное зависящее от времени и дозы поглощение BODIPY-C12 в идентичных условиях. Средняя интенсивность флуоресценции нормализована для окрашенных по методу Хёхста ядер (количество клеток) и контрольной группы без BODIPY. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистический анализ был выполнен с использованием двусторонней ANOVA для оценки эффектов времени, концентрации и их взаимодействия, за которым последовал апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений. Значимые основные эффекты наблюдались по времени (p < 0,0001), концентрации (p < 0,0001) и их взаимодействию (p = 0,0443). Статистически значимые парные сравнения, выявленные с помощью теста Тьюки, обозначены на гистограмме следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 и ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Валидация анализа с использованием положительного и отрицательного контроля в EA.hy926. (A) 1-часовое лечение лактатом (0 мМ, 5 мМ, 20 мМ) увеличивало поглощение BODIPY-C12 дозозависимым образом. (B) 1-часовое лечение 3-HIB (0 мМ, 5 мМ, 20 мМ) аналогичным образом увеличивало поглощение ЖК. (C) 30-минутная обработка никлозамидом (1 мкМ) значительно подавляла поглощение BODIPY-C12 по сравнению с контролем транспортного средства (ДМСО). Средняя интенсивность флуоресценции нормализована для окрашенных по методу Хёхста ядер (количество клеток) и контрольной группы без BODIPY. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. 2 мкМ BODIPY-C12 (в комплексе с 1 мкМ БСА, не содержащим жирных кислот) инкубировали в течение 5 мин для всех экспериментов. Статистика для (A) и (B) определялась с помощью одностороннего ANOVA с помощью теста Даннетта для множественных сравнений, а для C — с помощью непарного двустороннего T-критерия Стьюдента. р < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Валидация анализа с использованием BODIPY-C16 в HUVEC. (А) Лечение лактатом (0 мМ, 10 мМ, 20 мМ в течение 1 ч) усиливало поглощение BODIPY-C16 дозозависимым образом. (B) Обработка никлозамидом (1 мкМ в течение 1 ч) значительно снижала сигнал BODIPY-C16 по сравнению с контролем, обработанным транспортным средством. Средняя интенсивность флуоресценции нормализована для окрашенных по методу Хёхста ядер (количество клеток) и контрольной группы без BODIPY. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. 2 мкМ BODIPY-C16 (в комплексе с 1 мкМ БСА, не содержащим жирных кислот) инкубировали в течение 5 мин во всех экспериментах. Статистика для (A) была определена с помощью одностороннего ANOVA с критерием Даннетта для множественных сравнений, а для B — с помощью непарного двустороннего T-критерия Стьюдента. *p < 0,05, ***p < 0,001 и ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот анализ предлагает быстрый, количественный и экономически эффективный метод измерения поглощения ЖК в ЭК с использованием 96-луночного планшетного формата и флуоресцентных длинноцепочечных аналогов ЖК. Благодаря включению как положительного, так и отрицательного контроля и валидации первичных (HUVECs) и иммортализированных (EA.hy926) EC, этот протокол демонстрирует надежность, воспроизводимость и широкую применимость.

Флуоресцентные анализы сыграли важную роль в выявлении паракринных регуляторов транспорта эндотелиальных липидов, как упоминалось ранее 4,5,7. Эти примеры показывают, как стандартизированная система может продолжать надежно выяснять регуляцию транспорта липидов, вызванную метаболитами, в контролируемых условиях in vitro. Описанный здесь протокол устанавливает ключевые параметры для надежных измерений поглощения ЖК, включая использование BODIPY-C12 и BODIPY-C16 в различных концентрациях (0,5-2 мкМ) и времени инкубации (1 мин, 5 мин и 10 мин). Он также эффективно обнаружил повышенное поглощение в ответ на 3-HIB и лактат и снижение поглощения после лечения никлозамидом, подтвердив как его чувствительность, так и динамический диапазон. Несмотря на то, что этот анализ оптимизирован для ЭК, он может быть легко адаптирован к другим типам клеток, таким как адипоциты, миотрубки или гепатоциты, с поправкой на соотношения BODIPY: BSA и условия лечения. Он также может быть модифицирован для визуализации живых клеток с использованием совместимых планшетов или адаптирован в формат пульсовой погони для оценки внутриклеточного удержания ФА, метаболизма или оттока.

По сравнению с другими подходами, этот метод имеет явные преимущества: он является масштабируемым, количественным и адаптируемым к различным длинам цепей FA. Кроме того, он экономически выгоден, включает в себя всего несколько этапов и требует инструментов не сложнее обычного считывателя микропланшетов, что позволяет новым пользователям, в том числе студентам, быстро освоить этот протокол. Наконец, в отличие от методов, основанных на качественной микроскопии, или окрашивания конечных точек, таких как Oil Red O, которые отражают кумулятивное содержание липидов, этот протокол фиксирует поглощение FA в режиме реального времени, не требуя фиксации или лизиса.

Тем не менее, следует отметить несколько ограничений. Использование системы 2D статического культивирования не позволяет в полной мере оценить физиологическую сложность сосудистой среды. Ключевые факторы, такие как напряжение сдвига или LPL-опосредованный липолиз, а также эндотелиально-паренхиматозные взаимодействия, отсутствуют в этой упрощенной модели. Передовые системы, такие как микрофлюидные или основанные на органоидах 3D-культуры, лучше имитируют архитектуру и передачу сигналов in vivo, хотя они требуют больших технических знанийи инфраструктуры. Например, микрофлюидные биореакторы обеспечивают среду, в которой ЭК могут имитировать образование микроциркуляторного русла и взаимодействовать с другими типами тканей, что позволяет исследователям моделировать паракринную динамику в более физиологических условиях. Более того, недавние работы показали, что могут быть разработаны специализированные системы для проведения флуоресцентной визуализации в реальном времени в 3D-культурах гидрогеля19. Такие достижения дают уверенность в том, что этот анализ однажды может быть адаптирован к системам клеточных культур, которые являются более физиологически репрезентативными, но для этого потребуется их оптимизация.

Таким образом, этот анализ представляет собой гибкую, доступную и воспроизводимую платформу для исследования поглощения клеточных ЖК в различных условиях. Хотя эта система лучше всего подходит для механистических исследований in vitro , знания, полученные с помощью этой системы, могут послужить основой для будущей работы с использованием более физиологически значимых моделей транспорта эндотелиальных липидов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таниша Чоудхури была профинансирована за счет летней исследовательской стипендии для студентов от Управления студенческих исследований Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле. Боа Ким была поддержана NHLBI (R56HL162660) и AHA (24CDA1264317). Айон Ибрагим был поддержан Фондом исследований факультета Юнион-колледжа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-гидроксиизобутират (3-HIB)Cayman Chemicals26105Положительный контроль, конечная концентрация 5 или 20 мМ
96-колодцевая чёрная, прозрачная полистироловая микропластинаСигма-ОлдричCLS3603-48EAДля анализа клеток-покрытия
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Термо Фишер СайентификD3822Зелёная флуоресцентная длинноцепочечная жирная кислота
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Термо Фишер СайентификD3821Зелёная флуоресцентная жирная кислота с очень длинной цепью
Раствор альбумина из сыворотки крупного рогатого скотаСигма-ОлдричA9205-50MLИспользуется для подготовки комплекса Bodipy:BSA
Диметилсульфоксид (DMSO)Сигма-ОлдричD2650Растворитель для запасов лекарств
Одноразовые пипетные резервуарыVWR89094-680Содержит различные растворы для пипетирования на ячейки
Дульбекко s Модифицированный Орел» s СредаCorning Life Sciences10-013-CVСреды для клеток EA.hy926
Ячейки EA.hy926ATCCCRL-2922 Гибридная линия эндотелиальных клеток
Набор для эндотелиальных клеток EGM-2, среда-2 для роста эндотелиальных клетокЛонзаCC-3162Медиа для HUVEC
Сыворотка плода для крупного рогатого скота (FBS) VWR97068-08510% добавка при EGM-2 и DMEM
Флуоресцентный микропластиночный считывательРазличныеН/ДЛюбой считыватель микропластин, способный измерять флуоресценцию
Желатиновый растворСигма-ОлдричG1393-100 млИспользуется для покрытия пластин с рабочей концентрацией 0,1%
Решение Hoechst 33342Наука о жизни62249Ядерная окрашивание для нормализации клеток (4 & mu; M)
Эндотелиальные клетки пуповиной вены человека (HUVEC)ЛонзаC2519AПервичные эндотелиальные клетки человека
Многоканальный пипеттVWR76627-768Для пипетирования в пластину с 96 лунками
Никосамид Миллипор СигмаN3510-50GОтрицательный контроль, 1 и мю; M  Итоговая концентрация
PBS, с кальцием и магнием.Fisher Scientific21031CVИспользуется для приготовления процедур и как буфер для смывания (с BSA)
PBS, без кальция и магнияGenesee Scientific25-508Для разбавления желатином, окрашивания по методу Hoechst и общих промывок
Пенициллин/стрептомицинТермо Фишер Сайентифик151401221% добавка при EGM-2 и DMEM
Натрий L-лактатСигма-ОлдричL7022-5GПоложительный контроль, конечная концентрация 5 или 20 мМ
Раствор Trypan BlueСигма-ОлдричT8154-20MLИспользуется при 0,08% для подавления внеклеточной флуоресценции
Вакуумные фильтрующие системы, мембрана PES 500 мл, 0,45µ mGenClone25-227Для стерилизации желатинового раствора

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BODIPY96Hoechst

Похожие статьи