Удобный и мощный R-анализ больших наборов данных

С увеличением доступности больших наборов данных в научной области важно разработать удобные инструменты, которые позволят исследователям быстро и легко анализировать эти большие наборы данных. Одним из типов общего большого набора данных является использование гена люциферазы в качестве репортера, что позволило легко, непрерывно и неинвазивно исследовать экспрессию генов в живых клетках и организмах. Автоматизация регистрации люминесценции трансформировала измерение люминесценции люциферазы и привела к расширению сбора данных, в частности, в поле циркадных часов ^1,2. Используя 96-луночные микропланшеты и автоматический считыватель планшетов с укладчиком, тысячи образцов, экспрессирующих ген люциферазы, могут быть индивидуально проанализированы во временных рядах, иногда с интервалом в один час в течение нескольких дней, в одном эксперименте. Такие высокопроизводительные эксперименты привели к созданию больших наборов данных, которые не могли быть достигнуты традиционными экспериментами по экспрессии генов с использованием ручного сбора образцов с последующей обработкой РНК. Своевременный анализ таких больших наборов данных важен, но может быть сложной задачей.

Несмотря на то, что существует множество инструментов для анализа данных на ритмичность, многие из них анализируют анализы, основанные на поведении животных, а не на экспрессию люминесцентного репортера 3,4,5,6,7 (Дополнительная таблица S1). Некоторые инструменты требуют от исследователей предварительных навыков компьютерного программирования, таких как навыки Python или доступ к MATLAB. Другие инструменты требуют покупки программного обеспечения, что может быть дорогостоящим. Некоторые бесплатные рабочие решения доступны в Интернете. Одним из таких инструментов является BioDare2⁸, который предлагает множество различных методов для анализа данных о ритмичности. BioDare2 — это удобный онлайн-инструмент, требующий минимальных вычислительных знаний. Пользователям необходимо выгружать входные данные в режиме онлайн и выгружать выходные данные из онлайн-интерфейса для дальнейшей обработки.

В этой статье мы представляем удобные R-скрипты с множеством возможностей для легкого анализа больших наборов данных. Для запуска скриптов мы используем бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом RStudio⁹, интерфейс для R и Python. RStudio можно использовать на различных компьютерных системах, включая Windows, Mac и Linux. В этом отчете представлены подробные пошаговые инструкции, которые помогут пользователям использовать скрипты R, в частности, в разделах протокола 1 и 2. Этот метод требует минимального вмешательства со стороны пользователя. Новичок, не обладающий предварительными знаниями R и не имеющий опыта программирования, должен уметь использовать этот метод для анализа больших наборов данных из анализов люциферазы или других типов наборов данных с данными временных рядов. Все входные и выходные данные хранятся на локальном компьютере, и, таким образом, анализ может быть выполнен в любом месте без ограничения доступа к Интернету после первой загрузки всех соответствующих пакетов R. Выходные данные сортируются по хорошо организованным папкам, а результаты готовы к обработке для публикации. Статистический анализ также включается в состав выходных данных для быстрой оценки различий между выборками. Таким образом, метод R может стать простым и мощным решением для исследователей при анализе больших наборов данных.

1. Анализ циркадных часов на основе люциферазы

1. Экспериментальная установка для анализа люциферазы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ люциферазы является распространенным методом, используемым для измерения активности циркадных часов в режиме реального времени. Люминесценция, испускаемая люциферазным репортером, переносимым живыми трансгенными организмами и/или клетками, может регистрироваться автоматически, что приводит к созданию крупномасштабных наборов данных временных рядов. В нашей лаборатории в основном используются проростки Arabidopsis thaliana, экспрессирующие ген люциферазы в качестве репортера. На рисунках 1 и 2 показана блок-схема типичной экспериментальной установки для анализа люциферазы с рассадой в формате 96 лунок в нашей лаборатории, модифицированная на основе предыдущего описания².
   1. Стерилизовать семена парами отбеливателя, полученными при добавлении 3 мл 36% (w/w) HCl в 100 мл домашнего отбеливателя в стакане в течение 3 часов. Поместите стакан в банку-колокольчик с герметичной крышкой, помещенную в вытяжной шкаф для химикатов. После стерилизации поместите семена на пластины 1/2MS, содержащие 0,5% сахарозы и 0,8% агара (pH 5,7), с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера в ламинарном шкафу. Соберите химические отходы в банку с крышкой и утилизируйте их, сотрудничая с отделом санитарной охраны окружающей среды.
   2. Поместите планшеты при температуре 4 °C на 2 дня перед тем, как переместить их в камеру для культивирования тканей с 12-часовым световым циклом и 12-часовым темным световым циклом (LD).
   3. Дайте рассаде подрасти за 4 д в LD.
   4. Пересадить рассаду на 96-луночную пластину; каждая лунка содержит 180 мкл пробирной среды (1/2 мс, 0,5% сахарозы, 0,4% агара, 0,25 мМ люциферина). Поместите пластины на 1 день в LD, а затем на 1 день в течение 24 часов при постоянном освещении (LL).
   5. Добавьте обработку или имитацию раствора в лунки и регистрируйте люминесценцию с интервалом в 1 час в течение 5-7 дней в LL. Установите линзу фильтра излучения на 3 600 для усиления и время интервала измерения на 1 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время начала записи может быть в любое время. Однако, поскольку скрипт R принимает только целые числа (целые числа), интервалы записи должны быть целым числом. Например, интервал в 1 час разрешен, но интервал в 15 минут не разрешен для скрипта R.
   6. В конце записи сделайте фото пластины, чтобы зафиксировать рост рассады.
   7. Сохраняйте необработанные данные в виде файла CSV для анализа R, используя функцию сохранения как с программным обеспечением для анализа данных для считывателя пластин.
2. Пошаговое объяснение R-анализа циркадных данных на основе люциферазы
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе R используется скрипт RДополнительный файл 1(LUC_2025.R), разработанный для анализа циркадных данных, и входной файлДополнительный файл 2(NO7.csv). Скрипт R вместе с входным файлом находится в открытом доступе через онлайн-платформу репозитория Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Загрузите программное обеспечение RStudio, совместимое с компьютерной системой ^9,10.
   2. Загрузите алгоритмические пакеты RStudio, необходимые в Дополнительном файле 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: алгоритм ARSER¹² пакета MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ и broom²⁰.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Список пакетов см. также в верхней части скрипта R.
   3. Изменение вводимых пользователем данных I (в соответствии с конкретным набором данных на локальном компьютере, включая рабочий каталог, имя входного файла, метки для обработки и относительное время начала анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.2.1 и 1.2.2 необходимо выполнить только один раз; после чего консоль интерфейса RStudio готова к приему пользовательского ввода с изменениями для каждого нового анализа. Раздел «Ввод данных пользователем» состоит из двух частей (дополнительный рисунок S1).
      1. Выберите рабочий каталог. Укажите, где находится входной файл. В этой же папке будут находиться выходные файлы.
      2. Выберите входной файл, CSV-файл, правильно отформатированный для скрипта R (рисунок 2B). В частности, верхняя строка содержит временные ряды, а первая колонка содержит отдельные положения образцов на 96-луночном планшете.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пример такого входного CSV-файла можно найти в Дополнительном файле 2 (NO7.csv).
      3. Назовите образцы и/или методы лечения. Поскольку этот анализ используется для данных, полученных из 96-луночных установок с временным ходом, спланируйте эксперименты как 8 повторений на одну обработку, что в общей сложности составляет до 12 обработок на планшет, или как 12 повторений на одну обработку, что в общей сложности составляет до 8 обработок на планшете. Убедитесь, что вы ввели правильное количество сэмплов, 8 или 12, потому что количество сэмплов имеет значение; Если количество выборок не равно 8 или 12, код не будет выполняться. Однако, если есть ряды пустых лунок, просто перечислите их как таковые в поле для названий лечения, например, назвав пустым 1, пустым 2...
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов имен следует избегать использования обратных косых черт или подобных символов, так как они могут вызвать проблемы с именами файлов. Кроме того, следует также избегать использования «NA» в качестве метки при выборе использования ANOVA в пользовательском вводе II. Любые процедуры с точно таким же названием будут объединены в одну большую группу процедур.
      4. Укажите относительное время начала анализа. Для данного дня продолжительностью 24 часа субъективный рассвет — это когда свет в камере включается во время нормального цикла света/темноты. Например, если свет горит в 7 часов утра, считайте это время циркадным временем 0. Если анализ люциферазы начинается в 9 часов утра, время анализа приходится на циркадное время 2; Введите 2 в качестве относительного времени начала.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Относительное время начала должно быть целым числом и не может быть отрицательным. Это повлияет на показания фазы образцов.
   4. Изменяйте параметры пользовательского ввода II в соответствии с конкретными потребностями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже инструкции содержат более подробное объяснение разделов «Ввод данных пользователем» и пошаговое руководство по внесению изменений.
      1. Включите графики: кривые люминесценции, графики периода, фазы и амплитуды для каждого генотипа и лечения.
      2. Используйте тест ANOVA с тестом Tukey HSD для сравнения процедур по периоду, фазе и амплитуде. Выберите элемент управления для тестового выхода ANOVA; укажите контрольную точку для теста ANOVA или оставьте опцию пустой, чтобы использовать каждую обработку в качестве контроля при попарном сравнении. Кроме того, можно выбрать, следует ли нумеровать выходные файлы ANOVA для более быстрого поиска и организации.
      3. Используйте t-критерий для сравнения лечения по периоду, фазе и амплитуде. Выберите, должен ли t-критерий быть попарным сравнением; Если выбран попарный t-критерий, выберите, являются ли данные парными. Выберите элемент управления для t-критерия; Укажите контрольную точку для Т-критерия или оставьте опцию пустой, чтобы использовать каждую процедуру в качестве контрольной. Выберите, следует ли нумеровать выходные файлы t-теста для более быстрого поиска и организации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует использовать только для сравнения двух методов лечения одновременно, например, двух линий одного и того же генотипа с добавлением SA или Mock. Показанные p-значения не корректируются для учета множественных сравнений с одной и той же линией.
      4. Выберите, следует ли округлять временные точки. Если временные точки отличаются всего на минуту или две, округлите до ближайшего часа и используйте этот анализ.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код вычисляет период, фазу и амплитуду с использованием метода^{ARS 12}. Для выполнения этого метода требуется согласованный временной ряд в часах.
      5. В зависимости от того, как считыватель пластин записывает лунки, изменяйте способ считывания входных данных. Выберите либо стандартный список данных скважин по А1, А2, А3... или для скважин, перечисленных A1, B1, C1...
   5. Запустите анализ, просто нажав кнопку «Источник» в правом верхнем углу консоли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ занимает менее 1 минуты. Выходные данные R-анализа автоматически появятся в той же папке с файлами, что и входной набор данных.
   6. Просмотр выходных данных: Выходная папка содержит несколько документов и подпапок для обеспечения всестороннего анализа, включая статистическую информацию об усредненном периоде, фазе и амплитуде для репликаций каждого генотипа и/или лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для входного файла Supplemental File 2 (NO7.csv) список выходных документов, сгенерированных сценарием Supplemental File 1 (LUC_2025.R) в разделе протокола 1, описан в Таблице 1 и может быть удобно просмотрен с помощью древовидной структуры на Дополнительном рисунке S2.

2. Анализ АФК на основе люминола

1. Экспериментальная установка для анализа АФК
   1. Разрежьте листовые диски диаметром 4 мм с четвертого по седьмой листы 25-дневных растений с помощью дырокола для биопсии.
   2. Поместите листовые диски волосистой стороной вверх на 100 μл стерильной воды в 96-луночный планшет.
   3. Накройте тарелку чистой оловянной фольгой и поместите ее в камеру для выращивания LD на ночь.
   4. Замените воду 100 мкл раствора люминола (300 мкМ в 10 мМ буфере MOPS с pH 7,4 и 1 мкМ flg22 или другим элицитором). Используйте фиктивное решение вместо flg22 в качестве элемента управления.
   5. Немедленно начните записывать показания люминесценции каждую минуту в течение 40-60 минут.
2. Пошаговое объяснение R-анализа данных АФК
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе R используются Rstudio, скрипт R,  Supplemental File 3 (ROS_2025.R) и входные файлы Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) или Supplemental File 5 (ROS_elf26.csv). Скрипт R вместе с входным файлом Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) находится в открытом доступе через онлайн-платформу репозитория Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Загрузите пакеты RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ и filesstrings¹⁷.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2.1 необходимо выполнить только один раз. Чтобы помочь пользователям адаптировать каждый анализ к определенному набору данных на компьютере, был создан раздел под названием «Ввод данных пользователем», позволяющий пользователям указывать конкретные параметры для своих экспериментов (дополнительный рисунок S3).
   2. Изменяйте вводимые пользователем данные I в соответствии с определенным набором данных на локальном компьютере, включая рабочий каталог, имя входного файла, метки для обработки и относительное время начала анализа.
      1. Выберите рабочий каталог. Укажите, где находится входной файл. В этой же папке будут находиться выходные файлы.
      2. Выберите входной файл, CSV-файл, правильно отформатированный для скрипта R (рисунок 2B). В частности, верхняя строка содержит временные ряды, а первая колонка содержит отдельные положения образцов на 96-луночном планшете.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пример такого входного файла CSV можно найти в дополнительном материале, Дополнительный файл 4 (ROS_flg22.csv) или Дополнительный файл 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Назовите образцы и/или методы лечения. Поскольку этот анализ используется для данных, полученных из 96-луночных установок с временным ходом, спланируйте эксперименты как 8 повторений на одну обработку, что в общей сложности составляет до 12 обработок на планшет, или как 12 повторений на одну обработку, что в общей сложности составляет до 8 обработок на планшете. Если есть ряды пустых лунок, просто перечислите их как таковые в поле для названий процедур, например, назвав пустым 1, пустым 2...
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно ввести правильное количество сэмплов, 8 или 12, потому что количество сэмплов имеет значение. Если количество выборок не равно 8 или 12, код не будет выполняться. В качестве примеров имен избегайте использования обратных косых черт или подобных символов, так как они могут вызвать проблемы с именами файлов. Также избегайте использования "NA" в качестве метки при выборе использования ANOVA в пользовательском вводе II. В отличие от сценария Supplemental File 1 (LUC_2025.R), обработки с одинаковыми именами не объединяются в одну группу в этом сценарии Supplemental File 3 (ROS_2025.R).
   3. Изменяйте параметры пользовательского ввода II в соответствии с конкретными потребностями пользователя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример ввода данных пользователем можно увидеть на дополнительном рисунке S3.
      1. Используйте тест ANOVA с тестом Tukey HSD для сравнения сумм люминесценции лечения.
      2. Используйте двусторонний t-критерий, чтобы сравнить данные только двух процедур одновременно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Отображаемые p-значения не корректируются для учета множественных сравнений с одной и той же линией.
      3. Составьте график кривых флуоресценции и столбчатую диаграмму, сравнивающую общую сумму флуоресценции. Добавьте на графики стандартное отклонение или стандартную ошибку среднего значения.
      4. В зависимости от того, как считыватель пластин записывает лунки, изменяйте способ считывания входных данных. Либо воспользуйтесь стандартным списком данных скважин по А1, А2, А3... или для скважин, перечисленных A1, B1, C1...
3. Запустите анализ, просто нажав кнопку «Источник» в правом верхнем углу консоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ занимает менее 1 минуты. Выходные данные R-анализа автоматически появятся в той же папке с файлами, что и входной набор данных.
4. Просмотр выходных данных: Выходная папка содержит несколько документов и подпапок для обеспечения всестороннего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для входного файла Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) древовидная структура выходных документов, сгенерированных сценарием Supplemental File 3 (ROS_2025.R), описанным в разделе протокола 2, показана на дополнительном рисунке S4.

Пример из практики 1. Люминесцентный анализ активности циркадных часов на проростках арабидопсиса

Ранее мы показали, что ген ГЛИЦИН-БОГАТОГО РНК-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА 7 (GRP7) контролируется белком мастер-часов CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1), а циркадная экспрессия GRP7 важна для его роли в защите растений, используя трансгенные растения Col-0, экспрессирующие репортер люциферазы под контролем промотора GRP7 дикого типа (pGRP7wt:LUC)21. Мы проанализировали активность циркадных часов этих трансгенных растений вместе с контрольным растением CCA1:LUC/Col-0 с использованием скрипта R с именем LUC_2025.R (Дополнительный файл 1 в разделе протокола).

Входной файл с именем NO7.csv (Supplemental File 2) содержит показания люминесценции для семи независимых линий pGRP7wt:LUC и регулятора CCA1:LUC/Col-0 (Supplemental File 2 (NO7.csv)). После запуска скрипта выходная подпапка с именем NO7 output будет сгенерирована в той же папке, что и входной файл NO7.csv (Supplemental File 2 (NO7.csv)). Файлы выходной папки NO7 описаны в таблице 1 и могут быть удобно просмотрены с помощью древовидной структуры на дополнительном рисунке S2. Значения в выходной папке NO7 были дополнительно обработаны для получения рисунков 3 и 4. На рисунке 3 показано, что репортер CCA1:LUC показал амплитуду 3000 RLU, период 23,5 ч и фазу 3,5 ч. Эти параметры часов во многом согласуются с предыдущими отчетами22,23. Иная картина экспрессии наблюдалась для линий pGRP7wt:Luc. В то время как все линии pGRP7wt:LUC оказались схожими по периоду и фазе, были различия в значениях амплитуды этих линий, вероятно, из-за позиционного эффекта трансгенов в хромосомах. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены после вычисления параметров периода, амплитуды и фазы с помощью скрипта R (рис. 4). Чтобы проверить этот анализ, тот же набор данных был повторно проанализирован с помощью BioDare2, бесплатной онлайн-платформыдля анализа циркадных данных. Результаты R-анализа были сопоставимы с результатами, полученными с помощью алгоритма 8,24 BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) (рис. 4).

Кейс 2. Люминесцентный анализ активности циркадных часов с клетками млекопитающих
Сценарий R LUC_2025.R (Дополнительный файл 1) был далее использован для анализа активности циркадных часов, демонстрируемой клетками млекопитающих25. Клеточная линия U2 OS, экспрессирующая репортер циркадных часов, является широко используемой модельной клеточной линией для измерения активности циркадных часов млекопитающих26,27. Мы повторно проанализировали данные временных рядов, полученные клетками U2 OS, экспрессирующими репортер Per2d:Luc, культивируемый в 96-луночном планшете. Клетки обрабатывали молекулами миРНК, нацеленными на определенные гены. На рисунке 5 показано, что отрицательные контрольные клетки, которые не обрабатывались миРНК, показали период 23,3 ч, фазу 2,8 ч и амплитуду 184,8 RLU. Как и ожидалось, миРНК, нацеленная на ген CRY2, значительно ослабляла амплитуду и влияла на период и фазу репортера. Гены PSMD4 и PSMD7 кодируют белки, входящие в состав компонента протеасомной крышки 26S для деградации белка. В соответствии с предыдущим отчетом25, R-анализ показывает, что сбивание PSMD4 или PSMD7 их соответствующими миРНК не влияет на параметры часов. Таким образом, этот R-скрипт легко применим к различным экспериментальным системам для изучения циркадных часов.

Кейс 3. Анализ АФК для защитного ответа
В дополнение к большим наборам данных из анализов люминесцентных циркадных часов, скрипт R может быть адаптирован для анализа других типов данных. Здесь мы представляем одно из таких приложений для количественного определения активных форм кислорода (АФК). Известно, что растения развили различные стратегии борьбы с вторжением патогенов. Одна из стратегий заключается в распознавании несобственных молекул патогена и последующей активации врожденных иммунных реакций. Одним из таких ранних иммунных ответов является всплеск АФК, происходящий в течение нескольких минут, когда хозяин сталкивается с несобственной молекулой. Типичный анализ АФК проводили с помощью 96-луночного планшета, содержащего 12 листовых дисков на каждый генотип на каждую обработку (раздел 2 протокола). Здесь две общие молекулы элиситора, flg22, пептид из 22 аминокислот, полученный из консервативной области белков бактериального флагеллина28, и elf26, пептид из 26 аминокислот из фактора удлинения белка Tu29, были использованы для индуцирования взрыва АФК. Сценарий Supplemental File 3 (ROS_2025.R) был разработан для анализа данных ROS. Два файла CVS из анализов ROS, Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) и Supplemental File 5 (ROS_elf26.csv), которые были преобразованы в формат R-анализа, можно скачать в разделе «Дополнительные материалы». После R-анализа выходные папки должны быть сгенерированы в той же папке, что и каждый входной файл на собственном компьютере, содержащие кривые всплеска ROS и общие значения ROS за время анализа, а также статистический анализ (дополнительный рисунок S4). Данные были дополнительно обработаны для получения рисунка 6. Показанные здесь результаты аналогичны опубликованным, которые были обработаны вручную30.

Рисунок 1: Блок-схема анализа люциферазы для R-анализа. Сеянцы, экспрессирующие люциферазный репортер, приводимые в действие часовым промотором, стерилизовали и выращивали на 1/2 MS среды в LD в течение 4 дней. Рассаду пересаживают в 96-луночные планшеты, содержащие 180 мкл 1/2 МС среды, содержащей D-люциферин. В каждой лунке содержался по одному саженцу. Через 1 день в LD с последующим 1 днем в LL, люминесценцию регистрировали с помощью планшетного ридера. Проростки на планшете обычно регистрировали на люминесценцию в LL с интервалом в 1 ч в течение 5-7 дней. После записи пластины были сфотографированы для оценки роста рассады, а исходные данные были сохранены в виде файла CSV для анализа R. Сокращения: LD = 12 ч светло/12 ч темно; LL = постоянный свет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Блок-схема сбора данных люминесценции и R-анализа. (А) Описана пятиступенчатая процедура анализа циркадных часов с использованием скрипта R. Шаг 1. Организуйте эксперименты по 8 или 12 саженцев на каждый генотип и/или на одну обработку; Шаг 2. Регистрировать люминесценцию в ЛЛ с интервалом в 1 ч в течение 5-7 дней; Шаг 3. Получение и форматирование данных в CSV-файле; Шаг 4. Анализировать данные с помощью R; и Шаг 5. Просмотр выходных данных. Время начала записи может быть в любое время. Однако, поскольку скрипт R принимает только целые числа (целые числа), интервалы записи должны быть целым числом. (B) Скриншот входного CSV-файла, правильно отформатированного для скрипта R. Исходный входной файл, NO7.csv, можно найти в Дополнительном файле 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Циркадная экспрессия pGRP7wt:LUC в трансгенных растениях. Показаны люминесцентные следы pGRP7wt:LUC. Столбцы под осью x обозначают субъективный день (открытые столбцы) и ночь (серые столбцы). Люминесцентный след каждого генотипа составляет в среднем 12 репликатов. Погрешности не отображались из-за большого количества кривых. Аббревиатура: RLU = Единицы относительной люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение выходных данных скрипта R и BioDare2. Тот же набор данных, показанный на рисунке 3, был проанализирован скриптом R и BioDare2 для параметров циркадных часов, амплитуды, периода и фазы. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n=12). Разные буквы указывают на значительную разницу между образцами (P < 0,05; Односторонний ANOVA с апостериорным тестом Тьюки HSD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ активности циркадных часов с клетками млекопитающих. Данные временных рядов, полученные с клетками U2 OS, экспрессирующими репортер Per2dLuc, культивируемый на 96-луночном планшете в DD, были описаны ранее 25. Для лечения клеток использовали молекулы миРНК, нацеленные на CRY2, PSMD4 или PSMD7. (А) Следы люминесценции. (b) амплитуда, период и фаза per2d:Luc. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n = 3). Разные буквы на панели (B) указывают на значительную разницу между отрицательным контролем и образцом, обработанным миРНК (P<0,05; Односторонний ANOVA с апостериорным тестом Тьюки HSD). Сокращение: RLU = единица относительной люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Анализ всплесков АФК по R. Проростки регистрировали на единицу относительной люминесценции сразу после обработки 1 мкМ flg22 (слева) или 1 мкМ elf26 (справа). (A) Следы люминесценции, усредненные из 12 сеянцев на каждый генотип (n = 12) в течение времени после выявления. Средние значения по генотипу на одно лечение являются частью результата R. (B) Усредненное общее количество люминесценции для каждого генотипа с обработкой flg22 или elf26. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (n = 12). Разные буквы указывают на значительную разницу между образцами (P < 0,05; Односторонний ANOVA с апостериорным тестом Тьюки HSD). Сокращение: RLU = единица относительной люминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Список выходных документов из анализа R. Это список выходных документов, сгенерированных сценарием LUC_2025.R (Supplemental File 1) и входным файлом NO7.csv (Supplemental File 2).

Дополнительный рисунок S1: Скриншоты для Входа I и Ввода II в разделе протокола 1. Ввод данных пользователем I должен быть изменен для адаптации анализа к конкретному набору данных на локальном компьютере. Изменения в пользовательском вводе II являются необязательными в зависимости от экспериментальных настроек. Важно отметить, что сценарий Supplemental File 1 (LUC_2025.R) ожидает, что в файле присутствуют все скважины, а не только выбранные или использованные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок S2: Древовидная структура для выходных документов. Эти выходные данные были сгенерированы с помощью сценария LUC_2025.R (дополнительный файл 1) и входного файла NO7.csv (дополнительный файл 2). Скрипт LUC_2025.R генерирует выходную папку на основе имени входного файла. Более подробно о выходных файлах см. Таблицу 1. Коробки представляют собой папки с файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок S3: Скриншоты для пользовательского ввода I и пользовательского ввода II в разделе протокола 2. Сценарий Supplemental File 3 (ROS_2025.R) использует тот же общий формат ввода, что и сценарий Supplemental File 1 (LUC_2025.R). Ввод данных пользователем I должен быть изменен для адаптации анализа к конкретному набору данных на локальном компьютере. Изменения в пользовательском вводе II являются необязательными в зависимости от экспериментальных настроек. Важно отметить, что сценарий Supplemental File 3 (ROS_2025.R) ожидает, что в файле присутствуют все скважины, а не только выбранные или использованные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок S4: Древовидная структура для выходных документов. Этот вывод был сгенерирован с помощью сценария ROS_2025.R (дополнительный файл 3) и входного файла ROS_flg22.csv (дополнительный файл 4). Скрипт ROS_2025.R генерирует выходную папку на основе имени входного файла. В этой папке находится файл для общего количества ROS и файл для графиков. Существуют также подпапки для данных PRISM и построения графиков, теста ANOVA и t-тестов. Коробки представляют собой папки с файлами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительная таблица S1: Список доступных инструментов биоинформатики для анализа циркадных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: LUC_2025.R. Это скрипт R, используемый для анализа данных циркадных часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: NO7.csv. Это входной файл, содержащий пример данных циркадных часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: ROS_2025.R. Это скрипт R, используемый для анализа данных ROS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: ROS_fig22.csv. Это входной файл, содержащий пример данных ROS. АФК индуцировали обработкой 1 мкМ flg22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное дело 5: ROS_elf26.csv. Это входной файл, содержащий пример данных ROS. АФК индуцировали обработкой 1 мкМ elf26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.