Методическая статья

Оценка влияния факторов SASP на пролиферацию раковых клеток с использованием сравнительного анализа трех различных методологий

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании оцениваются пролиферативные эффекты факторов секреторного фенотипа, ассоциированных со старением (SASP) из стареющих клеток HeLa на нестареющие клетки HeLa с использованием трех моделей in vitro с мониторингом в режиме реального времени. Преимущества и ограничения каждого метода систематически сравнивались, чтобы лучше понять межклеточные взаимодействия при раке.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индуцированные химиотерапией стареющие раковые клетки также секретируют различные факторы, называемые секреторным фенотипом, связанным со старением, для регуляции своего внеклеточного микроокружения. В предыдущих исследованиях сообщалось, что эти факторы SASP оказывают пагубное паракринное воздействие на окружающие клетки, в том числе способствуя пролиферации, эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП), ангиогенезу и миграции. Несколько методов совместного культивирования in vitro широко используются для понимания клеточных процессов, возникающих в результате взаимодействия путем совместного культивирования одних и тех же и разных типов клеток. В данной работе были исследованы потенциальные пролиферативные эффекты факторов SASP, секретируемых стареющими клетками HeLa, на нестареющие клетки HeLa с использованием трех взаимодополняющих подходов in vitro . Первый подход включал совместное культивирование стареющих и нестареющих клеток для исследования паракринной сигнализации, опосредованной SASP. При втором подходе кондиционированные среды, собранные из стареющих раковых клеток, были концентрированы и впоследствии использованы для изучения влияния кондиционированных сред с мониторингом пролиферации в режиме реального времени. В третьем методе стареющие и нестареющие клетки культивировали бок о бок для оценки юкстакриновых эффектов SASP при прямом контакте между клетками. Все три экспериментальные модели последовательно продемонстрировали, что факторы SASP значительно усиливают пролиферацию нестареющих раковых клеток. Примечательно, что совместное культивирование стареющих клеток увеличивало скорость пролиферации на 64,6%, а концентрированная среда, кондиционированная SASP, увеличивала пролиферацию более чем на 50% по сравнению с контрольной группой. Визуализация на основе флуоресценции показала увеличение числа GFP-положительных клеток на 49,3% в условиях юкстакрина. Эти методы в совокупности позволили количественно и качественно оценить SASP-индуцированные пролиферативные изменения. Сравнительный анализ этих подходов подчеркивает их соответствующие сильные и слабые стороны, обеспечивая ценную информацию о паракринных эффектах стареющих клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В многоклеточных организмах клетки общаются с помощью паракринной и юкстакринной сигнализации, обмениваясь сообщениями со своим микроокружением, тем самым влияя на поведение друг друга. Эта связь может происходить либо напрямую, через туннельные нанотрубки и щелевые соединения, либо косвенно через секрецию растворимых химических молекул, таких как цитокины, факторы роста и хемокины, во внеклеточный матрикс. Эти сигнальные механизмы играют важную роль в регулировании различных физиологических процессов, включая развитие тканей и реакцию иммунных клеток, а также участвуют в патогенезе многих заболеваний, таких как рак, ВИЧ, гипертония и болезнь Альцгеймера.

В 1960-х годах Леонард Хейфлик обнаружил, что нормальные человеческие фибробласты имеют ограниченную способность к репликации in vitro2. Это ограниченное состояние пролиферации клеток, которое развивается из-за укорочения теломеразы, называется репликативным старением. Последующие исследования показали, что различные формы клеточного стресса также могут вызывать клеточное старение. Было установлено, что обычные методы лечения рака, такие как химиотерапия и лучевая терапия, также вызывают клеточное старение как в раковых, так и в стромальных клетках, что называется индуцированным терапиейстарением 3,4. Клеточное старение и старение являются иерархически связанными процессами; Они представляют собой различные биологические процессы. Накопление стареющих клеток в организме способствует старению, способствуя воспалению, дисфункции тканей и развитию возрастных заболеваний. Тем не менее, старение включает в себя гораздо более широкий спектр системных событий и механизмов по сравнению со старением5.

Стареющие клетки характеризуются тем, что их расширенная цитоплазма значительно больше и имеет уплощенную морфологию по сравнению с нормальными клетками6. Эти стареющие клетки обладают повышенной лизосомальной активностью и положительны на ассоциированную со старением активность β-галактозидазы (SA-β-gal), лизосомального фермента, который остается активным даже при кислом pH 6,0. Окрашивание SA-β-gal является наиболее широко используемым биомаркером для выявления стареющих клеток7. Увеличение и неправильная морфология ядер обычно наблюдаются в клетках, переживающих старение. Кроме того, эти клетки характеризуются уникальными хроматиновыми перестройками, называемыми старением-ассоциированными гетерохроматическими очагами (SAHF), которые опосредуют необратимую остановку клеточного цикла 8,9.

Хотя стареющие раковые клетки в конечном итоге утратили способность к пролиферации, они оставались жизнеспособными и метаболически активными. Известно, что стареющие клетки также секретируют различные факторы для регуляции своего внеклеточного опухолевого микроокружения, называемого секреторным фенотипом, связанным со старением (SASP)10,11. Эти факторы SASP включают растворимые сигнальные факторы (интерлейкины, хемокины и факторы роста), секретируемые протеазы и секретируемые нерастворимые белки/компоненты внеклеточного матрикса (ECM). В совокупности эти факторы оказывают вредное паракринное действие, в том числе способствуют пролиферации, миграции, инвазии и индукции эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП)4,12. Кроме того, побочные эффекты, вызванные химиотерапией, были частично связаны с накоплением стареющихклеток13. Таким образом, изучение взаимодействия между стареющими и нестареющими клетками стало важной областью исследований в контексте терапии рака. В частности, анализ факторов SASP, в частности их состава и влияния на микроокружение рака, считается перспективной стратегией для идентификации новых молекул-мишеней для терапии рака и открытия новых лекарств для этих молекул.

Методы ко-культивирования in vitro уже давно используются для изучения понимания межклеточных взаимодействий14. Целью данной методической статьи была оценка возможной пролиферативной активности факторов, секретируемых из стареющих клеток, на нестареющие раковые клетки с использованием трех различных методов. Кроме того, были сравнены результаты, полученные с помощью трех различных методов, и критически оценены соответствующие преимущества и недостатки каждого подхода.

Во-первых, была создана модель совместного культивирования между стареющими и нестареющими клетками HeLa для мониторинга возможных изменений в пролиферации раковых клеток в режиме реального времени с использованием системы клеточного анализав реальном времени. Эта система состоит из двух планшетов для оценки межклеточных взаимодействий. Вид e-plate, который образует нижний слой, имеет поверхность, на которой засеваются клетки-мишени, а микроэлектроды расположены в нижней части пластины. Электрическое сопротивление, создаваемое адгезией целевых клеток к этой поверхности, выражается измеряемым параметром Cell Index (CI). Величина CI пропорциональна количеству ячеек и степени адгезии к поверхности15. Кроме того, вид с электронной пластиной позволяет проводить морфологическое исследование клеток под фазово-контрастным микроскопом. Вставка e-пластины, которая образует верхний слой, является областью, где засеваются эффекторные клетки. Дно этой пластины покрыто полупроницаемой мембраной размером пор размером 0,4 мкм. Факторы, секретируемые эффекторными клетками, могут проходить через мембрану и воздействовать на клетки-мишени в виде электронной пластины. Если это взаимодействие стимулирует пролиферацию клеток, то это наблюдается в виде увеличения значения ДИ. Таким образом, взаимодействия между клетками можно оценить количественно.

Во втором методе кондиционированные среды, собранные из стареющих клеток HeLa, концентрировали и добавляли к нестареющим клеткам HeLa. Потенциальный пролиферативный эффект на эти клетки контролировался с помощью системы клеточного анализа в режиме реального времени.

В третьем методе планировалось совместное культивирование стареющих клеток HeLa и нестареющих клеток GFP-HeLa непосредственно в 2D и мониторинг возможных пролиферативных изменений в раковых клетках в режиме реального времени под микроскопом.

Цель этого эксперимента состоит в том, чтобы создать три модели для изучения взаимодействия между стареющими и нестареющими клетками HeLa и отслеживать возможные изменения в пролиферации раковых клеток в режиме реального времени. Таким образом, влияние факторов SASP, секретируемых стареющими раковыми клетками, на другие раковые клетки может быть легко исследовано. Соответственно, были систематически оценены преимущества и ограничения трех подходов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры культивирования клеток проводились в условиях уровня биобезопасности II+ (BSL2+) в сертифицированном безопасном шкафу. Доксорубицин является опасным химиотерапевтическим средством. Все процедуры должны выполняться в сертифицированном шкафу уровня биобезопасности II+ (BSL2+) с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторные халаты и перчатки. Все отходы, содержащие доксорубицин, включая среды и фиксаторы, должны собираться в специально отведенные и четко маркированные контейнеры для опасных отходов и утилизироваться через институциональную систему управления опасными отходами.

1. Модель 1: Совместное культивирование с использованием системы клеточного анализа в реальном времени

  1. Культивирование клеток и индукция старения (День 1-2)
    1. Засейте 8 x 105 клеток HeLa в колбу для культуры T25, содержащую 5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и инкубируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
    2. На следующий день замените среду клеток 5 мл свежей готовой среды. Обрабатывайте клетки 300 нМ доксорубицином напрямую, добавляя его в среду, чтобы вызвать клеточное старение. Выдерживайте колбу T25 в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C в течение 72 часов.
  2. Посев нестареющих клеток (день 4)
    1. Высадите 8 x 105 необработанных клеток HeLa (нестареющий контроль) в новую колбу T25 в 5 мл DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и поддерживайте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  3. Подтверждение индукции старения (День 5)
    1. Чтобы определить, вызывает ли 72 ч лечения доксорубицином старение, проводят окрашивание SA-β-gal6. Проводят этот анализ на отдельном наборе клеток, не используемых в основных экспериментах. Полученные результаты см. на рисунках 1А,В.
    2. Измерьте IL-6 в кондиционированной среде клеток HeLa стареющего рака, чтобы оценить их секреторную активность. Клетки обрабатывают доксорубицином в течение 72 ч с последующей инкубацией в бессывороточной и фенольной среде без красных сред в течение еще 2 дней. Нормализуйте собранную кондиционированную среду по номеру клеток и измерьте уровень IL-6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: IL-6 является отличительным цитокином SASP12. Результаты измерения ИЛ-6 представлены на рисунке 1С.
  4. Настройка системы анализа клеток в реальном времени (День 5)
    1. Включите систему анализа клеток в режиме реального времени перед посевом клеток. Запустите программное обеспечение RTCA 2.0. Нажмите кнопку Exp Notes (рисунок 2) и введите детали эксперимента.
    2. Нажмите кнопку «Запланировать » и добавьте два шага. Первый шаг — для фона. Второй шаг заключается в мониторинге пролиферации клеток каждые 15 минут в течение 72 часов.
    3. Выберите первый шаг и нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы записать импеданс фона, добавив 50 мкл полной среды в каждую лунку вида e-plate.
  5. Посев ячеек в вид e-plate (День 5)
    1. Перед посевом клеток проверяйте обработанные доксорубицином (стареющие) и необработанные (не стареющие) клетки HeLa под фазово-контрастным микроскопом с использованием 10-кратного увеличения. Под микроскопом стареющие клетки имеют гораздо более расширенную морфологию, чем нормальные клетки.
    2. Промойте стареющие и нестареющие клетки HeLa 5 мл стерильного предварительно подогретого PBS, затем аспирируйте.
    3. Добавьте 1 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина и выдерживайте колбу при температуре 37 °C в течение 2 минут, чтобы отделить клетки. Нейтрализуйте трипсин с помощью 5 мл полного DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    4. Центрифугируйте клетки при 500 x g при комнатной температуре в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 5 мл полного DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    5. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя с помощью гемоцитометра.
    6. Семена нестареющих клеток HeLa с плотностью 5 x 103 клеток/лунки в каждой лунке одного вида e-планшета в полном объеме 100 мкл DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    7. Поместите e-plate в подставку системы анализа клеток в режиме реального времени, чтобы клетки могли прикрепляться к поверхности планшета в инкубаторе.
    8. Выберите «Второй шаг» на кнопке графика и нажмите кнопку «Воспроизвести », чтобы начать измерение импеданса с помощью программного обеспечения RTCA 2.0 в течение 72 часов (рис. 2).
  6. Засевающие ячейки во вставку e-plate
    1. Семенные клетки в одной е-пластине вставляют лунки в 60 мкл полного DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    2. Затравка клеток на e-пластину в трех различных экспериментальных установках: Группа 1 (отрицательный контроль): Без затравки клеток (только среда)
      Группа 2: 2 × 104 нестареющих клеток HeLa
      Группа 3: 1 × 105 стареющих клеток HeLa
    3. Поддерживайте вставку e-plate при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение 6 часов для крепления.
  7. Совместное культивирование клеток
    1. Нажмите кнопку Пауза через 6 часов после заселения ячеек. Осторожно отсасывайте питательную среду из каждой лунки на электронном планшете, чтобы удалить сыворотку и неадгезивные клетки.
    2. Промойте лунки 2 раза предварительно подогретым PBS при 37 °C. Добавьте 140 μL DMEM без сыворотки в каждую лунку вида e-plate.
    3. Возьмите вставку для электронной пластины и аспирируйте питательную среду. Аккуратно промойте лунки PBS при температуре 37 °C 2x и добавьте 60 μL бессывороточного DMEM.
    4. Поместите вставку e-plate в вид e-plate и осторожно надавите, пока вставка полностью не сядет в лунку.
    5. Вставьте объединенную пластину в систему анализа клеток в режиме реального времени и нажмите кнопку «Воспроизвести », чтобы возобновить мониторинг значений индекса ячейки в режиме реального времени с интервалом в 15 минут с помощью программного обеспечения (рисунок 2).
    6. Выключите систему анализа клеток в режиме реального времени по окончании эксперимента (рисунок 3A).
  8. Ячейки визуализации на вставке e-plate
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку во вставке e-пластины имеется мембрана, засеянные здесь клетки не могут быть визуализированы на мембране с помощью фазово-контрастной микроскопии. Поэтому, чтобы проверить, сохраняли ли клетки жизнеспособность до конца эксперимента и сохраняли ли стареющие клетки свою структурную целостность, их окрашивали DAPI (рис. 3B).
    1. Извлеките вставку e-plate из вида e-plate. Окрашиваем клетки во вставке e-plate с помощью DAPI и проверяем наличие клеток под флуоресцентным микроскопом16. Известно, что ядра стареющих клеток крупнее, чем ядра нормальных клеток. Поэтому, основываясь на размерах ядер клеток, окрашенных DAPI, определите, какая лунка была засеяна нестареющими клетками, а какие стареющими.
  9. Визуализация ячеек на e-plate view
    1. Непосредственно рассмотрите изображение электронной пластины под фазово-контрастным микроскопом с использованием 10-кратного увеличения (рис. 3B). Поскольку четыре ряда микроэлектродных датчиков были удалены из центра каждой лунки в виде электронной пластины, было создано пространство 6 для обеспечения мониторинга клеток с помощью микроскопии.
  10. Анализ данных
    1. Нормализация значений CI в момент момента, когда вид e-plate и вставка e-plate объединяются и вставляются в систему анализа ячеек в режиме реального времени.
    2. Нажмите кнопку « Анализ данных », чтобы рассчитать скорость и количество пролиферации с использованием данных о максимальном индексе и наклоне клеток, полученных от системы анализа клеток в режиме реального времени (рисунок 2). Затем проанализируйте данные с помощью соответствующей статистической программы (Рисунок 3C, D).

2. Модель 2: Анализ обработки кондиционированной средой с использованием системы клеточного анализа в реальном времени

  1. Культивирование клеток и индукция старения (День 1-2)
    1. Засейте 35 x 10по 4 клетки HeLa в каждую лунку из 6-луночного планшета, содержащего 2,5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и инкубируйте клетки при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5%CO2.
    2. На следующий день замените среду клеток 2,5 мл свежей готовой среды. Обработайте клетки 300 нМ доксорубицином напрямую, добавив его в среду, чтобы вызвать клеточное старение. Поддерживайте 6-луночный планшет в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C в течение 72 часов.
  2. Посев нестареющих клеток (день 4)
    1. Засейте 35 x 104 необработанных клеток HeLa (нестареющий контроль) в каждую лунку нового 6-луночного планшета в 2,5 мл DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и выдерживайте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  3. Проведите подтверждение индукции старения, как описано в шаге 1.3.
  4. Получение кондиционированной среды из стареющих и нестареющих клеток HeLa
    1. Проверьте как обработанные доксорубицином клетки (стареющие клетки), так и необработанные клетки HeLa (нестареющие клетки) под фазово-контрастным микроскопом. Под микроскопом стареющие клетки имеют гораздо более расширенную морфологию, чем нормальные клетки.
    2. Аспирируйте питательную среду из двух 6-луночных планшетов (стареющих и нестареющих клеток HeLa). Промойте клетки 2 раза предварительно подогретым PBS при 37 °C, чтобы удалить остатки сыворотки и остатков клеток.
    3. Добавьте в каждую лунку по 2 мл бессывороточного DMEM с добавлением пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл). Инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 48 часов.
  5. Сбор и концентрирование кондиционированных сред (День 7)
    1. Соберите кондиционированную среду из каждой лунки в стерильные пробирки в ламинарной защитной кабине.
    2. Трипсинизируйте клетки и подсчитайте клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя с использованием гемоцитометра для нормализации кондиционированных сред до количества клеток.
    3. Отрегулируйте кондиционированную среду, нормализованную в соответствии с номером клеток, до конечного объема 2 мл с помощью бессывороточного DMEM с добавлением пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) в стерильных пробирках объемом 2 мл.
    4. Собранную кондиционированную среду центрифугируют при 1000 х г в течение 10 мин при 4 °С для удаления клеточного мусора, а затем центрифугируют при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 °С для получения осветленного надосадочной жидкости.
    5. Центрифугируйте кондиционированный фильтрующий материал с помощью ультрацентробежных фильтрующих установок объемом 2 мл при 4 °C в течение 60 мин при 3 000 x g для его концентрирования. При этой процедуре концентрируется 2 мл кондиционированной среды до концентрации в 500 мкл концентрированной кондиционированной среды, в 5 раз превышающей концентрированную 400 мкл.
    6. Полученные 40 мкл кондиционированной среды разбавить свежей средой, не содержащей сыворотки, для приготовления 1х, 2х и 3х концентрированных кондиционированных сред в стерильных пробирках в ламинарной защитной кабине.
      Примечание: Поскольку среда, остающаяся на клетках в течение 48 ч, истощается из-за клеточного потребления, собранная и концентрированная кондиционированная среда впоследствии разбавляется новой средой.
  6. Засевающие ячейки для просмотра e-plate
    1. Настройте систему анализа клеток в режиме реального времени, как описано в шагах 1.1-1.4. Промойте нестареющие клетки HeLa предварительно подогретым PBS, затем аспирируйте.
    2. Добавьте 1 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина и выдерживайте колбу при температуре 37 °C в течение 2 минут, чтобы отделить клетки. Нейтрализуйте трипсин с помощью 5 мл полного DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    3. Центрифугируйте клетки при 500 x g при комнатной температуре в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 5 мл полного DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    4. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя с помощью гемоцитометра.
    5. Семена нестареющих клеток HeLa с плотностью 5 x 103 клеток/лунки в каждой лунке одного вида в 200 мкл полного DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    6. Поместите e-plate в подставку системы анализа клеток в режиме реального времени, чтобы клетки могли прикрепляться к поверхности планшета в инкубаторе.
    7. Выберите второй шаг на кнопке графика и нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы начать измерение импеданса с помощью программного обеспечения RTCA 2.0 (рис. 2). Нажмите кнопку «Пауза» в программном обеспечении через 6 часов после нанесения нестареющих клеток HeLa (Рисунок 2).
    8. Осторожно отсасывайте питательную среду из каждой лунки на электронном планшете, чтобы удалить сыворотку и неадгезивные клетки. Промойте лунки 2 раза с предварительно подогретым PBS при 37 °C.
    9. Добавьте предварительно подогретую кондиционированную среду до 37 °C в соответствующие группы:
      Группа 1: Свежие медиа
      Группа 2: 1 нестареющая среда для кондиционирования клеток HeLa
      Группа 3: 2 нестареющие среды для кондиционирования HeLa клеток
      Группа 4: 3 нестареющие среды для кондиционирования клеток HeLa
      Группа 5: 1 стареющая среда с клетками HeLa
      Группа 6: 2 стареющие среды с клетками HeLa
      Группа 7: 3 стареющие среды с клетками HeLa
    10. Вставьте изображение электронной пластины в систему анализа ячеек в режиме реального времени и нажмите кнопку «Воспроизвести », чтобы возобновить мониторинг значений индекса ячейки в режиме реального времени с интервалом в 15 минут в течение 48 часов (рисунок 2).
    11. Выключите систему анализа клеток в реальном времени по окончании эксперимента (рисунок 4A).
  7. Визуализация ячеек на e-plate view
    1. Непосредственно рассмотрите изображение электронной пластины под фазово-контрастным микроскопом при 10-кратном увеличении (рис. 4B). Поскольку четыре ряда микроэлектродных датчиков были удалены из центра каждой лунки в виде электронной пластины, было создано пространство для мониторинга клеток с помощью микросопи.
  8. Анализ данных
    1. Нормализовать значения ДИ в момент введения концентрированных кондиционированных сред в нестареющие клетки HeLa.
    2. Нажмите кнопку Анализ данных , чтобы рассчитать скорость и количество пролиферации с использованием данных о максимальном индексе и наклоне ячеек, полученных от системы анализа ячеек в реальном времени (Рисунок 2). Затем проанализируйте данные с помощью соответствующей статистической программы (Рисунок 4C, D).

3. Модель 3: Мониторинг межклеточного взаимодействия в режиме реального времени

  1. Культивирование клеток и индукция старения (День 1-2)
    1. Засейте 8 x 105 клеток HeLa в колбу для культуры T25, содержащую 5 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и инкубируйте клетки при 37 °C во влажной атмосфере с 5%CO2.
    2. На следующий день замените среду клеток 5 мл свежей готовой среды. Обрабатывайте клетки 300 нМ доксорубицином напрямую, добавляя его в среду, чтобы вызвать клеточное старение. Выдерживайте колбу T25 в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C в течение 72 часов.
  2. Посев нестареющих клеток (день 4)
    1. Высейте 8 x 105 клеток GFP-HeLa (нестареющий контроль) в новую колбу T25 в 5 мл DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл) и поддерживайте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    2. Засейте 8 x 105 клеток HeLa (нестареющий контроль) в новую колбу T25 в 5 мл DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (0,1 мкг/мл) и выдержите во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  3. Проведите подтверждение индукции старения, как описано в шаге 1.3 (день 5).
  4. Совместное культивирование клеток
    1. Проверьте клетки, обработанные доксорубицином, необработанные GFP-HeLa и необработанные клетки HeLa под фазово-контрастным микроскопом перед посевом клеток. Под микроскопом стареющие клетки имеют гораздо более расширенную морфологию, чем нормальные клетки.
    2. Промойте все три колбы T25 5 мл стерильного предварительно подогретого PBS, затем аспирируйте. Добавьте 1 мл предварительно подогретого 0,05% трипсина и выдерживайте колбу при температуре 37 °C в течение 2 минут, чтобы отделить клетки.
    3. Нейтрализуйте трипсин с помощью 5 мл полного DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    4. Центрифугируйте клетки при 500 x g при комнатной температуре в течение 10 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 5 мл полного DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    5. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя с помощью гемоцитометра. Затравочные клетки в 200 мкл полного DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (0,1 мкг/мл).
    6. Затравочные клетки на μ слайде высотой 8 лунок в трех различных экспериментальных установках:
      Группа 1: 7 x 103 клеток GFP-HeLa
      Группа 2: 18 x 103 нестареющих HeLa клеток + 7 x 103 GFP-HeLa клеток
      Группа 3: 18 x 103 стареющих HeLa клеток + 7 x 103 GFP-HeLa клеток
    7. Выдерживайте μ-слайд для установки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5%CO2. Через 8 ч промойте клетки предварительно подогретым PBS (37 °C) 2x для устранения влияния сыворотки на клетки.
    8. Добавьте в каждую лунку 200 μL бессывороточного DMEM, содержащего пенициллин (100 Ед/мл) и стрептомицин (0,1 μг/мл).
  5. Настройка микроскопа
    1. Включите регулятор температуры и контроллер CO2 и дайте системе инкубации стабилизироваться в течение 30 минут.
    2. Проверьте концентрациюCO2 и настройки температуры вручную и убедитесь, что достигнуты физиологические условия (5%CO2, 37 °C).
    3. Включите инвертированный флуоресцентный микроскоп и дайте системе завершить самокалибровку. Включите источник флуоресцентного света. Запустите программное обеспечение для визуализации и анализа для управления параметрами визуализации и получения изображений.
  6. Цейтраферная съемка
    1. Поместите предметное стекло на верхнюю инкубационную камеру инвертированной флуоресцентной микроскопии с помощью цифровой камеры высокого разрешения. Откройте программное обеспечение, выберите режимы Part X, Y, Z и T и проведите эксперименты в настройках сбора данных (рис. 5A).
    2. Выберите 20-кратный объектив с высокой контрастностью для флуоресцентной и фазовоконтрастной визуализации (рис. 5A). Добавьте каналы фазового контраста и флуоресценции (фильтр FITC), чтобы обеспечить визуализацию в обоих режимах (рис. 5A).
    3. Нажмите кнопку «В реальном времени », чтобы начать визуализацию живых клеток, затем сфокусируйте клетки под действием фазового контраста (рис. 5A). Откройте окно z-стека и отметьте положение интересующих клеток (содержащих как стареющие/нестареющие клетки HeLa, так и клетки GFP HeLa). Перемещайтесь по ступеням между скважинами с помощью автоматического контроллера ступеней, позволяющего точно определить местоположение выбранных участков для обозначения положения (Рисунок 5A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, в одной и той же лунке предметного стекла может быть выбрано более одной области.
    4. Переключите канал на флуоресцентный, чтобы начать флуоресцентную визуализацию. Установите соответствующие настройки экспозиции (89,506 мс), усиления (10) и интенсивности (136) (рис. 5A).
      Примечание: Эти параметры варьируются в зависимости от интенсивности флуоресценции клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок.
    5. Выберите интервал z-стека мкм, установите верхнее и нижнее положения и настройте z-стек под фазовым контрастом (рис. 5A). Нажмите «Стоп », чтобы закрыть опцию «Трансляция».
    6. Задайте продолжительность (48 часов) и временной интервал (30 минут) с помощью полей «Длительность» и «Временной интервал» для покадровой съемки.
    7. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать визуализацию в течение 48 часов (рис. 5A). Сохраните проект через 48 часов (рис. 5A).
    8. В каждой временной точке (0 ч и 48 ч) выберите лучший кадр из z-стека и экспортируйте изображение (рис. 5A).
    9. Подсчитайте количество GFP-положительных клеток через 0 ч и 48 ч, рассчитайте процентное увеличение GFP-положительных клеток и проанализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения (рис. 1D, E).
  7. Создание фильма
    1. Нажмите кнопку Показать галерею, чтобы отобразить все захваченные изображения, упорядоченные по временным точкам и слоям z-стека (рисунок 5B).
    2. Для каждой временной точки щелкните правой кнопкой мыши на изображении с наилучшим фокусом из соответствующего z-стека и выберите «Выбрать большие пальцы в ряду». Сохраните выбранные кадры (рис. 5B).
    3. Повторите этот процесс индивидуально для каждой позиции. Чтобы выбрать наиболее сфокусированные изображения, используйте функцию «Найти лучшие сфокусированные кадры». Сохраните выбранные изображения с помощью опции «Сохранить выбранные кадры». Сохраненные изображения автоматически загружаются в раздел «Открыть проект».
    4. Щелкните правой кнопкой мыши фильм и выберите «Экспортировать изображение », когда последовательности изображений будут полностью загружены.
    5. Перейдите на вкладку «Фильм» в окне экспорта, установите желаемую частоту кадров (кадров в секунду), при необходимости выберите дополнительные параметры, такие как масштабная линейка, временная метка и т. д., и завершите экспорт, выбрав место назначения с помощью параметра «Обзор» (рис. 5B, Видео 1, Видео 2 и Видео 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой репрезентативной серии экспериментов изучалось потенциальное влияние секреторного фенотипа, связанного со старением, полученного из стареющих раковых клеток, на другие раковые клетки. Таким образом, впервые было подтверждено, может ли лечение доксорубицином в течение 72 ч вызвать старение в клетках HeLa при использовании окрашивания SA-β-Gal. В стареющих клетках лизосомальный фермент β-галактозидаза остается активным даже при низком рН и расщепляет хромогенный субстрат X-gal, образуя синий осадок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамическое взаимодействие раковых клеток в их микроокружении имеет решающее значение для прогрессирования опухоли, что влияет на индукцию метастазирования и развитие вторичной опухоли. Также сообщается, что стареющие раковые и стромальные клетки регулируют опухолевое микроокружение с помощью факторов, выделяемых стареющими клетками4. Эти факторы стимулируют пролиферацию, миграцию, инвазию, дифференцировку клеток и увеличивают множественную лекарственную устойчив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Отделом научных проектов Университета Гази (код гранта: TOA-2021-7321) и TUBITAK (код гранта: 122S564 и 223S969).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
&микро;-Слайд 8 Высота скважиныfigure-materials-1биди80806
0,05 % Трипсин-ЭДТА (1 раз)Gibco25300-054
Центробежные фильтрующие блоки Amicon Ultra (Ultracel-3K)МиллипорUFC200324
CO<суб>2суб> инкубатор (37&°; C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
ДоксорубицинТокрис2252
E-образная пластина ВСТАВКА 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-образный номер ВИД 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Клетки HeLafigure-materials-2Институт AP, Анкара, ТурцияHÜ KÜ K No: 90061901 
Инвертированный флуоресцентный микроскоп Leica DMi8  Leica
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Gibco70011-044
Набор для окрашивания, ассоциированный с возрастанием β-galactozidaza (SA-β-gal);Клеточная сигнализация9860-Е
Система инкубации на верхней стадииPecon 
Контроллер температуры 2002-2 Pecon 
Трипан-голубая краскаСигмаT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HeLa

Похожие статьи