Методическая статья

Раскрытие модификации фосфорилирования с помощью гель-электрофореза Phos-tag SDS-PAGE и анализа in vitro киназы

DOI:

10.3791/68884

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описаны процедуры обнаружения изменений в модификациях фосфорилирования белков-мишеней с помощью гель-электрофореза Phos-tag в клинических образцах и анализов киназы in vitro .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфорилирование — это классическая посттрансляционная модификация, которая регулирует функцию белка. Белки обычно содержат несколько потенциальных сайтов фосфорилирования, которые могут быть модифицированы различными киназами в разных местах. Для изучения изменений фосфорилирования белков-мишеней при заболевании часто требуются фосфоспецифические антитела. Однако коммерческие варианты могут быть ограничены одним сайтом или полностью недоступны. В данной работе описан метод обнаружения изменений в модификациях фосфорилирования белков-мишеней в клинических образцах с помощью электрофореза в геле Phos-tag и идентификации подробных сайтов фосфорилирования с помощью анализов киназы in vitro . Фосфорилированные белки, связанные с Phos-tag, демонстрируют более медленную скорость миграции при гель-электрофорезе SDS-PAGE, что позволяет проводить полуколичественный анализ изменений фосфорилирования в патологических тканях на основе средней интенсивности пикселей медленно мигрирующих полос. Комбинируя Phos-tag SDS-PAGE с иммуноблоттингом с использованием панспецифических антител против нескольких белков-кандидатов, исследователи могут эффективно идентифицировать целевые белки с изменениями фосфорилирования. После скрининга киназ-кандидатов проводятся анализы киназы in vitro с белком-мишенью, а полученные фосфорилированные продукты подвергаются масс-спектрометрии для точной идентификации сайта. Этот метод не требует специфических антител к фосфорилированному белку, что позволяет проводить широкомасштабный скрининг образцов тканей для выявления измененных состояний фосфорилирования при заболевании. Кроме того, идентифицированные сайты фосфорилирования могут быть использованы для разработки специфических антител для количественного и локализационного анализа в тканях заболевания, что обеспечивает более глубокое понимание их функциональных ролей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фосфорилирование является ключевой посттрансляционной модификацией для модуляции субклеточной локализации, киназной активности и транскрипционной активности белков. В геноме человека обнаружено более 500 генов протеинкиназы, которые участвуют в передаче сигнала, экспрессии генов и белок-белковомвзаимодействии. Фосфорилирование и дефосфорилирование находятся под контролем различных киназ, которые быстро обратимы для регуляции клеточной адгезии, пролиферации клеток и клеточной дифференцировки2. Тем не менее, аномальные модификации фосфорилирования белка ответственны за многие заболевания человека, включая онкогенез, аутоиммунные расстройства, нейродегенерацию и субфертильность 3,4,5.

Фосфопротеомное профилирование клинических образцов позволяет получить несколько кандидатов в дифференциально фосфорилированные белки6. Для выявления ключевых модификаций фосфорилирования при заболеваниях человека необходим простой и эффективный метод определения статуса фосфорилирования специфических белков-мишеней. Фосфорилирование в различных участках может привести к отчетливым функциональным изменениям в белке. Следовательно, использование специфических для фосфорилирования антител, нацеленных на определенные аминокислотные сайты, несомненно, является лучшим методом для обнаружения изменений в фосфорилировании белков. Тем не менее, хорошо охарактеризованные фосфоспецифические антитела отсутствуют для многих белков. Кроме того, требуется более подходящий подход для выявления новых потенциальных сайтов фосфорилирования. Фосфорилирование на определенных аминокислотных остатках часто изменяет скорость миграции белка при гель-электрофорезе, а более медленно мигрирующие полосы могут отражать изменения в статусе фосфорилирования7. Однако эти сдвиги в мобильности обычно незначительны, что затрудняет их различие. Фос-таг представляет собой синтезированное химическое соединение, разработанное из каталитического домена щелочной фосфатазы в качестве модели, которое может захватывать фосфорилированные остатки Ser/Thr/Tyr и His/Asp/Lys. Таким образом, конъюгация фос-тегов эффективно усиливает различия в скорости миграции между фосфорилированными и нефосфорилированными белками, а также различает вариации в количестве сайтов фосфорилирования8.

Эта методология на основе Phos-tag для обнаружения изменений фосфорилирования целевых белков в образцах тканей имеет явные преимущества по сравнению с традиционными подходами. Важно отметить, что он устраняет необходимость в фосфоспецифических антителах, вместо этого используя стандартные белок-специфические антитела WB-класса для обнаружения. Фосфорилированные и нефосфорилированные формы белков-мишеней разрешаются в виде отдельных полос во время Phos-tag SDS-PAGE, что позволяет полуколичественно оценить изменения уровня фосфорилирования при болезненных состояниях с помощью сравнительного анализа интенсивности полос. Рабочий процесс в этом протоколе включает: (1) разделение образцов белка Phos-tag SDS-PAGE, (2) иммуноблоттинг на фосфорилированные мишени, (3) анализы киназ in vitro с киназами-кандидатами, верифицированными антителами фосфо-Ser/Thr. Последующий масс-спектрометрический анализ (проведенный внешней сервисной платформой) идентифицирует сайты фосфорилирования, что позволяет разработать сайт-специфические антитела; Подробная методология не включена в настоящий протокол. Примечательно, что этот подход был успешно применен для обнаружения изменений фосфорилирования Nur77 в клинических образцах, идентификации киназы Mst1 в качестве регулятора фосфорилирования Nur77 и разработки сайт-специфического фосфоантитела для клинического обнаружения фосфорилирования на треонине 366 Nur779. Таким образом, этот подход оказывается особенно ценным на предварительных этапах исследований при изучении нескольких белков-кандидатов, поскольку он позволяет проводить широкомасштабный скрининг изменений статуса фосфорилирования по многочисленным мишеням с использованием коммерчески доступных антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Институциональные наблюдательные советы больницы Drum Tower в Нанкине одобрили исследование на людях (2013-408081-01). Текущий протокол составлен с использованием ткани эндометрия в качестве репрезентативной модели. При соответствующей оптимизации эта методология может быть распространена на другие клинические образцы, включая, помимо прочего, опухолевые ткани для экстракции белка и последующих анализов. Биопсия эндометрия проводится в середине секреторной фазы у фертильных женщин (контрольная группа) и женщин с рецидивирующей неудачной имплантацией эмбрионов, перенесшихэкстракорпоральное оплодотворение-перенос эмбрионов (группа заболеваний). Все пациенты дали информированное согласие до начала процедуры забора проб. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка образцов

  1. Полученные свежие образцы тканей дважды промыть предварительно охлажденным PBS для удаления клеток крови и разделить примерно 100 мг ткани в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Поместите ткань в трубку для измельчения с круглым дном объемом 2 мл, содержащую 1 мл буфера для лизиса белка ткани (150,0 ммоль/л NaCl, 1,0% NP-40, 50,0 ммоль/л Трис pH 8,0, 0,5% дезоксихолат натрия, коктейль ингибиторов протеазы и коктейль ингибиторов фосфатазы 2 и 3).
  3. Установите скорость высокоскоростного диспергатора тканей на уровень 5 (из 6 уровней) и измельчите ткань в течение 10 с, а затем 30 с инкубации на льду. Повторите этот процесс 5 раз, чтобы получить гомогенат тканей.
  4. Лизируйте гомогенат путем медленного вращения на вибростенде при температуре 4 °C в течение 30 минут, затем центрифугируйте при 4 °C и 13 000 × г в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость.
  5. Определяют концентрацию белка с помощью метода ВСА.
  6. Возьмите в общей сложности 300 г белка, доведите до равного объема и смешайте с 4× буфером для образца белка Laemmli. Денатурируйте смесь, нагревая ее при 95 °C в течение 8 минут, охлаждая до комнатной температуры, а затем загружая для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этапом 2 рекомендуется провести обычный вестерн-блоттинг для обнаружения интересующего белка с использованием общего количества антител для оценки уровней экспрессии.

2. Гель-приготовление геля Phos-tag SDS-PAGE

  1. Приготовьте 100 мл 30% w/v Акриламид/N, N'-метилен-бисакриламидный смешанный раствор, добавив 29,0 г акриламида и 1,0 г N'-метилен-бисакриламида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите при температуре 4 °C в темноте.
  2. Приготовьте 1,5 моль/л раствора Tris-HCl (pH 8,8), 0,5 моль/л раствора Tris-HCl (pH 6,8), 10% w/v раствора SDS и 10% w/v раствора персульфата аммония, используемых в обычном SDS-PAGE.
  3. Приготовьте раствор Phos-tag 5,0 ммоль/л и раствор MnCl2 10 ммоль/л для геля Phos-tag SDS-PAGE.
  4. Приготовьте раствор разрешающего геля, в случае приготовления раствора 10 мл с 6 мас.% полиакриламидного геля с 50 μМ раствором Фос-тага и 100 μМ MnCl2, смешав 2 мл 30% (масс./об.) смешанного раствора акриламида/бис-акриламида, 2,5 мл 1,5 моль/л раствора Трис/HCl (pH 8,8), 0,1 мл 5,0 ммоль/л раствора Фос-тага, 0,1 мл 10 ммоль/л раствора MnCl2 , 0,1 мл 10% (мас./об.) раствора SDS, 10 мкл TEMED и 5,14 мл дистиллированной воды.
  5. Осторожно смочите приготовленный раствор растворителя для обеспечения однородности, затем поместите пробирку с раствором геля в вакуумный эксикатор и подайте вакуум (0,1 МПа) на 2 минуты, пока не останутся видимые пузырьки.
  6. Добавьте 50 μл 10% персульфата аммония и аккуратно перемешайте.
  7. Немедленно пипетируйте раствор в собранную гелевую кассету до тех пор, пока он не достигнет ~1 см ниже верхнего края короткой пластины. Избегайте образования пузырей.
  8. Аккуратно налейте 0,5 мл дистиллированной воды поверх геля, чтобы исключить попадание воздуха и обеспечить плоскую границу раздела. Дайте полимеризоваться при комнатной температуре в течение 20-30 минут.
  9. В то же время приготовьте стандартный раствор геля Tris-HCl с буферным стекированием (4,5% по сравнению с полиакриламидным гелем), смешав 0,6 мл 30% (по массе) смешанного раствора акриламида/бис-акриламида, 1 мл 0,5 моль/л раствора Tris-HCl (pH 6,8), 40 μл 10% (по массе) раствора SDS, 4 μл TEMED и 2,33 мл дистиллированной воды. Аккуратно завихрить и дегазировать.
  10. Убедитесь, что гель полностью застыл (наклоните гелевую кассету, чтобы наблюдать за наклоном верхнего слоя жидкости, подтверждая неподвижность промежуточной границы). Осторожно слейте водную накладку, затем полностью слейте воду.
  11. Добавьте 20 μл 10% персульфата аммония в приготовленный раствор геля для укладки, аккуратно перемешайте и сразу же нанесите его пипеткой поверх разрешающего геля.
  12. Осторожно поместите расческу на 10 или 15 лунок в стекируемый гелевый раствор, избегая образования пузырей. Дайте стекируемому гелю полимеризоваться при комнатной температуре в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте гель непосредственно перед использованием. Пожалуйста, оптимизируйте концентрацию Phos-меченного и акриламида для каждого интересующего белка.

3. Электрофорез Phos-tag SDS-PAGE

  1. Соберите оборудование для электрофореза и заполните электродные камеры обычным рабочим буфером Tris/Glycine/SDS.
  2. Загрузите образец белка по 30 мкг в каждую лунку с помощью микропипетки.
  3. Проводите электрофорез при постоянном токе (30 мА/гель) до тех пор, пока бромфенольный синий не достигнет дна разрешающего геля.
  4. Замочите гели в не содержащем метанола буфере SDS-PAGE с 5 мМ ЭДТА на 10 минут дважды, чтобы удалить бивалентные катионы.
  5. Перенесите белки на мембрану PVDF при напряжении 90 В в течение 90 минут с помощью систем мокрого блоттинга.

4. Иммуноблоттинг и анализы

  1. Мембрану заточить 5% раствором обезжиренного молока или порошком белка бычьей сыворотки (разведенным в 1×растворе Трис-Борат-Натрия Твин-20, TBST) при комнатной температуре на 1 ч.
  2. Разведите первичное антитело против целевого белка в соответствующем соотношении и инкубируйте с мембраной при 4 °C в течение ночи.
  3. Промойте мембрану 3 раза с TBST, по 10 мин на стирку, при комнатной температуре с легким перемешиванием.
  4. Инкубировать мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Промойте мембрану 3 раза с TBST, по 10 мин на стирку, при комнатной температуре с легким перемешиванием.
  6. Инкубировать с субстратом с усиленной хемилюминесценцией в темноте в течение 1 минуты с последующей экспозицией.
  7. Сделайте снимки с помощью автоматизированной системы документирования геля и количественно определите целевые полосы (медленно мигрирующий фосфорилированный целевой белок и быстро мигрирующий нефосфорилированный целевой белок) для интенсивности оттенков серого с помощью программного обеспечения ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вестерн-блоттинг гелей Phos-Tag не может быть использован для присвоения молекулярной массы.
  8. Рассчитайте соотношение медленно мигрирующих фосфорилированных полос к быстро мигрирующим нефосфорилированным полосам для каждого образца и проанализируйте статистическую разницу в проценте фосфорилирования между группами.

5. Иммунопреципитация целевого белка

  1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих меченные FLAG-меткой (или альтернативные эпитопные метки, включая, помимо прочего, HA, GFP, GST или His) фосфомутанты дикого типа или сайт-специфические фосфомутанты целевого белка.
  2. Трансфектируйте клетки HEK293 экспрессирующими плазмидами с использованием Липофектамина 3000 в соответствии с протоколом производителя.
  3. Лизируйте клетки в буфере для лизиса тканевых белков объемом 1 мл, как описано на шаге 1, для извлечения надосадочной жидкости белка.
  4. Инкубируйте надосадочную жидкость с 20 мкл аффинного геля Anti-FLAG M2 в течение ночи при 4 °C с вращением.
  5. Центрифугируйте (1000 × г, 3 мин), соберите шарики агарозы и промойте 10 колонными объемами TBS для удаления неспецифически связанных белков.
  6. Растворите пептид FLAG в TBS до конечной концентрации 100 мкг/мл.
  7. Разбавьте связанный слитый белок FLAG из аффинного геля anti-FLAG M2 путем конкурентного элюирования пятью одноколоночными объемами раствора пептида FLAG (используйте 100 мкл раствора для 20 мкл агарозных шариков) в течение 5-10 мин с бережным перемешиванием.
  8. Центрифугируйте (1000 × г, 3 мин) и соберите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если киназа известна, перейдите к шагу 6; в противном случае сначала определите потенциальные киназы с помощью двухгибридного скрининга дрожжей или биоинформатического прогнозирования (например, с использованием PhosphositePlus или Group-based Prediction System), прежде чем переходить к шагу 6.

6. Анализ in vitro киназы для определения фосфорилированных аминокислот

  1. Приготовьте киназный буфер (30 мкл на реакцию): 40 мМ HEPES pH7.6, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 2,5 мМ β-глицерофосфат, 200 мкМ АТФ, 100 нг активной киназы, иммунопреципитированный гибридный белок FLAG.
  2. Выдерживать при температуре 30 °C в течение 30 минут в термомиксере с бережным перемешиванием.
  3. Остановите реакцию, добавив 10 мкл 4× буфера Lammli, и денатурируйте при 95 °C в течение 5 минут.
  4. Выполните традиционный электрофорез SDS-PAGE с использованием иммунопреципитированного гибридного белка FLAG, прореагировавшего с активной киназой или без нее.
  5. Зонд с антителом Anti-phospho-Thr и антителом Anti-phospho-Ser для идентификации фосфорилированных аминокислот. Зонд с антителом Anti-Flag в качестве контроля (см. Таблицу материалов).
  6. Завершите иммуноблоттинг и анализ, как описано на шаге 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предварительное фосфопротеомное профилирование человеческих образцов из контрольной группы и группы заболевания идентифицировало Nur77 как кандидата на дифференциально фосфорилированный белок. Для оценки эффективности Phos-tag SDS-PAGE в детектировании фосфорилирования белка Nur77 был проведен эксперимент Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE. После экстракции общего белка из образцов тканей 30 мкг белка загружали и отделяли с помощью электрофореза гелем Mn2+-Phos-tag с последующим переносом на мембрану PVDF. Имму...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основанный на Phos-tag подход к обнаружению изменений фосфорилирования белков-мишеней в клинических тканях дает значительные преимущества для исследований фосфорилирования белков. Фосфорилированные белки демонстрируют сниженную электрофоретическую подвижность из-за связывания с Phos-tag, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг статуса фосфорилирования белков-кандидатов без необходимости выработки фосфоспецифических антител. Это особенно ценно для начального крупномасштабн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82271698) и Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20231117).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% раствор SDSSangon BiotechB548118
10x Трис/Глицин/SDSBIO-RAD
4 раза;   Белковый буфер LaemmliBIO-RAD1610747
АкриламидSangon BiotechA601032
Персульфат аммонияSangon BiotechA100486
Anti-FLAG M2 аффинный гельMilliporeA2220
Усиленный хемилюминесцентный наборThermoFisher32106
FLAG антителоCST14793
ФЛАГ  ПептидMilliporeF3290
HRP-конъюгированное вторичное антителоBioworld TechnologyBS13278
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015
Mini Trans-Blot CellBIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellBIO-RAD1658005
антителоMst1CST3682
N, N'-метилен-бисакриламидSangon BiotechA600025
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин(TEMED)Sangon BiotechA610508
Nur77 антителоCST3960
Коктейль ингибиторов фосфатазы 2SigmaP5726Для ингибирования тирозинпротеинфосфатаз, кислоты и щелочные фосфатазы
Коктейль ингибиторов фосфатазы 3SigmaP0044Для ингибирования протеинфосфатазы 2А, щелочных фосфатаз, протеинфосфатаз 1 и 2А
Фосфо-сериновое антителоSigmaP5747
Фосфо-треониновое антителоSigmaP6623
Фос-тег АкриламидWako304-93526Для приготовления Фос-таг SDS PAGE гель
Pierce BCA Protein Assay KitThermo 23227
Коктейль ингибиторов протеазыSigmaS8830EDTA-Free, таблетка, для ингибирования серина, цистеина, аспарагиновой и металлопротеиназы мембраны
PVDF Рош3010040001
ТермомиксерEppendorf2231001127
Диспергатор для тканейIKAT 10 Для получения гомогената тканей
Буфер Tris-HCl (0,5M, pH 6,8)Sangon BiotechB546020
Буфер Tris-HCl (1,5M, pH 8,8)Sangon BiotechB546019
Вакуумный эксикаторThermoFisher5311-0250Для дегазации раствора геля
бета;-меркаптоэтанолSigmaM3148
1610732 &

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation and dephosphorylation. Cell Biosci. 6, 25(2016).
  3. Pang, K., et al. Role of protein phosphorylation in cell signaling, disease, and the intervention therapy. MedComm. 3 (4), e175(2022).
  4. Bollu, L. R., Mazumdar, A., Savage, M. I., Brown, P. H. Molecular Pathways: Targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res. 23 (9), 2136-2142 (2017).
  5. Martin, L., et al. Tau protein kinases: involvement in Alzheimer's disease. Ageing Res Rev. 12 (1), 289-309 (2013).
  6. Bhardwaj, S., et al. Integrating the analysis of human biopsies using post-translational modifications proteomics. Protein Sci. 33 (4), e4979(2024).
  7. Kristjansdottir, K., Wolfgeher, D., Lucius, N., Angulo, D. S., Kron, S. J. Phosphoprotein profiling by PA-GeLC-MS/MS. J Proteome Res. 7 (7), 2812-2824 (2008).
  8. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  9. Cai, X., et al. Mst1-mediated phosphorylation of Nur77 improves the endometrial receptivity in human and mice. EBioMedicine. 88, 104433(2023).
  10. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E. Improved Phos-tag SDS-PAGE under neutral pH conditions for advanced protein phosphorylation profiling. Proteomics. 11 (2), 319-323 (2011).
  11. Shih, H. H., et al. An ultra-specific avian antibody to phosphorylated tau protein reveals a unique mechanism for phosphoepitope recognition. J Biol Chem. 287 (53), 44425-44434 (2012).
  12. Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay. J Vis Exp. (135), e57674(2018).
  13. Mehla, J., Caufield, J. H., Uetz, P. Mapping protein-protein interactions using yeast two-hybrid assays. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (5), 442-452 (2015).
  14. Ayati, M., Yilmaz, S., Blasco Tavares Pereira Lopes, F., Chance, M., Koyuturk, M. Prediction of kinase-substrate associations using the functional landscape of kinases and phosphorylation sites. Pac Symp Biocompu. 28, 73-84 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи