Method Article

Манипуляции и анализ процессов, зависящих от клеточного цикла, у почковающихся дрожжей

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описаны два метода остановки клеточного цикла дрожжей и необязательного высвобождения, а также подробно описано использование флуоресцентной микроскопии для изучения процессов, зависящих от клеточного цикла , у S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эукариотические клетки следуют консервативному клеточному циклу, который регулирует различные процессы, включая поддержание ДНК и гомеостаз органелл. Изучение клеточных процессов в зависимости от клеточного цикла часто необходимо для правильной интерпретации экспериментальных результатов. Существуют химические и генетические методы для обеспечения синхронизации клеточного цикла в культивируемых клетках в широком спектре организмов, включая модели позвоночных, что позволяет изучать процессы, зависящие от клеточного цикла. Тем не менее, среди модельных организмов почковающиеся дрожжи остаются мощным инструментом для анализа клеточного цикла благодаря своим особенно надежным методам синхронизации, короткому времени генерации и генетической управляемости. Дрожжи разделяют основные механизмы клеточного цикла с другими эукариотами, что позволило сделать знаковые открытия в области регуляции клеточного цикла. В этом протоколе подробно описаны методы анализа клеточного цикла у дрожжей, уделяя особое внимание экспериментам по остановке-высвобождению G1 и митотическим экспериментам по остановке-высвобождению, включая конструирование штаммов, подготовку культур и микроскопию. Представлены методы ПЦР-мечения для получения подходящих штаммов для остановки клеточного цикла и флуоресцентной микроскопии. Арест G1 достигается с помощью фактора α пептидных феромонов, а короткие промывки приводят к синхронному высвобождению и прогрессированию клеточного цикла. Образцы отбираются в разные моменты времени после попадания в клеточный цикл и фиксируются для микроскопии. Второй метод останавливает дрожжевые клетки в митозе путем истощения регулятора клеточного цикла Cdc20 для достижения метафазной остановки популяции, а также необязательного высвобождения в анафазу. Образцы фиксируются и подготавливаются к визуализации до и после выпуска, а также визуализируются и анализируются. Анализ изображений фокусируется на каталогизации, динамической локализации и популяционных изменениях численности белков в клеточном цикле. Эти методы синхронизации подходят для различных манипуляций с клеточным циклом, и хотя их использование для визуализации неподвижных клеток освещено здесь, они могут быть адаптированы для многих других анализов, включая визуализацию живых клеток, а также биохимические и молекулярные анализы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Деление эукариотических клеток строго регулируется с помощью программы, называемой клеточным циклом. Высококонсервативные и динамичные процессы, происходящие в клеточном цикле, делают его интересным для изучения сам по себе, но также имеют широкие последствия, которые информируют об исследованиях других биологических процессов в клетках — например, многие органеллы претерпевают драматическое ремоделирование во время деления клеток, а обилие и локализация многих белков строго регулируются на протяжении 1,2,3. Несмотря на то, что в системах многоклеточных присутствуют некоторые дополнительные уровни сложности по сравнению с дрожжами, в том числе большее разнообразие регуляторных киназ и белков, а также дополнительный вход от внешней сигнализации у многоклеточных, деление клеток в целом очень консервативно у всех эукариот 4,5. Большая фундаментальная работа, устанавливающая ключевые сведения о прогрессии клеточного цикла и важнейших регуляторных этапах, была проделана на дрожжах, и они остаются чрезвычайно привлекательным организмом для изучения вопросов, связанных с клеточным циклом, по множеству причин 6,7. Главным из них является широкий спектр методов, доступных для манипулирования клеточным циклом, что позволяет осуществлять остановку на различных стадиях и синхронизацию клеток. Дополнительные преимущества включают короткий клеточный цикл дрожжей (~90-150 минут в зависимости от температуры и условий среды), простоту генетических манипуляций и большой спектр условных аллелей, которые позволяют изучать их в контексте дикого типа.

Прогрессирование через различные фазы клеточного цикла обусловлено активностью нескольких ключевых киназ, включая вездесущую циклин-зависимую киназу (Cdk), поло-подобную киназу и киназы Aurora. Контрольные точки клеточного цикла регулируют продвижение по клеточному циклу, гарантируя, что клетки не перейдут на следующую стадию деления, если не будут выполнены определенные условия 8,9. Эти контрольные точки и переходы, которые они регулируют, могут быть захвачены исследователями для достижения долгосрочной остановки или временного ареста и высвобождения для синхронизации популяции клеток (рис. 1). Например, контрольная точка приверженности клеточному циклу (точка рестрикции или начало у дрожжей) гарантирует, что клетка имеет достаточно питательных веществ для деления до начала репликации ДНК10. Эта контрольная точка может быть манипулирована в гаплоидных дрожжах для достижения остановки G1, используя программу спаривания дрожжей, которая взаимодействует с клеточным циклом. У пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) гаплоидные клетки имеют один из двух типов спаривания, MATa или MATα, что генетически определяется локусом типа спаривания. Дрожжи одного типа спаривания чувствительны к феромону спаривания другого типа спаривания и реагируют активацией сигнального каскада MAP-киназы, который в конечном итоге фосфорилирует и стабилизирует ингибитор Cdk Far1, который предотвращает вступление в клеточный цикл путем связывания с комплексом Cln1/2-Cdk и блокирования его активности 11,12,13. Клетки, реагирующие на брачные феромоны, могут быть визуально определены по наличию брачной проекции или shmoo (рис. 1). Таким образом, химически синтезированный α-фактор может быть добавлен в культуры клеток MATА для достижения остановки G1. Еще одним переходом клеточного цикла, на который исследователи могут нацелиться для синхронизации дрожжевых клеток, является переход от метафазы к анафазе. Во время митоза контрольная точка сборки веретена (SAC) контролирует прикрепление кинетохоров к микротрубочкам и ингибирует комплекс/циклосому, способствующую анафазе (APC/C), изолируя его активатор, Cdc20, при обнаружении неприкрепленных кинетохоров. APC/C представляет собой комплекс Е3-лигазы, который необходим для входа в анафазу. Когда SAC удовлетворен, Cdc20 связывается с APC/C, и APC/C убиквитинирует несколько белков, в первую очередь секурин и циклин B, которые нацелены на их деградацию, и способствует сегрегации хромосом и митотическому выходу14,15. Хотя Cdc20 сам по себе не является компонентом SAC, его ингибирование является мишенью активации SAC; следовательно, индуцируемое истощение Cdc20 может быть использовано для остановки культуры дрожжей в метафазе (рис. 1)16.

Этот протокол включает в себя два метода манипулирования дрожжевым клеточным циклом, а также пример применения каждого метода. В первом случае α-фактор используется для ареста клеток в G1, за которым следует этап промывки для освобождения клеток от ареста, что приводит к синхронному повторному входу в клеточный цикл. Синхронизированные клетки будут продолжаться на протяжении всего клеточного цикла, что позволит исследователям отслеживать и изучать клетки на каждой стадии клеточного цикла. В этом методе отслеживается динамическая локализация интересующего вас GFP-меченого белка Stu2, а также отслеживается его связь с митотическим веретеном. В этом методе также используется компонент меченого тела полюса шпинделя (SPB), Spc110-mCherry, который позволяет измерять длину митотического веретена и является отличным показателем прогрессии клеточного цикла17. Этот метод демонстрирует, как остановка и высвобождение клеточного цикла позволяют синхронизировать клеточные популяции, облегчая изучение белка или другого компонента, представляющего интерес на протяжении всего клеточного цикла.

Во втором способе митотический арест осуществляется путем истощения Cdc20 с использованием ауксин-индуцируемой системы дегрона (AID)18. В клетках, экспрессирующих TIR1 (F-box белок растительного происхождения), любой белок с меткой AID будет убиквитинироваться и разрушаться при добавлении ауксина. Здесь мы используем Cdc20, помеченный как AID, чтобы обеспечить индуцируемую деградацию Cdc20, тем самым вызывая остановку в метафазе. Затем эту клеточную популяцию контролируют на предмет рекрутирования меченого компонента SAC Bub1-GFP в кинетохоры, используя меченый белок кинетохора Mtw1-mCherry в качестве реперного маркера. Хотя Bub1 играет независимую от SAC роль в кинетохорах и локализуется в кинетохорах на ранних стадиях митоза, его персистирующая кинетохорная локализация в арестованных клетках сигнализирует о неправильном прикреплении кинетохор-микротрубочек19. Мы показали это, обрабатывая клетки ядом микротрубочек, нокодазолом, который разрушает прикрепление кинетохор-микротрубочек. Этот эксперимент показывает, как процессы, специфичные для определенной фазы клеточного цикла, могут быть изучены с помощью методов ареста с высокой степенью настройки. Кроме того, мы демонстрируем, что ауксин может быть вымыт из культур cdc20-AID, что позволяет высвобождаться в анафазу и вступать в новый клеточный цикл, хотя, по нашему опыту, эти культуры не высвобождаются так синхронно, как α-факторный арест-релиз. Эти два метода остановки-высвобождения эффективны и просты в реализации, но исследователям дрожжей доступно множество других методов для ареста клеток на разных стадиях клеточного цикла 20,21,22,23. Более подробную информацию об этих методах можно найти в Обсуждении.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструирование штаммов для анализа клеточного цикла и визуализации

  1. Разработайте праймеры для С-концевой маркировки интересующего гена с помощью плазмид Pringle (плазмиды pFA6a)24. Короче говоря, разрабатывайте праймеры F2 и R1, которые при использовании с плазмидами серии pFA6a производят продукт ПЦР, который может быть непосредственно преобразован в дрожжи для получения «меченой» версии интересующего гена. Используйте пары праймеров и плазмиды, содержащиеся в таблице 1 , для маркировки генов, представляющих интерес в этом протоколе. Стратегии дизайна плазмид и праймеров для С-концевого мечения генов дрожжей подробно описаны в работе Longtine et al.24.
    Примечание: Этот метод может быть использован для получения флуоресцентно меченных белков для визуализации или индуцированных ауксином белков Дегрона (AID) для облегчения остановки клеточного цикла и других экспериментов, обеспечиваемых деградацией целевого белка18. Например, для мечения CDC20 меткой AID (IAA7) праймер прямого мечения состоит из 25-40 оснований гена CDC20 непосредственно перед стоп-кодоном, исключая стоп-кодон (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), а также последовательность адаптеров Pringle Plasmid F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3'), присоединенная к 3'-концу для получения окончательной последовательности праймеров (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). Праймер обратного мечения CDC20 содержит обратный комплемент из 25-40 пар оснований сразу после кодона STOP (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTA 3') и последовательность адаптеров Pringle Plasmid R1 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') для получения окончательной последовательности праймеров (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Также важно отметить, что использование ПЦР-праймеров короче 40 пар оснований снизит эффективность интеграции в геном дрожжей.
  2. Развести праймеры в воде молекулярной биологии до 10 μМ.
  3. Проводят ПЦР с парой плазмид F2 и R1 и соответствующей маркировкой плазмиды стандартными методами, следуя программе термоамплификатора, приведенной в таблице 2, затем подтверждают размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
  4. Инокулируйте штамм дрожжей для превращения в 25 мл культуры дрожжевого экстракта пептон-адениновой декстрозы (YPAD) и выращивайте в течение ночи при 23 °C. Для конструирования дрожжей cdc20-AID (которые будут разрушать Cdc20 при обработке ауксином) трансформированный штамм может либо уже содержать OsTIR1 , экспрессируемый из эктопического локуса, либо OsTIR1 может быть скрещен в более позднем18.
  5. На следующее утро проверьте OD600 ночного посева. Если наружный диаметр культуры <2.0, переходите к шагу 1.6. Если OD > 2,0, разбавьте до ~0,2-0,4 и дайте 2-3 цикла роста.
  6. Собирайте клетки при OD600 = ~0,4-2,0, чтобы убедиться, что они находятся в логарифмической фазе роста. Соберите 5 OD клеток за одну трансформацию (например, 5 мл OD600 = 1,0). Если происходит более одного преобразования одного и того же штамма, клетки могут быть объединены на этом этапе. Соберите клетки путем центрифугирования при 3 000 x g в течение 5 минут при 23 °C.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу клетки 25 мл воды, после чего центрифугируйте при 3000 x g в течение 5 минут при 23 °C.
  8. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл 0,1 М ацетата лития (LiAc) и перенесите в пробирку (пробирки) объемом 1,6 мл. При выполнении более одного преобразования разделите ресуспендию объемом 1 мл на несколько пробирок (например, для 2 преобразований разделите 2x 500 μL; для 3 превращений разделите 3x 333 μL и т. д.).
  9. Центрифугируйте ячейки при давлении 1 000 x g в течение 2 мин при 23 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  10. Добавьте в клеточную гранулу (в указанном порядке): i) 240 μL PEG (50%), ii) 36 μL 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μг ДНК спермы лосося, предварительно отваренной в течение 5 мин, iv) 54 μL воды.
  11. Добавьте 10 μL продукта ПЦР (полученного на шаге 1.3) в клетки и сделайте вихрь на 1 минуту, следя за тем, чтобы все хорошо перемешалось.
  12. Инкубируйте клетки при 30 °C в течение 30 мин в роликовом барабане в теплом помещении или термошейке при 1000 об/мин.
  13. Тепловые шоковые ячейки при температуре 42 °C в течение 15 минут на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время теплового шока может отличаться в зависимости от фона штамма дрожжей. Этот протокол оптимизирован для фона штамма W303.
  14. Центрифугируйте ячейки при давлении 1 000 x g в течение 2 мин при 23 °C. Удалите надосадочную жидкость и аккуратно восстановите суспендию в 100 мкл воды.
  15. Для преобразований с использованием KanMX или другого выбора лекарств поместите клетки на YPAD и инкубируйте пластины при 23 °C, а затем на следующий день поставьте реплику планшета к планшету для лекарственного препарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставление дня роста на YPAD имеет решающее значение для обеспечения экспрессии генов лекарственной устойчивости в трансформированных клетках.
  16. Для преобразований с использованием ауксотрофных маркеров (URA, HIS и др.), пластинчатые клетки непосредственно на селективной среде.
  17. Инкубируйте планшеты при температуре 23 °C в течение 3 дней, чтобы дать возможность вырасти колониям дрожжевых трансформантов.
  18. Проверьте правильность маркировки гена с помощью геномной ПЦР или вестерн-блоттинга. Эти методы подробно описаны в работах Burnette25 и Chu et al26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения штаммов с несколькими мечеными аллелями повторное преобразование не рекомендуется без обратного скрещивания, поскольку преобразование может быть мутагенным процессом. Например, для получения штамма, содержащего Stu2-GFP и Spc110-mCherry, мы рекомендуем трансформировать штаммы по отдельности в Stu2-GFP и Spc110-mCherry, а затем объединить эти аллели в один гаплоидный штамм путем скрещивания дрожжей, спороношения, рассечения тетрады и генотипического анализа. Более подробную информацию о скрещивании дрожжей можно получить у Stansfield and Stark27 и Morin et al.28. Для выполнения α-факторного ареста-высвобождения используемый гаплоидный штамм должен быть MATa.

2. Культура дрожжей и синхронизация клеточного цикла: α-факторный арест-высвобождение

  1. Инокулируйте дрожжи в 25 мл культуры YPAD на ночь при температуре 23 °C, чтобы на следующее утро OD600 = 0,5-2,0.
    1. Если утром уровень клеток выше OD600 = 2,0, разбавьте его до OD600 = 0,2-0,4 и дайте им расти не менее 1 клеточного цикла (2-3 часа при 23 °C).
  2. Разбавьте клетки до OD600 = 0,5 и добавьте α-фактор до конечной концентрации 1 г/мл (запас 10 мг/мл в ДМСО). В идеале клетки должны иметь мутацию bar1 (например, bar1-1), что делает их более чувствительными к α-фактору. Клетки дикого типа BAR1 менее чувствительны к α-фактору и требуют концентрации α-фактора, которая по крайней мере на порядок выше для правильной остановки, что менее экономично.
  3. Через 2,5-3,5 ч после ареста проверьте степень ареста, подсчитав процент не отпочковавшихся клеток. Когда 90-95% клеток будут уничтожены (остановлены в G1), приступайте к выпуску. Сроки будут отличаться в зависимости от штамма дрожжей, питательной среды и температуры.
  4. Освободите клетки от α-факторного ареста путем вращения в центрифуге при 3000 x g в течение 3-5 мин при 23 °C, а затем выливания надосадочной жидкости.
  5. Промойте ячейки, повторно взвесив гранулу в 25 мл YPAD + 1% ДМСО.
  6. Повторите шаги 2,4-2,5 дважды, всего три промывки, меняя использованную трубку один раз после первой промывки.
  7. Добавьте в ячейки YPAD, чтобы довести итоговый объем до 25 мл и переложите ячейки в новую колбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование новой колбы имеет решающее значение для устранения следовых количеств оставшегося α-фактора, которые могут предотвратить высвобождение.
  8. Возьмите пробу по временной точке (0 минут) и зафиксируйте (см. инструкции по фиксации в шагах с 4.1 по 4.4).
  9. Продолжайте отбирать временные пробы каждые 15 минут, если рост происходит при температуре 23 °C. Это время будет меняться при других температурах в зависимости от того, насколько быстро растут клетки.
  10. Через 60 минут оцените синхронность высвобождения, проверив наличие однородных мелких почек (размер шишек < 25% размера материнской клетки) под световым микроскопом.
  11. Дополнительно) Через 60 минут после высвобождения снова добавьте α-фактор до конечной концентрации 1 г/мл, чтобы предотвратить переход в следующий клеточный цикл. Подтвердите синхронное высвобождение клеток, проверив однородную морфологию с маленькими почками перед добавлением.
  12. Продолжайте отбирать временные пробы до 180 минут или столько, сколько нужно. При 23 °C метафаза наступает через ~45-60 минут после высвобождения, анафаза - через ~60-90 минут после высвобождения, и большинство клеток будут находиться в новом G1 через 120 минут после высвобождения.

3. Синхронизация дрожжевого культивирования и клеточного цикла: остановка-высвобождение истощения Cdc20

  1. Инокулируйте культуру дрожжей в течение ночи при температуре 23 °C, чтобы на следующее утро она составила OD600 = 0,5-2,0.
    1. Если на следующее утро OD600 = 2,0 в клетках, разбавьте их до OD600 = 0,2-0,4 и дайте им расти в течение как минимум 1 клеточного цикла (2-3 ч при 23 °C).
  2. Разбавьте до OD600 = 0,5 и добавьте ауксин до конечной концентрации 500 мкМ из 1 М материала (500x) во все культуры. Для культур, получающих другие препараты (нокодазол), добавляют их одновременно с ауксином в соответствующей концентрации (например, ~10 мкг/мл нокодазола).
  3. Через 2 ч после ареста проверьте степень ареста, подсчитав процент клеток с крупными шишками (крупные почки определяются как наличие шишек > размере материнских клеток 25%). Когда 90-95% клеток задерживаются в митозе, приступайте либо к сбору образцов, либо к освобождению клеток от ареста, в зависимости от экспериментального применения. Если 90% клеток не остановлены, дайте культуре продолжить рост и проверяйте ее каждые 15-30 минут. Сроки будут отличаться в зависимости от штамма дрожжей, питательной среды и температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется допускать слишком длительные аресты (более 4 часов) при освобождении, так как длительные аресты могут снизить жизнеспособность клеток.
  4. Чтобы освободить Cdc20 от остановки истощения, соберите культуру центрифугированием при 3000 x g в течение 3-5 мин при 23 °C.
  5. Промойте ячейки, повторно суспендируя гранулу в 25 мл YPAD + 1% ДМСО, затем собирайте путем центрифугирования при 3 000 x g в течение 3-5 минут при 23 °C.
  6. Повторите шаги 3.4-3.5 всего 2 стирки.
  7. Добавьте в ячейки YPAD, чтобы довести итоговый объем до 25 мл и переложите ячейки в новую колбу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование новой колбы имеет решающее значение для удаления следовых количеств ауксина, которые могут предотвратить выброс.
  8. Возьмите временную точку 0 и зафиксируйте (см. инструкции по фиксации в шагах с 4.1 по 4.4).
  9. Продолжайте фиксировать временные точки каждые 10-15 минут в течение желаемой длины временного хода. При температуре 23 °C большинство клеток освободилось бы от ареста через 50-70 минут.
    Примечание: Клетки не высвобождаются так синхронно от этого ареста истощения Cdc20, как это происходит при α-факторном аресте. Тем не менее, это может быть полезно для изучения анафазы или событий митотического выхода. Кроме того, техническим ограничением этого остановки-высвобождения является то, что в более поздние моменты времени после высвобождения труднее дифференцировать метафазные клетки, которые еще не освободились, и клетки, которые высвободились ранее и достигли метафазы своего следующего клеточного цикла. При необходимости это можно преодолеть, проведя визуализацию живых клеток для отслеживания отдельных клеток по мере их высвобождения из ареста, или добавив α фактор в культуру (предполагая, что клетки являются MATa) для ареста клеток в G1 после митотического выхода.

4. Фиксация дрожжей

  1. Центрифугируйте 1 мл (или 0,5-1,5 ODs) культуры в течение 1 мин при максимальной скорости (~20 000 x g) при 23 °C.
  2. Отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 500 мкл фиксирующего раствора (3,7% формальдегида в 0,1 М фосфата калия (KPi) pH 6,4).
  3. Инкубировать клетки в фиксирующем растворе в течение 2-15 мин при
    23 °С. Для экспериментов с течением времени, как правило, рекомендуется фиксировать ячейки на 15 минут, чтобы выровнять время центрифугирования ячеек при отборе проб.
    Примечание: Время фиксации должно быть оптимизировано для конкретных флуорофоров и белков, представляющих интерес.
  4. Центрифугируйте ячейки в течение 1 мин при максимальной скорости при 23 °C, отбирайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 500 мкл 0,1 М KPi (pH 6,4). Клетки в KPi можно хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал флуоресценции фиксированной клетки может длиться до 2 недель, в зависимости от флуорофора, однако для количественной оценки флуоресцентных сигналов необходимо собирать изображения в течение 7 дней.

5. Подготовка слайдов к визуализации

  1. После подготовки к визуализации центрифугируйте ячейки в течение 1 минуты при максимальной скорости при 23 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 10-100 мкл раствора тритона/DAPI/сорбита (1,2 М сорбита, 1% тритон, 0,1 М KPi, pH 7,5, 2 мкг/мл DAPI).
  2. Пипетка ~0,8 мкл клеток непосредственно на чистую покровную крышку. С помощью наконечника пипетки аккуратно распределите каплю ячейки примерно на 1 см2 круга в центре покровного стекла.
  3. Поместите покровное стекло на предметное стекло для микроскопии. С помощью салфетки Kimwipe аккуратно надавите на предметное стекло, чтобы распределить образец.
  4. Заклейте края покровного стекла лаком для ногтей.
  5. По желанию храните в прохладном темном месте до 4-6 часов перед визуализацией, чтобы помочь клеткам осесть и предотвратить чрезмерную подвижность.

6. Визуализация

  1. Поднимите предметное стекло к микроскопу, оснащенному масляным объективом 60x/1.42 и красным, зеленым, синим, дальним красным лазером и набором фильтров. Также можно использовать объективы с более высоким увеличением (до 100x).
  2. Сфокусируйте микроскоп на дрожжевых клетках, прилипших к покровному стеколу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если дрожжевые клетки двигаются слишком сильно, предметные стекла можно оставить в прохладном темном месте на 20-60 минут, чтобы они осели.
  3. После того, как дрожжи окажутся в фокусе, настройте параметры экспозиции каждого канала так, чтобы соотношение сигнал/шум составляло не менее 3:1, гарантируя, что флуоресцентные точки не будут переэкспонированы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, в системе обработки изображений, которую мы используем с научной CMOS-камерой, используя объектив 60x 550 и иммерсионное масло с показателем преломления n = 1,516, устанавливая максимальный сигнал красного канала на 1000-2000 а.е., зеленого канала на 3000 а.е., синего канала на 3000 а.е. и канала DIC на 4000-5000 а.е. для получения высококачественных изображений.
  4. Отрегулируйте параметры сбора данных, чтобы взять 14–20 Z-стеков по 0,2 мкм и охватить в общей сложности 2–4 мкм.
  5. Для микроскопов, оснащенных модулями постобработки, выберите «Деконволюция » и «Быстрая проекция » для каждой стопки.
  6. Соберите Z-стеки ячеек, сделав достаточно изображений, чтобы захватить ~100-200 ячеек для каждого условия или временной точки.
  7. Обратитесь к Дополнительному файлу 1 для получения инструкций по программному обеспечению со скриншотами из программного обеспечения для обработки изображений.

7. Анализ изображений

  1. Откройте проецируемые изображения в ImageJ и отрегулируйте яркость и контрастность для просмотра различных каналов. Если микроскоп, используемый для получения изображений, не имеет модулей постобработки, на этом этапе выполните максимальную проекцию Z-стеков.
  2. Чтобы определить прогрессию клеточного цикла, подсчитайте 100 клеток в каждый момент времени и классифицируйте их как содержащие одно или два ядра. В качестве альтернативы можно рассчитать длину шпинделя или расстояние между телами полюсов шпинделя, чтобы определить состояние клеточного цикла. Расстояние между очагами Spc110 < 1,5 мкм соответствует метафазным ячейкам, а расстояние > 1,5 мкм соответствует анафазным ячейкам.
  3. Чтобы рассчитать интенсивность белка puncta (например, Stu2-GFP), используйте инструмент выделения от руки , чтобы провести вокруг границы интересующего сигнала. Добавьте этот сигнал в менеджер ROI (Region of Interest), нажав T или воспользовавшись Меню. В менеджере ROI выберите Измерить , чтобы рассчитать интенсивность каждой выбранной точки. Чтобы просмотреть изменения сигнала puncta с течением времени, постройте среднюю интенсивность с 95% доверительным интервалом на линейном графике для каждой временной точки.
  4. Чтобы рассчитать процент ячеек с Bub1-GFP puncta, убедитесь, что минимальная и максимальная яркость зеленого канала одинаковы для разных изображений. Клетки с Bub1-GFP пунктом, показывающим перекрытие с Mtw1-mCherry puncta, считаются Bub1, локализованными в кинетохоре; В противном случае ячейка считается отрицательной. Подсчитайте ~100 ячеек для каждого условия. Aravamudhan et al.29 содержат больше информации о локализации Bub1 в кинетохорах.
  5. Чтобы рассчитать процент мононуклеаров с большими почками, подсчитайте количество клеток с большой почкой и одним ядром (одним сигналом DAPI) в популяции и разделите на общее количество клеток.
  6. Обратитесь к Дополнительному файлу 1 для получения инструкций по программному обеспечению со скриншотами из программного обеспечения для обработки изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ изменений в локализации белков, зависящей от клеточного цикла, с помощью флуоресцентной микроскопии может быть легко выполнен с помощью описанных здесь методов. Наша группа уже давно интересуется динамической регуляцией и функцией митотического шпинделя. У дрожжей тела веретенообразных полюсов (обозначенные компонентом Spc110) функционируют как центры, организующие микротрубочки, из которых исходят нити микротрубочек, создавая структуру митотическо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование синхронизации клеточного цикла в почковающихся дрожжах позволяет изучать важные механизмы различных клеточных процессов. Использование G1-ареста-высвобождения с α-факторной обработкой позволяет синхронно продвигаться популяции клеток через стадии клеточного цикла и, как мы показали, может выявить паттерны динамической локализации клеточных регуляторов, таких как Stu236. Остановка клеточного цикла также может быть достигнута с помощью генетических сре...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр клеточной визуализации Университета штата Юта за поддержку микроскопа Delta Vision. Эта работа была частично поддержана грантами NIH F31CA2717405 (M.G.S.) и T32GM141848 (M.G.S. и T.C.S.), 5 For the Fight (M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (M.P.M.) и грантом NIH R35GM142749 (M.P.M.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-факторЦентр синтеза ядер Университета ЮтыПоследовательность: WHWLQLKPGQPMY
Трубки Эппендорфа объёмом 1,5 млAxygenMCT-175-C
10 мМ смесь dNTPThermo ScientificR0193
Конические трубки объемом 50 млGreiner Bio-One227 261
5x Phusion HF реакционный буферNew England BioLabsB0518S
Уксусная кислота, ледникФишер КемикалBP2401C-212
Соль аденин-гемисульфатСигма-ОлдричA9126-100G
Агар, гранулированныйApex Chemicals and Reagents20-275
агарозаApex Bioresearch Products20-102GP
Паровой стерилизатор Autoclave Amsco CenturyСтерисСВ-1262
Автоклавированная DI-вода
АуксинСигма-ОлдричCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Лазерная жидкость CargilleЛаборатории Каржиль20130
D-СорбитолСигма-ОлдричS1876-500G
DAPI (40,6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Молекулярные зондыCat#D1306
Дезоксирибонуклеиновая кислота, соль натрия из яичек лососяСигма-ОлдричD1626
ГлюкозаФишер КемикалD16-10
Тетраацетат динатрия этилендиаминФишер КемикалS811-10
ДМСОThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 против 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Вихревой миксер с фиксированной скоростьюVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Флуоресцентный микроскоп DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEСериал #: NV01063. Больше не поддерживается
ФормальдегидФишер КемикалCat#F79-500
Гелевое оборудованиеThermo ScientificOwl EasyCast B1
Смесь лестницы ДНК GeneRulerФерментыSM0333
стеклянные бусиныFisher Scientific11312A
Стеклянные слайдыVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerНью-БрансуикNB-2300
КимвайпсKimtech06-666
Лабораторная центрифуга для трубок 1,5 млЭппендорф2525
Лабораторная центрифуга для трубок объёмом 50 млЭппендорф5804
Литий-ацетат-дигидратСигма-ОлдричL4158-250G
Главный циклер-нексус X2Эппендорфhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Микропипетки p2, p20, p200 и p1000 и соответствующие наконечникиРейнинL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Стекло крышки микроскопаFisher Scientific12541014
НокодазолCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Лот#B35705
Оранжевый GСигма-ОлдричO7252
КОЛЫШЕКHampton ResearchHR2-591
Пептон гранулированный Биореагенты FisherBP9725-5
Фузионная HF ДНК-полимеразаNew England BioLabsM0530L
Pipet-XРейнинPX-100R
Калийфосфат, дибазовыйThermo Scientific424195000
Фосфат калия, моноосновнойThermo Scientific424200025
Источник питанияБио-Рад23786
Начните приобретать Ultra 1.2.2softWoRx CytivaПолучить с помощью DV Ultra
База ТрисБиореагенты FisherBP152-10
Triton X-100Сигма-Олдрич9002-93-1
Ротатор трубкиVWR10136-084
Водяная баняVWRWBE10A11B
Вода, ультра чистаяApex Bioresearch Products18-194
Экстракт дрожжей гранулированныйБиореагенты FisherBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nature. 561 (7723), 411-415 (2018).
  3. Litsios, A., et al. Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle. Cell. 187 (6), 1490-1507.e21 (2024).
  4. Satyanarayana, A., Kaldis, P. Mammalian cell-cycle regulation: Several Cdks, numerous cyclins and diverse compensatory mechanisms. Oncogene. 28 (33), 2925-2939 (2009).
  5. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling growth factor signaling and cell cycle progression in individual fibroblasts. J Biol Chem. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  6. Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast, I. detection of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 66 (2), 352-359 (1970).
  7. Forsburg, S. L., Nurse, P. Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 7 (1), 227-256 (1991).
  8. Morgan, D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol. 13 (1), 261-291 (1997).
  9. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  10. Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J. R., Reid, B. J. Genetic control of the cell division cycle in yeast: A model to account for the order of cell cycle events is deduced from the phenotypes of yeast mutants. Science. 183 (4120), 46-51 (1974).
  11. Chan, R. K., Otte, C. A. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and α factor pheromones. Mol Cell Biol. 2 (1), 11-20 (1982).
  12. Madhani, H. D. From a to alpha: Yeast as a model for cellular differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2007).
  13. Skotheim, J. M., Di Talia, S., Siggia, E. D., Cross, F. R. Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent cell cycle entry. Nature. 454 (7202), 291-296 (2008).
  14. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  15. Stern, B. M., Murray, A. W. Lack of tension at kinetochores activates the spindle checkpoint in budding yeast. Curr Biol. 11 (18), 1462-1467 (2001).
  16. Lim, H. H., Goh, P. Y., Surana, U. Cdc20 is essential for the cyclosome-mediated proteolysis of both Pds1 and Clb2 during M phase in budding yeast. Curr Biol. 8 (4), 231-237 (1998).
  17. Chan, L. Y., Amon, A. Spindle position is coordinated with cell-cycle progression through establishment of mitotic exit-activating and -inhibitory zones. Mol Cell. 39 (3), 444-454 (2010).
  18. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  19. Gillett, E. S., Espelin, C. W., Sorger, P. K. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J Cell Biol. 164 (4), 535-546 (2004).
  20. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  21. Yeong, F. M., Lim, H. H., Padmashree, C. G., Surana, U. Exit from mitosis in budding yeast. Mol Cell. 5 (3), 501-511 (2000).
  22. Uhlmann, F., Wernic, D., Poupart, M. A., Koonin, E. V., Nasmyth, K. Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103 (3), 375-386 (2000).
  23. Wäsch, R., Cross, F. R. APC-dependent proteolysis of the mitotic cyclin Clb2 is essential for mitotic exit. Nature. 418 (6897), 556-562 (2002).
  24. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  25. Burnette, W. N. "Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).
  26. Chu, J. H., Yeast, A. M. Yeast colony PCR: it doesn't get any easier than this. , https://www.protocols.io/view/yeast-colony-pcr-it-doesn-t-get-any-easier-than-th-gzwbx7e (2017).
  27. Stansfield, I., Stark, M. J. Yeast genetics and strain construction. Methods Microbiol. 36, 23-43 (2007).
  28. Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci. J Vis Exp. (27), e1146(2009).
  29. Aravamudhan, P., Chen, R., Roy, B., Sim, J., Joglekar, A. P. Dual mechanisms regulate the recruitment of spindle assembly checkpoint proteins to the budding yeast kinetochore. Mol Biol Cell. 27 (22), 3405-3417 (2016).
  30. Kilmartin, J. V. Lessons from yeast: the spindle pole body and the centrosome. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1650), 20130456(2014).
  31. Brouhard, G. J., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  32. Zahm, J. A., Stewart, M. G., Carrier, J. S., Harrison, S. C., Miller, M. P. Structural basis of Stu2 recruitment to yeast kinetochores. Elife. 10, e65389(2021).
  33. Wang, P. J., Huffaker, T. C. Stu2p: A microtubule-binding protein that is an essential component of the yeast spindle pole body. J Cell Biol. 139 (5), 1271-1280 (1997).
  34. Severin, F., Habermann, B., Huffaker, T., Hyman, T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase. J Cell Biol. 153 (2), 435-442 (2001).
  35. van Breugel, M., Drechsel, D., Hyman, A. Stu2p, the budding yeast member of the conserved Dis1/XMAP215 family of microtubule-associated proteins is a plus end-binding microtubule destabilizer. J Cell Biol. 161 (2), 359-369 (2003).
  36. Stewart, M. G., Carrier, J. S., Zahm, J. A., Harrison, S. C., Miller, M. P. A coordinated kinase and phosphatase network regulates Stu2 recruitment to yeast kinetochores. J Cell Biol. 224 (8), e220410196(2025).
  37. London, N., Ceto, S., Ranish, J. A., Biggins, S. Phosphoregulation of Spc105 by Mps1 and PP1 regulates Bub1 localization to kinetochores. Curr Biol. 22 (10), 900-906 (2012).
  38. Lampson, M. A., Grishchuk, E. L. Mechanisms to avoid and correct erroneous kinetochore-microtubule attachments. Biology (Basel). 6 (1), 1-15 (2017).
  39. Samson, F., Donoso, J. A., Heller-Bettinger, I., Watson, D., Himes, R. H. Nocodazole action on tubulin assembly, axonal ultrastructure and fast axoplasmic transport. J Pharmacol Exp Ther. 208 (3), 411-417 (1979).
  40. Banerjee, A., Deshaies, R. J., Chau, V. Characterization of a dominant negative mutant of the cell cycle ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34. J Biol Chem. 270 (44), 26209-26215 (1995).
  41. Jones, M. H., et al. Chemical genetics reveals a role for Mps1 kinase in kinetochore attachment during mitosis. Curr Biol. 15 (2), 160-165 (2005).
  42. Valenti, R., et al. A proteome-wide yeast degron collection for the dynamic study of protein function. J Cell Biol. 224 (2), e202409050(2025).
  43. Sepers, J. J., et al. The mIAA7 degron improves auxin-mediated degradation in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 12 (10), jkac222(2022).
  44. Yesbolatova, A., et al. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat Commun. 11 (1), 5701(2020).
  45. Feng, W., et al. Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication. Nat Cell Biol. 8 (2), 148-155 (2006).
  46. Osborn, A. J., Elledge, S. J., Zou, L. Checking on the fork: the DNA-replication stress-response pathway. Trends Cell Biol. 12 (11), 509-516 (2002).
  47. An, Z., et al. Autophagy is required for G1/G0 quiescence in response to nitrogen starvation in Saccharomyces cerevisiae. Autophagy. 10 (10), 1702-1711 (2014).
  48. Smets, B., et al. Life in the midst of scarcity: adaptations to nutrient availability in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 56 (1), 1-32 (2010).
  49. Haase, S. B., Lew, D. J. Flow cytometric analysis of DNA content in budding yeast. Methods Enzymol. 283, 322-332 (1997).
  50. Touati, S. A., Kataria, M., Jones, A. W., Snijders, A. P., Uhlmann, F. Phosphoproteome dynamics during mitotic exit in budding yeast. EMBO J. 37 (10), e98745(2018).
  51. Baro, B., et al. SILAC-based phosphoproteomics reveals new PP2A-Cdc55-regulated processes in budding yeast. Gigascience. 7 (5), giy053(2018).
  52. Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast. J Vis Exp. (122), e55610(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles