Method Article

Манипуляции и анализ процессов, зависящих от клеточного цикла, у почковающихся дрожжей

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описаны два метода остановки клеточного цикла дрожжей и необязательного высвобождения, а также подробно описано использование флуоресцентной микроскопии для изучения процессов, зависящих от клеточного цикла , у S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эукариотические клетки следуют консервативному клеточному циклу, который регулирует различные процессы, включая поддержание ДНК и гомеостаз органелл. Изучение клеточных процессов в зависимости от клеточного цикла часто необходимо для правильной интерпретации экспериментальных результатов. Существуют химические и генетические методы для обеспечения синхронизации клеточного цикла в культивируемых клетках в широком спектре организмов, включая модели позвоночных, что позволяет изучать процессы, зависящие от клеточного цикла. Тем не менее, среди модельных организмов почковающиеся дрожжи остаются мощным инструментом для анализа клеточного цикла благодаря своим особенно надежным методам синхронизации, короткому времени генерации и генетической управляемости. Дрожжи разделяют основные механизмы клеточного цикла с другими эукариотами, что позволило сделать знаковые открытия в области регуляции клеточного цикла. В этом протоколе подробно описаны методы анализа клеточного цикла у дрожжей, уделяя особое внимание экспериментам по остановке-высвобождению G1 и митотическим экспериментам по остановке-высвобождению, включая конструирование штаммов, подготовку культур и микроскопию. Представлены методы ПЦР-мечения для получения подходящих штаммов для остановки клеточного цикла и флуоресцентной микроскопии. Арест G1 достигается с помощью фактора α пептидных феромонов, а короткие промывки приводят к синхронному высвобождению и прогрессированию клеточного цикла. Образцы отбираются в разные моменты времени после попадания в клеточный цикл и фиксируются для микроскопии. Второй метод останавливает дрожжевые клетки в митозе путем истощения регулятора клеточного цикла Cdc20 для достижения метафазной остановки популяции, а также необязательного высвобождения в анафазу. Образцы фиксируются и подготавливаются к визуализации до и после выпуска, а также визуализируются и анализируются. Анализ изображений фокусируется на каталогизации, динамической локализации и популяционных изменениях численности белков в клеточном цикле. Эти методы синхронизации подходят для различных манипуляций с клеточным циклом, и хотя их использование для визуализации неподвижных клеток освещено здесь, они могут быть адаптированы для многих других анализов, включая визуализацию живых клеток, а также биохимические и молекулярные анализы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Деление эукариотических клеток строго регулируется с помощью программы, называемой клеточным циклом. Высококонсервативные и динамичные процессы, происходящие в клеточном цикле, делают его интересным для изучения сам по себе, но также имеют широкие последствия, которые информируют об исследованиях других биологических процессов в клетках — например, многие органеллы претерпевают драматическое ремоделирование во время деления клеток, а обилие и локализация многих белков строго регулируются на протяжении 1,2,3. Несмотря на то, что в системах мно....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструирование штаммов для анализа клеточного цикла и визуализации

  1. Разработайте праймеры для С-концевой маркировки интересующего гена с помощью плазмид Pringle (плазмиды pFA6a)24. Короче говоря, разрабатывайте праймеры F2 и R1, которые при использовании с плазмидами серии pFA6a производят продукт ПЦР, который может быть непосредственно преобразован в дрожжи для получения «меченой» версии интересующего гена. Используйте пары праймеров и плазмиды, содержащиеся в таблице 1 , для маркировки генов, представляющих интерес в этом протоколе. Стратегии дизайна плазмид и праймеров для С-к....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ изменений в локализации белков, зависящей от клеточного цикла, с помощью флуоресцентной микроскопии может быть легко выполнен с помощью описанных здесь методов. Наша группа уже давно интересуется динамической регуляцией и функцией митотического шпинделя. У дрожжей тела веретенообразных полюсов (обозначенные компонентом Spc110) функционируют как центры, организующие микротрубочки, из которых исходят нити микротрубочек, создавая структуру митотическо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование синхронизации клеточного цикла в почковающихся дрожжах позволяет изучать важные механизмы различных клеточных процессов. Использование G1-ареста-высвобождения с α-факторной обработкой позволяет синхронно продвигаться популяции клеток через стадии клеточного цикла и, как мы показали, может выявить паттерны динамической локализации клеточных регуляторов, таких как Stu236. Остановка клеточного цикла также может быть достигнута с помощью генетических сре.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр клеточной визуализации Университета штата Юта за поддержку микроскопа Delta Vision. Эта работа была частично поддержана грантами NIH F31CA2717405 (M.G.S.) и T32GM141848 (M.G.S. и T.C.S.), 5 For the Fight (M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (M.P.M.) и грантом NIH R35GM142749 (M.P.M.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-факторЦентр синтеза ядер Университета ЮтыПоследовательность: WHWLQLKPGQPMY
Трубки Эппендорфа объёмом 1,5 млAxygenMCT-175-C
10 мМ смесь dNTPThermo ScientificR0193
Конические трубки объемом 50 млGreiner Bio-One227 261
5x Phusion HF реакционный буферNew England BioLabsB0518S
Уксусная кислота, ледникФишер КемикалBP2401C-212
Соль аденин-гемисульфатСигма-ОлдричA9126-100G
Агар, гранулированныйApex Chemicals and Reagents20-275
агарозаApex Bioresearch Products20-102GP
Паровой стерилизатор Autoclave Amsco CenturyСтерисСВ-1262
Автоклавированная DI-вода
АуксинСигма-ОлдричCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Лазерная жидкость CargilleЛаборатории Каржиль20130
D-СорбитолСигма-ОлдричS1876-500G
DAPI (40,6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Молекулярные зондыCat#D1306
Дезоксирибонуклеиновая кислота, соль натрия из яичек лососяСигма-ОлдричD1626
ГлюкозаФишер КемикалD16-10
Тетраацетат динатрия этилендиаминФишер КемикалS811-10
ДМСОThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 против 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Вихревой миксер с фиксированной скоростьюVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Флуоресцентный микроскоп DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEСериал #: NV01063. Больше не поддерживается
ФормальдегидФишер КемикалCat#F79-500
Гелевое оборудованиеThermo ScientificOwl EasyCast B1
Смесь лестницы ДНК GeneRulerФерментыSM0333
стеклянные бусиныFisher Scientific11312A
Стеклянные слайдыVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerНью-БрансуикNB-2300
КимвайпсKimtech06-666
Лабораторная центрифуга для трубок 1,5 млЭппендорф2525
Лабораторная центрифуга для трубок объёмом 50 млЭппендорф5804
Литий-ацетат-дигидратСигма-ОлдричL4158-250G
Главный циклер-нексус X2Эппендорфhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Микропипетки p2, p20, p200 и p1000 и соответствующие наконечникиРейнинL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Стекло крышки микроскопаFisher Scientific12541014
НокодазолCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Лот#B35705
Оранжевый GСигма-ОлдричO7252
КОЛЫШЕКHampton ResearchHR2-591
Пептон гранулированный Биореагенты FisherBP9725-5
Фузионная HF ДНК-полимеразаNew England BioLabsM0530L
Pipet-XРейнинPX-100R
Калийфосфат, дибазовыйThermo Scientific424195000
Фосфат калия, моноосновнойThermo Scientific424200025
Источник питанияБио-Рад23786
Начните приобретать Ultra 1.2.2softWoRx CytivaПолучить с помощью DV Ultra
База ТрисБиореагенты FisherBP152-10
Triton X-100Сигма-Олдрич9002-93-1
Ротатор трубкиVWR10136-084
Водяная баняVWRWBE10A11B
Вода, ультра чистаяApex Bioresearch Products18-194
Экстракт дрожжей гранулированныйБиореагенты FisherBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles