Методическая статья

Выявление электромеханического управления тканевым гомеостазом с помощью двухслойного микрофлюидного устройства

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы представляем протокол создания уникального двухслойного микрофлюидного устройства для изучения электромеханической регуляции гомеостаза эпителиальной ткани. Устройство подает статические физиологические электрические токи, перпендикулярные плоскости ткани, воздействуя на межклеточную адгезию, пролиферацию и экструзию. Визуализация живых клеток и измерение механических нагрузок позволяют выявить механизмы этих процессов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На поведение и судьбу клетки влияют электрические токи или поля, которые являются эндогенными или посторонними. Статические электрические сигналы могут быть применены в специализированных микрофлюидных устройствах для имитации электрической среды в медленных физиологических процессах, таких как развитие, заживление ран и гомеостаз. Важным классом исследований клеточного электричества является контроль миграции клеток статическими гальваническими токами в плоскости в простых микрофлюидных каналах, имитирующих раневые токи, с плотностями тока ~0,1-1000 А/м2. Однако из-за несовместимой геометрии эти устройства не подходят для изучения электрических эффектов в тканевом гомеостазе, где клетки принимают апикобазальную полярность и трансэпителиальную разность потенциалов (TEPD). В этой статье мы подробно расскажем об уникальном микрофлюидном устройстве, которое подает физиологические ионные потоки перпендикулярно плоскости сливающихся слоев эпителиальных клеток для возмущения TEPD и исследования электрической регуляции устойчивых состояний тканей. Установка изготовлена из двухслойного полимера, отверждаемого ультрафиолетом, в который встроена мягкая полиакриламидная гелевая подложка, покрытая белком с внеклеточной матрицей по выбору. Это микрофлюидное устройство обеспечивает правильную геометрию и проницаемую подложку для индуцирования относительно равномерного ионного тока через слои клеток сантиметрического масштаба. Установка совместима с конфокальной визуализацией живых клеток и микроскопией силы тяги для определения механических напряжений, индуцированных трансэпителиальными токами. Поразительно, что пролиферация, экструзия и миграция клеток в совокупности влияют в сливающемся эпителии в зависимости от направления ионного тока, вызывая новое состояние ткани, характеризующееся различной силой межклеточного взаимодействия, клеточными событиями (смерть и пролиферация) и тканевыми структурами. Электрически контролируемое поведение клеток можно понимать как электрически индуцированное механическое напряжение и реакцию клетки. Это новое микрофлюидное устройство и протокол предоставляют инструменты и документацию, необходимые механобиологическим и биоинженерным сообществам для изучения электрических эффектов в тканевой гомеостазе и разработки новых приложений тканевой инженерии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биоэлектрические сигналы являются важными биофизическими факторами, влияющими на поведение клеток. Самый известный пример — потенциал действия в нейронах и клетках сердца, которые передают электрические сигналы на большие расстояния (до метра) и на высоких частотах (до сотен герц)1. Электрические импульсы, применяемые с помощью электродов, могут быть использованы для стимуляции возбуждения потенциала действия и полезны в исследованиях и медицинских приложениях2. Эндогенные биоэлектрические сигналы в медленных физиологических процессах, таких как развитие, заживление ран и гомеостаз 3,4,5,6,7,8 также измерялись 9,10 в течение периодов от нескольких часов до нескольких дней. Важным примером являются сливающиеся эпителиальные слои, которые активно поддерживают трансэпителиальную разность потенциалов (TEPD) в диапазоне от нескольких до десятков милливольт 4,11. Порез или рана в этих сливающихся слоях генерирует ток короткого замыкания, приводимый в действие электрической активностью ткани 12,13. Сообщалось о намотанных токах до десятков мкА/см2 и электрических полях до сотен мВ/мм с помощью различных методов. Исследования показывают, что эти электрические сигналы создают направленный сигнал для миграции клеток к местам равы или инфекции, что важно для процесса заживления 3,6,14. В целом, важны как статические (или медленно изменяющиеся), так и быстро изменяющиеся электрические сигналы, которые вызывают различные реакции клеток или тканей.

В области медленно изменяющихся сигналов одним из важных явлений является процесс миграции, приводимый в движение электричеством, называемый «гальванотаксисом». Управляемые гальванические токи в плоскости могут быть применены в микрофлюидных устройствах с простыми каналами для имитации токов раны, в то время как миграция клеток исследуется в зависимости от плотности тока15,16. Было обнаружено, что электрические поля 0,1-1000 В/м (соответствующая плотность тока 0,1-1000 А/м2) управляют миграцией клеток во многих типах клеток в этой настройке in vitro 17, в то время как сигнальные пути, канонические для хемотаксиса (миграция клеток, управляемая химическими градиентами), такие как PI3K, были вовлечены в гальванотаксис 7,18. «Голые» микрофлюидные устройства для исследования гальванотаксиса могут быть изготовлены с использованием стандартных методов мягкой литографии и микропроизводства19. Эти устройства обычно содержат одноканальную подложку из полидиметил-силоксана (PDMS), прикрепленную к предметному стеклу (размер поперечного сечения канала: сотни микрометров, длина: сантиметры). Электроды, используемые для подачи статического тока, устанавливаются вдали от области ячейки и соединяются с солевыми мостиками или без них. Соединение солевого моста может быть выполнено путем пробития отверстий в подложке PDMS, микрофлюидных соединителей и трубок, заполненных агаром. Простое предметное стекло (обычно толщиной 170 мкм) под каналом также поддерживает визуализацию живых клеток с высоким разрешением во время экспериментов с гальванотаксисом, что является важной особенностью для изучения процесса.

Роль эндогенных электрических сигналов в поддержании тканевого гомеостаза изучена гораздо меньше, чем в заживлении ран. Одной из важных причин является отсутствие соответствующих инструментов для изучения этих эффектов в неповрежденных тканях. Микрофлюидное устройство для гальванотаксиса не подходит для этой цели из-за своей геометрии, которая поддерживает только плоские электрические токи. В контексте эпителиального гомеостаза необходимо новое устройство для контроля и возмущения TEPD или внеплоскостных потоков через сливающийся эпителиальный слой. Для достижения цели приложения относительно равномерной плотности ионного тока на монослое мы разработали и изготовили микрофлюидное устройство с инновациями в геометрии устройства, использовании материалови биомеханических возможностях измерения in situ. Последняя способность важна, поскольку электрические эффекты могут влиять на поведение клеток через связь с биомеханическими и механобиологическими путями, которые могут быть изучены с помощью этой функции.

Это новое устройство обладает множеством инновационных функций. Он спроектирован с двумя слоями вместо одноканального, как в гальванотаксисных устройствах (новшество в геометрии), при этом соединение с электродными камерами аналогично тому, что используется в последних. Первый микрофлюидный слой имеет каналы для направления ионных токов к области ткани (или от нее), в то время как второй слой имеет отверстие, которое направляет этот ток перпендикулярно эпителию, расположенному поверх этого второго микрофлюидного слоя (рис. 1A, B). Методы микропроизводства используются для получения достаточно тонких слоев, чтобы конфокальная визуализация с высоким разрешением была возможна, несмотря на укладку микрофлюидных слоев, которая увеличивает толщину образца. Что касается других важных инноваций, то в середину устройства встроен синтетический гидрогель на основе полиакриламида (PA), который играет решающую роль (рис. 1A, B). Физико-химические свойства этого геля, такие как доступный химический состав для покрытия белков внеклеточного матрикса, проницаемость для ионов, а также известная эластичность, соответственно важны для прикрепления и роста клеток, приложения внеплоских токов и измерения механическогонапряжения20 во время электрической стимуляции. Барьерные структуры встраиваются в слой 1 тканевой области для удержания раствора предшественника геля PA, как это было сделано в предыдущих микрофлюидных устройствах21 (рисунок 1A, B). И последнее, но не менее важное: поскольку полимеризация PA-геля ингибируется кислородом на поверхностях PDMS, проницаемых для газообразного кислорода, для изготовления устройства используется другой материал22 , который может обеспечить полимеризацию и плотное сцепление PA-геля. Все инновационные функции имеют решающее значение для работы нового устройства.

В целом, углубленное изучение статических или медленно изменяющихся биоэлектрических сигналов в гомеостазе интактных тканей стало возможным благодаря этому новому устройству, протокол для которого будет подробно изложен ниже. Протокол и результаты, на которые здесь ссылаются, сосредоточены на эпителиальной клеточной линии Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), включая клеточные события (пролиферацию, гибель, экструзию и миграцию) и структурные изменения тканей, индуцированные электрическим током. Эти исследования также поучительны для исследователей, которые заинтересованы в применении этого метода для изучения электрической регуляции эпителиального транспорта и индукции клеточных событий и изменений в судьбе клеток в клеточных слоях и более сложных системах, таких как первичные клетки и двумерные органоиды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предусматривает шаги по созданию установки, которая применяет статические электрические токи и возмущает TEPD сливающегося эпителия, а также для изучения его эффектов с помощью методов визуализации живых клеток и механобиологии (Рисунок 1). Установка состоит из устройств, изготовленных из микрофлюидных чипов, прикрепленных к картриджам, вставок и держателей для размещения нескольких устройств для мультиплексированных экспериментов на микроскопе, пары электродных камер, подключенных к источнику измерителя и устройствам, и крышки камеры живых клеток для поддержания надлежащих условий для живых клеток (рис. 1C). Принципы проектирования и чертежи картриджа и других важных компонентов системы CAD можно найти в Дополнительном файле 1. Этапы включают в себя: 1) мягкую литографию PDMS; 2) Изготовление микросхем и сборка устройств; 3) Завершение настройки; и 4) Монослойный рост и эксперименты с живыми клетками. Подробная информация о реагентах и материалах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов.

1. Мягкая литография PDMS

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описано производство эластомеров PDMS из пластин SU-8 (рис. 2A, B) для формования УФ-отверждаемых слоев клея микрофлюидного чипа.

  1. Мягкая литография PDMS
    1. Изготовьте отдельную пластину на основе SU-8 для каждого микрофлюидного слоя, слоя 1 и 2, используя методы фотолитографии (Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление пластин может занять месяц, если запрос отправлен на предприятие микропроизводства / чистой комнаты. Для изготовления пластин также может быть использован метод травления кремния.
    2. Силанизация кремниевой пластины для извлечения PDMSиз формы 19.
      1. Очистите пластину с помощью пневматического пистолета с азотом под давлением. Активируйте поверхность пластины путем применения короткого процесса кислородной плазмы (30 с, 30 Вт в потоке газа 20 sccm O2 при давлении реактора 1-3 мбар)23.
      2. Пипетка 200 мкл тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил-1-трихлорсилана в чистом пластиковом колпачке (диаметр 60 мм, высота 15 мм). Наденьте колпачок рядом с пластиной в вакуумный эксикатор (только для силанизации). Включите вакуумный насос и подождите 1-2 часа, пока испарившийся силан осаждается в виде монослоя на силиконовой пластине.
        ВНИМАНИЕ: Силан вызывает коррозию и токсичен. Надевайте перчатки и защитные очки и работайте в вытяжном шкафу, чтобы обеспечить безопасную работу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Только что силанизированная пластина может быть использована для изготовления 10-20 штук пресс-форм PDMS. Время вакуума зависит от состояния вакуумного насоса. Чрезмерная силанизация приводит к неравномерной толщине и появлению мутного вида, чего следует избегать. Храните в камерах с контролируемой влажностью, когда они не используются. Структуры PDMS, изготовленные из новых пластин, могут быть проверены с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).
    3. В чашке Петри (диаметр 150 мм, высота 25 мм) тщательно перемешайте достаточное количество базовой смолы PDMS и сшивающего агента (w:w = 10:1 и 70-80 г) в течение нескольких минут. Следите за тем, чтобы в смеси равномерно образовывались мелкие пузырьки, что подтверждает хорошую смесь. Перелейте смесь в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 550 x g в течение 3 минут, чтобы тщательно удалить пузырьки воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость PDMS липкая и ее трудно чистить; Будьте осторожны при заливке. Очистите изопропанолом, если поверхности скамеек загрязнены пролитой смесью PDMS.
    4. Аккуратно вылейте смесь PDMS на пластину в пластиковую или стеклянную посуду (диаметр 150 мм, высота 25 мм) с плоским дном, затем надавите на пластину, чтобы продуть PDMS со дна пластины. Дегазируйте смесь с помощью вакуумного насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить жидкий PDMS со дна пластины; Толстый слой PDMS на дне затрудняет извлечение пластины из пластиковой формы, увеличивая вероятность ее разрушения. В качестве альтернативы можно разрезать PDMS по краю пластины и хранить пластину в чашке Петри. Убедитесь, что толщина PDMS составляет примерно 1,5 мм для слоя 1, чтобы обеспечить гибкость формы на последующих этапах изготовления. Убедитесь, что толщина PDMS составляет примерно 2,5 мм для слоя 2, чтобы снизить вероятность провисания на последующих этапах изготовления. Толщина PDMS измеряется линейкой после того, как формы PDMS вырезаются в необходимые формы.
    5. Отверждайте PDMS в духовке при температуре 80 °C в течение 2 часов и следите за тем, чтобы блюдо было расположено максимально горизонтально во время процесса. Дайте форме PDMS и вафле остыть до комнатной температуры. Аккуратно извлеките форму PDMS целиком из пластины с помощью острого хирургического лезвия и мягкого пинцета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность пластины. Проверьте, не образуются ли остатки PDMS на поверхности пластины при отслаивании PDMS. Это сигнализирует о том, что поверхность пластины должна быть повторно силанизирована.
    6. Разрежьте пресс-форму PDMS на блоки, которые содержат интересующие вас особенности, и храните эти блоки в чистых чашках Петри (диаметр 150 мм, высота 25 мм) или в вакуумной камере, когда они не используются. Манипулируйте пресс-формой PDMS, не затрагивая основные функции.

2. Изготовление микросхем и сборка устройств

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полимер с низкой вязкостью, отверждаемый ультрафиолетовым излучением (максимальный диапазон поглощения ультрафиолетового излучения 350-380 нм) для изготовления микрофлюидного чипа методом формования PDMS. УФ-отверждаемый клей позволяет интегрировать полиакриламидный (ПА) гидрогель в качестве прозрачной, ионопроницаемой и эластичной клеточной подложки. Свойства геля PA поддерживают его в качестве датчика механического напряжения в тканях, который позволяет визуализировать живые клетки и стимулировать статическим током. В конечном итоге чип будет прикреплен к картриджу, в котором находится питательная среда и который подключается к электродным камерам.

  1. Подготовка основания для стеклянного покровного стекла
    1. Алмазной фрезой надрежьте необходимое количество прямоугольных стеклянных покровных стекол (170 мкм) до размера 37 × 24мм2, чтобы они соответствовали размерам картриджа (Дополнительный файл 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покровное стекло имеет толщину 170 мкм, совместимую с визуализацией с высоким разрешением, но является хрупким и требует бережного обращения. Надевайте перчатки и защитные очки. При появлении видимых трещин немедленно утилизируйте прямоугольные стеклянные покровные стекла, так как сколы от этих прямоугольных стеклянных покровных колпачков могут представлять опасность утечки. В качестве альтернативы вы можете заказать покровные накладки нужного размера у производителей покровных накладок. Не прикасайтесь к поверхностям прямоугольных стеклянных покровных крышек голыми руками и оставляйте пятна, которые могут ухудшить качество изображения.
    2. Поместите прямоугольные покровные стекла в чистую чашку Петри, не накладывая их внахлест, и перенесите их в плазменную камеру. Создайте вакуум, но в конце впустите немного воздуха. Активация поверхностей прямоугольных стеклянных покровных колпачков с помощью воздушной плазмы (от 30 с до 5 мин, 29,6 Вт, в зависимости от состояния оборудования)
      ПРИМЕЧАНИЕ: На следующем этапе следует использовать только те стороны, которые полностью подвергаются воздействию плазмы (т.е. верхние поверхности). Выполните шаг 2.1.3 в течение 30 минут после воздействия плазмы. На этом этапе камера должна выглядеть розово-фиолетовой, если была сгенерирована воздушная плазма. Если последние этапы склеивания успешны, уменьшите продолжительность плазменной резки для удобства.
    3. Приготовьте 10 мл раствора для обработки поверхности, состоящего из 0,3% уксусной кислоты и 0,5% 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата, растворенного в 100% этаноле. Обработайте этим раствором прямоугольные стеклянные покровные стекла в чашке Петри (диаметр 150 мм, высота 25 мм) в течение 5 минут на шейкере, чтобы обеспечить хорошее сцепление с микрофлюидными слоями на основе клея, отверждаемыми ультрафиолетовым излучением. Убедитесь, что прямоугольные стеклянные покровные стекла полностью погружены в раствор и обработаны с обеих сторон.
      ВНИМАНИЕ: Раствор для обработки поверхности вызывает коррозию. Обращайтесь с ним в вытяжном шкафу.
    4. Прямоугольные стеклянные покровные стекла трижды промойте 100% этанолом, не давая им высохнуть во время процесса. Высушите прямоугольные стеклянные покровные стекла один за другим с помощью газообразного азота и обдувочного пистолета. Обеспечьте достаточную скорость обдува, которая аккуратно удаляет капли жидкости с поверхностей основания coverslip, предотвращая появление жидких пятен. Прямоугольные стеклянные покровные стекла хранят в чистой чашке Петри (диаметр 150 мм, высота 25 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте обдувочный пистолет, чтобы направить поток воздуха параллельно основанию покровного стекла и избегайте чрезмерной скорости обдува, чтобы предотвратить разбивание стекол.
  2. Изготовление слоя 1 (Рисунок 2C)
    1. Поместите и расплющите чистую форму Layer 1 PDMS лицевой стороной вверх на чистую пластиковую крышку посуды (диаметр 60 мм, высота 15 мм). Медленно нанесите пипеткой 500 мкл жидкого УФ-отверждаемого клея на форму, тщательно смачивая все выступающие структуры с помощью шпателя. Удалите пузырьки воздуха, образовавшиеся в процессе смачивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистые пресс-формы PDMS можно приготовить с помощью ленты для удаления пыли или остатков клея, отверждаемых ультрафиолетовым излучением, или путем очистки этанолом. В качестве дополнительной меры предосторожности храните пресс-формы PDMS в вакуумных камерах, когда они не используются.
    2. Аккуратно прижмите покровное стекло к форме PDMS. Не допускайте намокания верхней стороны покровного стекла избытком УФ-отверждаемого клея, так как остатки клея, отверждаемые УФ-излучением, могут помешать образованию чистого и плоского покровного стекла. Удалите излишки УФ-отверждаемого клея с помощью лабораторных салфеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно убедиться, что характеристики пресс-формы PDMS, перенесенной на УФ-отверждаемый клеевой слой, совпадут с картриджем, к которому она будет прикреплена. Для этого отметьте покровное стекло растворимым маркером в том месте, где будут располагаться центры патронных лунок (их три). Используйте эти метки для выравнивания покровного стекла с элементами пресс-формы PDMS при нажатии на прямоугольное стеклянное покровное стекло.
    3. Частично отверждайте конструкцию под равномерным освещением ультрафиолетовым светом (363-370 нм, 224 мВт/см2) в течение 10 с. Позже сотрите следы с помощью 75% этанола. Крепко держите конструкцию на ровной поверхности и медленно снимайте с нее форму слоя 1 PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частичное отверждение позволяет сформировать достаточно прочный УФ-отверждаемый адгезивный слой, что позволяет отслаивать форму PDMS на этом этапе. Это также облегчает склеивание с частично отвержденным слоем 2 на последующих этапах изготовления двухслойной УФ-отверждаемой клеевой структуры. Форма PDMS слоя 1, которая была подготовлена толщиной 1,5 мм (шаг 1.2.4), обеспечивает достаточную гибкость PDMS, что снижает вероятность разрушения тонкого покровного стекла в процессе лущения. Пресс-форму PDMS можно повторно использовать до десяти-двадцати раз, после чего на поверхности PDMS может образоваться белесый слой остатков клея, отверждаемых ультрафиолетовым излучением, что снижает толщину конструкции. В этом случае используйте новые пресс-формы PDMS.
  3. Изготовление слоя 2 (Рисунок 2D)
    1. Поместите чистую форму PDMS слоя 2 лицевой стороной вниз на плоскую плиту PDMS (толщина плиты > 2,5 мм для обеспечения высокой жесткости). Аккуратно постучите по элементам сверху с помощью пинцета. Обратите внимание на затемнение или оптический контраст на предмет затемнения или оптического контраста под элементами - это указывает на правильный контакт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опорные столбы, окружающие основные элементы (два круглых отверстия и щель), имеют решающее значение для предотвращения провисания поверхности пресс-формы PDMS.
    2. Заполните пространство между формой PDMS и плитой с помощью жидкого УФ-отверждаемого клея с помощью капиллярного эффекта. Частичное отверждение конструкции под воздействием ультрафиолетового излучения (363-370 нм, 224 мВт/см2) в течение 10 с.
    3. Аккуратно снимите композитный УФ-отверждаемый клеевой слой и форму PDMS с плиты PDMS с помощью пинцета с мягкой подкладкой. При необходимости обрежьте лишние края УФ-отверждаемого клеевого слоя острыми ножницами.
  4. Склеивание слоев 1 и 2 (Рисунок 2E)
    1. Поместите слой 1, прикрепленный к прямоугольному стеклянному покровному стеклу на плоскую поверхность. Совместите слой 2 (все еще прикрепленный к пресс-форме PDMS) со слоем 1 и плотно нажмите на оба слоя, убедившись, что под элементами видны «тени».
    2. Отверждение структуры под воздействием ультрафиолетового излучения (363-370 нм, 224 мВт/см²) в течение 10 с для соединения слоев 1 и 2, которые образуют двухслойную структуру микрофлюидного чипа. Аккуратно снимите форму PDMS со стружки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить успешное отслаивание формы PDMS от чипа, используйте пинцет для отделения каждой опорной стойки PDMS от УФ-отверждаемого клеевого слоя 2 на шаге 2.4.1. Это действие помогает снизить общую адгезию между формой PDMS и слоем 2, что важно для отслаивания.
  5. Интеграция полиакриламидного геля (Рисунок 2F)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим разделом подготовьте столько чипов, сколько требуется для эксперимента с мультиплексированием.
    1. Приготовьте раствор прекурсора геля PA, аккуратно перемешав ингредиенты в таблице ниже, соответствующие жесткости геля PA по выбору24 (см. таблицу 1). Будьте осторожны и не допускайте попадания пузырьков воздуха во время пипетирования, так как кислород препятствует гелеобразованию.
      ВНИМАНИЕ: TEMED и APS токсичны. Работайте в вытяжном шкафу и надевайте перчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется осторожное пипетирование и обращение, так как речь идет о небольших объемах жидкости (1 мкл TEMED на 1 мл раствора прекурсора геля PA). Жесткость геля может влиять на поведение клеток, как показано во многих механобиологических исследованиях. Выберите наиболее подходящую для ваших экспериментов жесткость. Флуоресцентные шарики служат в качестве реперных маркеров для деформации геля и вывода механических напряжений. Раствор вихревых шариков перед пипетированием раствора в растворе-предшественнике геля PA. Рекомендуется не смешивать малый объем TEMED в последнюю очередь, так как растворы прекурсоров геля PA начинают разрастаться при добавлении обоих инициаторов, и небольшие объемы трудно тщательно перемешать в течение этого короткого времени.
    2. Немедленно нанесите пипеткой 10 мкл раствора-предшественника геля PA в середину тканевой области и поверх щели слоя 2 (рис. 1B, 2F). Аккуратно придавите круглым стеклянным покровным стеклом (диаметр 10 мм) до образования плоского геля. Наблюдайте, как раствор ПА поступает в слой 1 через щель, и остановитесь у ряда столбов барьера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При объеме 10 мкл раствора прекурсора геля PA образуется гель толщиной 100 мкм над слоем 2. Изменяйте этот объем в зависимости от требуемой толщины геля. Пипеткой нанесите раствор на чип как можно скорее, так как раствор ПА начинает полимеризоваться после добавления инициаторов. Надавите на раствор с нужным усилием, чтобы раствор не перелился через столбы барьера и не заблокировал канал. Выбросьте чип, если каналы заблокированы. Для мягких гелей с жесткостью 5 кПа или ниже используйте стекловодоотталкивающий средство для обработки круглых стеклянных покровных стекол, чтобы сделать их гидрофобными. В частности, погрузите покровные стекла в стекло водоотталкивающее средство на 5 минут, промойте 100% этанолом 3 раза и высушите газообразным азотом. Это облегчает последующее отслоение покровного стекла от полимеризованного геля, не разрушая гель.
    3. Немедленно отверждайте микрофлюидный чип под воздействием ультрафиолетового излучения (363-370 нм, 224 мВт/см2) в течение 5 минут. Подождите не менее ~1 часа, чтобы гель PA полностью застыл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это полностью отверждает чип, позволяя полимеризованному гелю PA сцепиться со структурой. Шаги 2.5.1, 2.5.2 и 2.5.3 должны быть выполнены в быстрой последовательности.
    4. Тщательно инкубируйте чип в HEPES (0,1 M, pH 7,4) в течение не менее 1 часа или более, чтобы смочить гель и ослабить адгезию между покровным стеклом и гелем. Аккуратно снимите покровное стекло острым пинцетом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для более мягких гелей с жесткостью 5 кПа или ниже увеличьте инкубационный период до 10 часов на шейкере, чтобы обеспечить чистое удаление покровного стекла из геля без нарушения структуры геля. Иногда между прямоугольной основой покровного стекла и УФ-отверждаемым слоем 1 на клеевой основе могут образовываться структурные узоры в несколько десятков и сотен микрометров. Эти узоры могут мешать получению изображений в светлом поле, но оказывают минимальное влияние на флуоресцентную визуализацию. Это может быть улучшено путем плазменной активации прямоугольных покровных стекол, как показано на шаге 2.1.2.
  6. Склеивание чипа и картриджа (Рисунок 2F)
    1. Поместите очищенный картридж из поликарбоната медицинского назначения (Дополнительный файл 4) на ровную поверхность нижней стороной вверх. Высушите гель на чипе лабораторными салфетками сбоку. Совместите чип лицевой стороной вниз с картриджем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При тестировании новых конструкций картриджей можно использовать методы механической обработки или 3D-печати. Когда конструкция готова, можно использовать литье под давлением для производства большого количества картриджа.
    2. Нанесите пипеткой УФ-отверждаемый клей в щели между чипом и картриджем, которые будут заполнены с помощью капиллярного эффекта. Отверждение ультрафиолетовым светом (363-370 нм, 224 мВт/см2) в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы УФ-отверждаемый клей не перелился в каналы или на другую сторону основания покровного стекла.
  7. Удаление неполимеризованного раствора ПА
    1. С помощью пробки PDMS и шприца наберите примерно 5 мл HEPES (0,1 М, pH 7,4) через каналы удаления отходов, чтобы вымыть неполимеризованный раствор предшественника геля PA, токсичный для клеток.
    2. Инкубируйте гель в устройстве с 2 мл HEPES (0,1 М, pH 7,4) на устройство, и поместите его на шейкер на 1-2 дня, чтобы обеспечить полное удаление неполимеризованного раствора прекурсора геля PA.

3. Завершение настройки

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как устройства изготовлены, завершите настройку (Рисунок 1C), покрыв PA-гель белком ECM для посева клеток, подключив устройства к электродной камере для электрической стимуляции и поместив устройства во вкладыши, держатели и крышку камеры с живыми клетками для мультиплексированных экспериментов по визуализации живых клеток.

  1. Подготовка стерилизованных компонентов
    1. Все компоненты установки, кроме устройства (Таблица материалов), должны быть обработаны ультразвуком в следующем порядке: сначала в мыльной воде в течение 30 минут, затем в воде MQ в течение 30 минут и, наконец, в 75% этаноле в течение 30 минут. После этого высушите их в духовке при температуре 60 °C и обработайте ультрафиолетовым излучением при температуре 200-280 нм в шкафу биобезопасности в течение 30 минут для достижения стерилизации.
  2. Функционализация геля PA с белком ECM
    1. Стерилизуйте устройства ультрафиолетовым излучением (200-280 нм) в шкафу биобезопасности.
    2. Приготовьте необходимое количество 50 мкг/мл рабочего раствора Collagen I в 1x DPBS на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте коллаген, который я запасаю на льду, чтобы предотвратить гелеобразование. Для полного погружения геля на каждое устройство требуется 100-150 мкл рабочего раствора Collagen I. Аккуратно пипетируйте растворы коллагена I, чтобы избежать образования волокон.
    3. Приготовьте необходимое количество рабочего раствора Сульфо-САНПА (СС) на льду. Для каждой обработки гелем требуется примерно 80 мкл рабочего раствора SS, из которых 2 мкл исходного раствора SS (растворенного в безводном ДМСО) разбавляют в 80 мкл холодного гепса (при температуре холодильника 4 °C, 0,1 М, pH 7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: SS чувствителен к влаге; Избегайте конденсации влаги на продукте, уравновешивая стандартные флаконы до комнатной температуры перед открытием. Для достижения наилучшей производительности используйте сталь без взвешивания и подготавливайте запасы в безводном ДМСО. Используйте его как можно скорее. Холодный буфер HEPES используется для снижения скорости гидролиза SS при подготовке рабочего раствора SS. Каждый гель требует двух обработок рабочим раствором SS, чтобы гарантировать, что поверхность геля PA будет хорошо функционализирована.
    4. Высушите гель в приборе, промокнув его по краям лабораторными салфетками. Пипеткой нанесите 80 мкл рабочего раствора SS на гель, обеспечивая полное погружение поверхности геля в раствор SS. Обработайте гель ультрафиолетом (363-370 нм, 24,5 мВт/см2) в течение 5 мин для активации SS. Промойте 3 раза холодным HEPES (0,1 М, pH 7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно нанесите пипетку SS в середину отверстия картриджа, чтобы предотвратить притяжение SS к стене.
    5. Повторите шаг 3.2.4, но в конце промойте три раза холодным 1x DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 3.2.3 по 3.2.5 должны быть выполнены в быстрой последовательности для предотвращения гидролиза SS. Смытый гель должен выглядеть как более темный оттенок красного на этом этапе, если поверхностная активация SS прошла успешно.
    6. Нанесите пипеткой 100 мкл раствора коллагена I на гель PA, полностью погрузив гель. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа, затем смыть неприкрепленный коллаген 1x DPBS три раза. Перед использованием погрузите гель в 1x DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец с коллагеновым покрытием I можно хранить в холодильнике при температуре 4 °C в течение нескольких дней.
  3. Подключение устройств к электродным камерам
    1. Крепите устройства к вставкам с помощью винтов (рисунок 1С, тип винта: M3 X 10 мм). Затем закрепите до четырех узлов вкладыша прибора в держателе, предназначенном для установки на предметный столик микроскопа (тип винта: M3 X 5 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если максимальное количество сборок вставок для устройств не используется, рекомендуется заполнить все остальные слоты держателей пустыми устройствами, чтобы закрыть пространство и сохранить хорошие условия для живых клеток для последующих экспериментов по визуализации. Пустые устройства можно просто изготовить, приклеив картриджи к оголенным прямоугольным стеклянным покровным стеклам.
    2. Заполните устройства питательной средой (DMEM++, по 2 мл в каждую из основных лунок). Далее протяните 2 мл среды через каналы удаления отходов, чтобы промыть и заменить 1x DPBS.
    3. Подготовьте две пробирки объемом 50 мл с крышками со сквозными отверстиями, которые будут функционировать как электродные камеры. Создайте отверстия соответствующего размера и количества, чтобы надежно прилегать к платиновым электродам и трубкам Tygon, соединив электродные камеры с приборами. Заполните каждую электродную камеру 45 мл питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстия на колпачках можно легко сделать с помощью острых хирургических лезвий.
    4. Подготовьте соединение между электродными камерами и устройствами: Присоедините по два разъема трубки к каждому устройству. Вставьте зажим для трубки на каждую трубку Tygon (рисунок 1C). Протяните питательную среду через трубки с помощью шприца и плотно зафиксируйте их. Подсоедините один конец трубки со средним заполнением к электродной камере, а другой — к устройству.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите вероятность появления пузырьков в трубках за счет использования предварительно нагретой среды и/или дегазации среды в вакуумной камере. Предотвратите образование пузырьков воздуха на границе между трубкой Tygon и соединителем трубки, зажмите концы трубки, чтобы выпячивать поверхность среды, прежде чем погружать ее в среду в трубке, или сделайте физическое крепление к соединителям трубки.
    5. Отрегулируйте относительную высоту между поверхностями питательной среды в устройствах и электродных камерах с помощью лабораторного домкрата. Отпустите зажимы для трубок и дайте всем средним поверхностям сбалансироваться до одинаковой высоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте застегивать зажимы трубок всякий раз, когда перемещается вся установка, чтобы избежать переполнения жидкостей.
    6. Выполняйте контроль качества, измеряя сопротивление каждого устройства отдельно с помощью измерителя электрического источника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы отпустили только зажим трубки устройства, для которого измеряется сопротивление, при этом зажимы других устройств, подключенных параллельно, надежно закреплены.

4. Монослойный рост и эксперименты с живыми клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: Для формирования правильного сливающегося монослоя и достижения равномерно распределенной плотности электрического тока, которая зависит от слияния и электрического сопротивления монослоя. Затем обеспечьте надлежащие условия для живых клеток на микроскопе для долгосрочных экспериментов по визуализации и электростимуляции.

  1. Рост монослоя
    1. Отделите клетки MDCK с помощью трипсина от колб T25. Центрифугируйте вниз и подсчитайте объем среды, необходимый для получения 0,1 миллиона ячеек. Суспензируйте это количество ячеек и хорошо перемешайте их в среде объемом 2 мл в центрифужных пробирках.
    2. Направьте пипеткой всю насыщенную клетками среду в лунку на область ткани. Дайте клеткам отстояться в течение 15 минут, прежде чем медленно перенести всю установку в инкубатор для тканевых культур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого устройства плотность затравки 0,1 миллиона клеток соответствует 0,06 миллиона клеток на квадратный сантиметр (6 × 104 ячейки/см2). Такая плотность посева достаточно разрежена, и клетки растут в течение 2 дней, прежде чем достигнут сливающегося состояния. Этот процесс обеспечивает правильно поляризованный и однородный монослой, без необходимости смывать излишки неприкрепленных клеток, которые рискуют нарушить ткань. Важно оставить этап осаждения в покое, чтобы произошло равномерное затравливание клеток.
    3. Дайте клеткам расти в инкубаторе (37 °C, 5% CO2, 90% влажности) в течение 72 часов, чтобы достичь плотности клеток >~50 клеток/100мкм2. Ежедневно проверяйте на настольном микроскопе, с фазовым контрастом, чтобы контролировать процесс роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При таком количестве засеянных клеток клетки MDCK достигнут 70%-80% конфлюенции через 24 ч, полного слияния через 48 ч, а дальнейшее увеличение плотности клеток и созревание тканей до 72 ч. Через 24 ч средняя длина клетки составляет около 10-20 мкм. Через 48 ч межклеточные соединения и тело клетки имеют четкий контраст при фазово-контрастной визуализации. Этот контраст резко снижается через 72 часа.
  2. Визуализация живых клеток
    1. Выбирайте эпифлуоресцентный или конфокальный микроскоп в зависимости от потребностей эксперимента. Когда клетки экспрессируются или окрашиваются флуоресцентными маркерами, выбирайте конфокальные для трехмерного наблюдения за формой клеток и деформациями гелевой подложки. Для двумерного наблюдения выбирайте фазовый контраст и эпифлуоресценцию, которые дают меньшую фототоксичность. Включите систему живых клеток за 1 час до того, как поднесите установку к микроскопу, чтобы обеспечить стабилизацию температуры в микроскопе до 37 °C, 5%CO2 и влажности 90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Системный контроллер живых клеток показывает условия в инкубаторе на вершине и подает звуковой сигнал, когда условия становятся неоптимальными. Поскольку крышка инкубатора на ступеньке отличается от коммерческой из-за необходимости размещения трубок устройства, которые выходят наружу, система нуждается в повторной калибровке, чтобы обеспечить хорошие условия для живых клеток для длительных экспериментов (от нескольких дней до недели). Калибровка может быть выполнена на основе руководства пользователя, при этом положение датчиков в экспериментах должно оставаться таким же, как и в условиях калибровки. Проверьте скорость испарения среды в инкубаторе на вершине ступени и состояние pH при использовании среды, содержащей фенольный красный.
    2. Установите установку на микроскоп так, чтобы электродные камеры располагались по бокам. Убедитесь, что электронный предметный столик микроскопа имеет достаточно места для перемещения и не натыкается на камеры электродов. Убедитесь, что высота поверхности среды уравновешена и находится на одинаковой высоте между теми, которые находятся в устройствах и электродных камерах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя поверхность в лунках устройства, где находится тканевая область (Рисунок 1C), оказывает значительное влияние на светлую и фазово-контрастную визуализацию. Мениск приведет к нежелательной фокусировке света. Убедитесь, что поверхность среды плоская по краям лунки, но обратите внимание, что испарение среды в камере с живыми клетками приведет к деформации этой плоской поверхности через некоторое время. Чтобы решить эту проблему, одним из решений является помещение плоского стеклянного покровного стекла в контакт с поверхностью среды, чтобы выровнять эту поверхность. Этот покровный стекло должен иметь меньшую площадь, чем лунка, чтобы он не препятствовал газообмену, что важно для роста клеток. Другой вариант — наложить на среду минеральное масло, пригодное для клеточных культур.
    3. Настройте программное обеспечение.
      1. Выбирайте объективы с 10-кратным или 20-кратным увеличением для визуализации цельных тканей с помощью эпифлуоресцентного микроскопа и объективы с 30-кратным увеличением (WD 0,8 мм, NA 1,05) для конфокальной визуализации с более высоким разрешением.
      2. Для визуализации всей ткани выберите несколько положений, чтобы покрыть прямоугольную область в области ткани (рисунок 1A, например, 5 строк на 5 столбцов, средний ряд закрывает щель, а другие — за пределами щели). Выберите флуоресцентный и светлопольный каналы в соответствии с клеточными линиями, используемыми в результирующей части (канал 488 для зеленой флуоресценции и канал 561 для красной флуоресценции). Выберите временной интервал в 1 час, чтобы снизить фототоксичность в этом долгосрочном эксперименте по визуализации на срок до нескольких дней.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Другие линзы объектива, такие как 4x, можно выбрать, если требуется более широкий обзор всей ткани.
  3. Электростимуляция
    1. Проверьте количество устройств, относительное сопротивление устройства и целевой электрический ток каждого устройства. Определите общий электрический ток, который будет подаваться в течение нескольких часов или до недели в общей системе.
    2. Подача электрического сигнала в режиме токо-зажима. Для 3 устройств с одинаковым канальным сопротивлением, с одной контрольной группой (без электрического тока, с закрепленным зажимом трубки), одним апикально-базальным (AtB) состоянием тока и одним базально-апикальным (BtA) состоянием тока (Рисунок 1D), подайте общий ток 20 мкА с источником-измерителем. Это приводит к тому, что для каждого устройства подается 10 мкА с расчетной плотностью тока ~10 мкА/см2 , которая является физиологически значимой (подробнее в обсуждении).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее напряжение составляет около десятков милливольт, в зависимости от длины трубки Tygon. Такой электрический ток может подаваться непрерывно в течение нескольких дней до недели. Красный индикатор фенола изменит цвет в электродных камерах (более кислый в камере с положительным электродом), но не в инкубаторе на стадии стадии, который хорошо откалиброван. Клетки будут оставаться здоровыми до тех пор, пока условия для живых клеток поддерживаются в хорошем состоянии. Исследователи могут менять среду в инкубаторе на вершине сцены один раз в два дня, а среду в электродных камерах — раз в несколько дней. Закрепите зажимы трубок при переключении электродных камер, чтобы избежать переполнения среды. Как упоминалось в шаге 3.1.1, помните, что у вас должно быть пустое устройство, чтобы закрыть пространство держателя. Это гарантирует, что камера живых клеток находится в надлежащем состоянии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все представленные здесь результаты адаптированы из предыдущей публикации4; Более подробную информацию можно найти в этой публикации.

Этот протокол позволяет подавать внешний ионный ток или электрическое поле, перпендикулярное плоскости клеток или тканей. Эта электрическая стимуляция возмущает эндогенную трансэпителиальную разность электрических потенциалов (ТЭП) и позволяет изучить роль ТЭПЛ в управлении поведением тканей. В соответствии с протоколом, клетки дикого тип...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол содержит подробные шаги и логику проектирования для изготовления нового микрофлюидного устройства для проведения экспериментов по трансэпителиальному электрическому возмущению потенциала и изучения биоэлектрических эффектов с помощью методов визуализации живых клеток и механобиологии. Значимость этого метода очевидна по сравнению с другими родственными методами. Например, в одном из родственных методов используется простой микрофлюидный чип с одноканальной конструкцией, кот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Убедитесь, что все авторы раскрыли все конфликты интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF и TBS выражают благодарность за полезные беседы с доктором Сюмэй Гао, Синьру Ю и другими членами группы Лаборатории тканевой биофизики. Мы благодарим Центр обслуживания специализированных технологий (CTSF) в Университете Уэстлейк за помощь в составлении нашего схематического чертежа. Эта работа была поддержана Образовательным фондом Уэстлейк, Лабораторией наук о жизни и биомедицины Уэстлейк и Исследовательским центром отраслей будущего (RCIF) при Университете Уэстлейк.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x DPBSGibco14190144
3-(триметоксисилил)пропилметакрилат, ТРМСигма2530850После вскрытия хранить под азотом.
Пробирка Falcon 50 млКорнинг430829Проделайте 4 отверстия в крышке трубки сокола объемом 50 мл, чтобы электрод и трубка могли пройти через крышку и погрузиться в среду. Для комплекта микрофлюидного устройства необходимо не менее 2 колпачков.
Уксусная кислотаСинофарм10000208
Акриламид раствор, 40%Сигма79061Токсичный
Воздушный насосЛаборатория ОКООКО-АПКомпонент микроскопа-настольного инкубатора
Персульфат аммония, АФСАладдинA112447
Патрон--Картридж изготавливается по индивидуальному заказу, а конструкция относится к дополнительному материалу. Сырьем является PC Makrolon 2858 Medical Grade, и здесь вы можете найти более подробную информацию: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Клипы--Robert Clip, для тюбинга  наружного диаметра 4,5 мм. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Коллаген IКорнинг354236
Вода DI Milli-QМилли-К-
Модифицированная среда для культуры Dulbecco's Eagle's Medium, DMEM (с высоким содержанием глюкозы)Gibco11965092DMEM++ - это DMEM с дополнительными 10%  FBS (Sigma-Aldrich) и 100  единиц/мл пенициллин-стрептомицина (Gibco).
Вольер черная клеткаЛаборатория ОКОН201Компонент микроскопа-настольного инкубатора
Эпифлуоресцентный инвертированный микроскопОлимпIX83
Абсолют этанолаСинофарм10009218
Фетальная бычья сывороткаСигмаФ8318
Флуоресцентные шарики, 0,1 μ L, красный (580/605)ТермоФ8801
Газовая камераЛаборатория ОКОХ201-ПРИОР-СП200/400/600Компонент микроскопа-настольного инкубатора
Газовый ручной смесительЛаборатория ОКО2GF-СМЕСИТЕЛЬКомпонент микроскопа-настольного инкубатора
ГенетикинGibco10131027GFP– актин и H1– GFP MDCK поддерживались с использованием сред с добавлением 0,5&тонких версий; мг/мл генетина (Gibco) для поддержания экспрессии генов
ХЕПЕССигма736459
ИзопропанолСинофарм80109218
КимвайпсKimberly-Clark ProfessionalЛХ-70155Лабораторный стеклоочиститель
Более длинный винт--Прецизионный прецизионный винт с круглой головкой и никелированной круглой головкой, M3 x 10 мм. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Микрофлюидный соединитель--Полипропиленовый фитинг с прямым соединением, 1/16"-10-32UNF.
Держатель планшетов MultiwellЛаборатория ОКОH201-МВТ-ХОЛДЕР-NZ500Компонент микроскопа-настольного инкубатора
N',N'-метиленбисакриламид, 2%Сигма110269Токсичный
NOA 73Продукты Norland17-345УФ-отверждаемый клей
Пенициллин-стрептомицин, PS (10 000 ЕД/мл)Gibco15140122
Чашка Петри (150 мм и 25 мм)Корнинг430599Выдерживать не менее 80 °°; C за 2 ч
Инструмент Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGПикоплазменная плазмаДля лечения O2 плазмы
Плазменный очистительГаррик ПлазмаПДК-002Для воздушно-плазменной обработки
Пластиковая тарелка (диаметр 60 мм, высота 15 мм)Гнездо705001
Платиновые электродыТяньцзинь Аида ХэншэнПт005Диаметр 0,5 мм, длина 37 мм 
Rain-X Оригинальный стеклоотталкивающий водоотталкивающий напитокITW Chemical Products800002242
Прямоугольный покровный листМариенфельд0107222  1,5 ч, 24 и острый; 50 мм<суп>2, 170 шт; м толщина
Круглое стекло покровное стеклоМариенфельд0111500  1,5H, круглый диаметр 10 мм
Более короткий винт--Никелированный крестообразный прецизионный винт с круглой головкой, M3 x 4 мм. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Сульфо-САНПА, без весаТермоА35395Исходный раствор SS: 20 мг/мл в безводном ДМСО, 2 мкм; L для каждого; Рабочий раствор СС: 0,5 мг/мл СС в ГЕПЕС (0,1 М, рН 7,4).
SYLGARD 184 Комплект силиконовых эластомеровDow CorningH052KCM147Конечным продуктом является полидиметилсилоксан, PDMS. Этот набор включает в себя базовую смолу PDMS и сшивающий агент.
Единица измерения температурыЛаборатория ОКОH201-T-UNIT-BLКомпонент микроскопа-настольного инкубатора
Тетраметилэтилендиамин, ТЕМЕДСигма110189Токсичный
Сенсорный дисплейЛаборатория ОКООКО-ТАЧКомпонент микроскопа-настольного инкубатора
Тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил-1-трихлорсиланСигма78560459
Трипсин-ЭДТА (0,25%)ГИБКО25200072
Тюбинги TygonТайгонAJK00002Внешний диаметр (OD) = 3,2 мм, Внутренний диаметр (ID) = 1,6 мм
Ультразвуковой очистительСупмилеКД-300ДЭ
УФ-светодиодная машина для отвержденияGHUVСГС-МФЛГУФ-светодиодный источник света, диапазон излучения: 363– 370 нм, максимальная плотность мощности: 230 мВт/см2
Модуль увлажнения без вибрацииЛаборатория ОКОHM-VFКомпонент микроскопа-настольного инкубатора
ВидВизитрон Системс ГмбХ-Визуализация более мягкой посуды
Вафельный слой1Национальный университет Сингапура, Институт механобиологии Микропроизводство-Пластина изготавливается по индивидуальному заказу, а дизайн относится к дополнительному материалу.
Вафельный слой2Национальный университет Сингапура, Институт механобиологии Микропроизводство-Пластина изготавливается по индивидуальному заказу, а дизайн относится к дополнительному материалу.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи