Методическая статья

Вскрытие черепно-лицевых тканей данио-рерио при окрашивании альцианским синим

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 сентября 2025 г.

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

В этой статье

Краткое содержание

Описанный здесь протокол представляет собой простую и удобную процедуру окрашивания и рассечения черепно-лицевых хрящей у 5-дневной личинки данио-рерио. Он может быть использован для изучения анатомии, формы и размера этих структур в различных условиях развития.

Аннотация

Рыбки данио, учитывая их оптическую прозрачность, являются отличной моделью позвоночных для изучения механизмов, с помощью которых черепно-лицевые хрящи формируются у эмбриона. Черепно-лицевые хрящи можно в целом разделить на две группы: нейрочерепную и висцерокраниумную, которые, в свою очередь, могут быть подразделены на многочисленные группы хрящей, необходимых для поддержания мозга и составляющих, среди прочего, питательный и дыхательный аппараты. В этом протоколе сначала будет описана простая и установленная процедура окрашивания у рыбок данио для визуализации этих хрящевых групп, а затем будет предложена методология препарирования и разделения нейро и висцерокрания. С помощью этих вскрытий можно легко получить простые метрики формы и размера, и в этом протоколе это демонстрируется для нёба, которое является частью переднего нейрочерепа, ткани, часто поражаемой при большинстве черепно-лицевых заболеваний у людей. Протокол может быть воспроизведен простым способом даже в условиях ограниченных ресурсов, тем самым предоставляя студентам бакалавриата ценный образовательный инструмент для ознакомления с черепно-лицевой морфологией.

Введение

Черепно-лицевой хрящ у позвоночных возникает из мультипотентной клеточной популяции, называемой клетками черепного нервного гребня1. Эти клетки сначала уточняются на дорсальных краях нервной пластинки у ранних эмбрионов, которые затем мигрируют на большие расстояния, достигая черепно-лицевой области и дуг глотки, прежде чем дифференцироваться 2,3. Сигнальные механизмы, которые управляют этой миграцией и дифференцировкой, в значительной степени консервативны у позвоночных 4,5. Несмотря на это, организация, размер и форма отдельных хрящевых элементов различаются у разных видов, что приводит к различению черепно-лицевой морфологии6. Рыбки данио, в частности, стали мощной модельной системой для изучения черепно-лицевого морфогенеза, учитывая прозрачную природу эмбрионов вплоть до личиночной стадии. С помощью простых процедур окрашивания для маркировки хряща морфология многих черепно-лицевых структур у рыбок данио была охарактеризована при различных возмущениях сигнальных путей 7,8,9, а также при воздействии на эмбрионы или личинки общих загрязнителей, присутствующих в окружающей среде10. Описанное здесь окрашивание алцианским синим цветом для маркировки хряща включает в себя использование некислотных условий, стандартизированных Уокером и Киммелем11, которые впоследствии были использованы многими лабораториями рыбок данио, работающими над черепно-лицевым развитием 5,12,13,14,15,16,17,18,19, включая описание использования в условиях старшей школы20. Бескислотное окрашивание сохраняет костные структуры в целости и сохранности, что позволяет окрашивать хрящи и кости вместе с помощью альцианского синего и ализаринового красного соответственно. Тем не менее, подробный протокол окрашивания, а также выполнения точной диссекции черепно-лицевых хрящей, особенно для содействия проведению таких исследований в условиях ограниченных ресурсов, отсутствует.

Несмотря на то, что структура скелета лица у взрослых рыбок данио довольно сложна и состоит из 43 хрящевых костей21, черепно-лицевой хрящ у личинки через 5 дней после оплодотворения (DPF), которая только что приобрела способность к питанию, относительно прост и может быть в целом разделен на дорсальный нейрокраниум и вентральный висцерокраний4. Эти структуры поддерживают мозг, вносят вклад в питательный аппарат и дают начало поддерживающим хрящам для жаберных тканей. Описанный здесь протокол позволит окрашивать хрящи рыбок данио Альциана синим, после чего последует подробная процедура рассечения нейро и висцерокрания на отдельные структуры, что в конечном итоге позволит тщательно охарактеризовать форму и размер различных хрящей в этих структурах. В качестве примера мы измеряем размеры передней области нёба (нёба), называемой решетчатой пластинкой, которая является частью нейрочерепа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры содержания и экспериментирования с рыбками данио-рерио, использованные в этом исследовании, были одобрены институциональным комитетом по этике животных, см. Reference TIFR/IAEC/2023-1.

1. Подготовка реагентов

  1. Медиа E3:
    1. Приготовьте 50-кратный бульон 1, смешав 3,25 г двухосновного фосфата натрия (0,458 мМ Na2HPO4), 0,29 г дигидрофосфата калия (0,042 мМ KH2PO4), 11,93 г хлорида натрия (4,084 мМ NaCl) и 0,48 г хлорида калия (0,128 мМ KCl) в 1 л дистиллированной воды.
    2. Приготовьте 50x бульон 2, смешав 2,43 г хлорида кальция (0,33 мМ CaCl2) и 4,07 г сульфата магния (0,33 мМ MgSO4) в 1 л дистиллированной воды.
    3. Чтобы приготовить 500 мл 1х Е3 среды, на 480 мл дистиллированной воды добавьте по 10 мл 1 и 2 (рН = 7,4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приготовления этих растворов надевайте перчатки.
  2. 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS (фосфатно-солевой буфер):
    1. Разогрейте 100 мл 1x PBS при 68 °C. Добавьте 4 г PFA и инкубируйте раствор при 68 °C с периодическим перемешиванием до полного растворения PFA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении этого реагента надевайте перчатки и маску, желательно под вытяжным шкафом, так как PFA очень токсичен.
  3. 0,05% раствор MS-222 (широко известного как трикаин):
    1. Приготовьте 4% трикаина в Е3 и храните при температуре 4 °C. Чтобы получить 10 мл трикаина, добавьте 0,40 г MS-222 в 7 мл Е3. Осторожно встряхните тюбик с раствором, чтобы перемешать и довести объем до 10 мл. Чтобы получить 50 мл 0,05% раствора трикаина, добавьте 625 мкл 4% бульона к 49,375 мл Е3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приготовления этого реагента надевайте перчатки и маску.
  4. 0,4% раствор алюминия в 70% этаноле
    1. Для приготовления 2 мл стокового раствора растворить 8 мг альцианова синего в 1 мл 50% этанола. Нагрейте раствор до 37 °C в течение 15-20 мин с периодическим перемешиванием до растворения. Как только пятно растворится, добавьте в раствор 70% этанола, добавив 900 мкл 100% этанола и 100 мкл дистиллированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор можно хранить при комнатной температуре до 2 недель.
  5. Раствор красителя - 0,02% альцианового синего, 200 мМ хлорида магния (MgCl2) и 70% этанола
    1. Для приготовления 5 мл раствора морилки альцианского синего добавьте 1 мл 1 М MgCl2, 3,5 мл 100% этанола и 250 мкл 0,4% альцианского синего бульона (8 мг альцианского синего в 2 мл 70% этанола) в 250 мкл воды и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий раствор для окрашивания для достижения наилучших результатов окрашивания.
  6. Раствор отбеливателя:
    1. Смешайте равные объемы 3% перекиси водорода (H2O2) и 2% гидроксида калия (KOH). Чтобы приготовить 2 мл раствора отбеливателя, смешайте 1 мл 3% перекиси водорода и 1 мл 2% гидроксида калия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте этот раствор свежим перед началом этого этапа. Поскольку H2O2 является светочувствительным, максимально защищайте его от воздействия света. Надевайте перчатки при работе с H,2, O2 и KOH.
  7. Раствор I: 20% глицерин + 0,25% KOH
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глицерин обладает высокой вязкостью, пипетку следует проводить с осторожностью. Во время приготовления этих растворов надевайте перчатки.
    1. Для приготовления 5 мл раствора I добавляют 2 мл 50% глицерина и 625 мл 2% KOH на 2,375 мл воды и хорошо перемешивают.
  8. Раствор II: 50% глицерин + 0,25% KOH
    1. Для приготовления 5 мл раствора II добавьте 3,570 мл 70% глицерина и 625 мл 2% KOH в 805 μл воды и хорошо перемешайте.
  9. Раствор для хранения: 50% глицерин + 0,1% KOH
    1. Чтобы приготовить 5 мл раствора для хранения, добавьте 3,570 мл 70% глицерина и 250 μл 2% KOH в 1,180 мл воды и хорошо перемешайте.
  10. 3% агарозы
    1. Растворите 3 г агарозы в 100 мл дистиллированной воды. Разогревайте в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  11. 0,1% PBST (0,1% Tween 20 в 1x PBS)
    1. Чтобы приготовить 1 л 1x PBS, добавьте 8 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na2HPO4 и 0,24 г KH2PO4 в 1 000 мл дистиллированной воды. Смешайте раствор и отрегулируйте pH до 7,4. Чтобы получить 500 мл 0,1% PBST, добавьте 5 мл 10% Tween 20 до 495 мл 1x PBS.
  12. Раствор DAPI 0,50 мкг/мл
    1. Приготовьте 10 мг/мл DAPI в 1x PBS. Чтобы приготовить 10 мл 0,50 мкг/мл раствора DAPI, добавьте 0,50 мкл исходного раствора в 10 мл 1x PBS и энергично встряхните, чтобы убедиться, что DAPI полностью растворится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При приготовлении этих растворов надевайте перчатки. Защищайте DAPI от света, так как он светочувствительный. Запас DAPI можно хранить при температуре 4 °C более года.

2. Сбор эмбрионов

  1. Посадите пары самцов и самок рыбок данио в аквариумах для разведения вечером накануне того, как потребуются эмбрионы, при этом самцы и самки рыб будут разделены барьерами.
  2. Удалите барьеры на следующее утро и соберите эмбрионы в течение 15-20 минут после удаления барьеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время удаления барьера полезно для определения стадии эмбрионов и личинок данио-рерио.
  3. Вырастите эмбрионы при температуре 28,5 °C до тех пор, пока они не достигнут 5 dpf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно заменяйте среду E3 свежей партией предварительно нагретой E3 при температуре 28,5 °C один раз в 2 дня.

3. Окрашивание алкийским синим цветом

ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки во время проведения этого эксперимента

  1. Обезболите 20-25 5-дневных личинок данио-рерио, используя 0,05% трикаин в микроцентрифужной пробирке (MCT) объемом 2 мл.
  2. После того, как личинки перестанут двигаться, что обычно занимает ~4-5 минут, удалите анестетик и зафиксируйте их в 1,5 мл 4% PFA при комнатной температуре (RT) на коромысле при 60 об/мин в течение 2 ч.
  3. Удалите как можно больше фиксатора с помощью пипетки и добавьте в образец 1,5 мл 50% этанола. Инкубируйте в течение 10 минут, покачиваясь при 60 об/мин при RT.
  4. Удалите как можно больше этанола с помощью пипетки и добавьте 1,5 мл раствора морилки Alcian blue.
  5. Инкубировать неподвижных личинок в растворе красителя в течение 18-20 ч на коромысле при 60 об/мин при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация в течение более короткого или более длительного периода времени может привести к тому, что определенные участки хряща будут недостаточно окрашены или переокрашены, соответственно. Здесь 18-20 часов окрашивания, по-видимому, лучше всего работают для четкой визуализации нейро и висцерокраниума 5-дневной личинки.
  6. Удалите раствор пятна, добавьте 1,5 мл дистиллированной воды и выдержите 1-2 минуты на коромысле при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание можно остановить на этом этапе, чтобы визуализировать клеточные границы в рассеченных хрящах. Тем не менее, недостатком прекращения протокола окрашивания на этом этапе без выполнения последующих этапов очищения является то, что границы нейро и висцерокраниума все еще будут оставаться слегка размытыми, и точное выполнение расслоений становится более сложным.
  7. Добавьте 1 мл раствора отбеливателя в образец и инкубируйте в течение 20 минут при РТ на открытом воздухе, не закрывая планшет или лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не накрывайте MCT на этом этапе, так как в результате реакции между перекисью водорода и гидроксидом калия образуется газообразный кислород, который может привести к отрыву крышки в закрытом состоянии.
  8. Удалите раствор отбеливателя и выполните следующие шаги по очистке тканей.
    1. Добавьте в образец 1,5 мл раствора I и подержите на коромысле при 60 об/мин в течение 40 минут при RT.
    2. Удалите раствор I и добавьте в образец 1,5 мл раствора II и держите на коромысле при 60 об/мин в течение 2 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы очистки помогают удалить излишки пятна, улучшая оптическую прозрачность образцов и, таким образом, способствуя эффективному выполнению вскрытия. Осторожно обращайтесь с образцами при смене растворов, так как любое повреждение может повлиять на дальнейший анализ их морфологии.
  9. Выньте раствор II и добавьте 1,5-2 мл раствора для хранения. Из-за присутствия глицерина окрашенные образцы постепенно опускаются на дно в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы можно хранить при температуре 4 °C более года.

4. Вскрытие черепно-лицевого скелета

  1. Растопите 3% раствор агарозы в микроволновой печи до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегревайте, так как раствор может пузыриться из колбы. Внимательно проверяйте раствор во время выполнения этого шага.
  2. Смажьте чашку Петри диаметром 90 мм 3% агарозой, заливая расплавленную агарозу до тех пор, пока не будет покрыта одна треть глубины чашки Петри, и дайте ей застыть. В этой чашке Петри будут проводиться вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки Петри с агарозным покрытием можно приготовить за неделю и хранить при температуре 4 °C. Агарозное покрытие обеспечивает более мягкую подложку, на которой можно выполнять рассечения без повреждения щипцов.
  3. Очистите щипцы от 70% этанола и протрите их чистым листом стандартной лабораторной папиросной бумаги.
  4. С помощью пастеровской пипетки перенесите 3-4 окрашенные личинки вместе с 0,5 мл раствора для хранения в чашку Петри, покрытую агарозой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для хранения обеспечивает большую оптическую четкость при выполнении препарирования по сравнению с аналогичным выполнением в E3.
  5. Ориентируйте окрашенную личинку на ее боковую сторону (рисунок 1А) и аккуратно соскребите желток с тела личинки с помощью щипцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1B показан эмбрион, из которого был удален желток. Хорошей практикой является перенос соскобленного желтком эмбриона в новую чашку Петри перед тем, как приступать к дальнейшим этапам вскрытия, чтобы липкая желточная масса, плавающая вокруг, не мешала рассечению.
  6. После того как желток будет удален, держите личинку за область хвоста одним щипцом, а другим осторожно удалите глаза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1C показан эмбрион с удаленным желтком и глазами. Глаза следует удалять с осторожностью, так как их близость к черепно-лицевой скелету может помешать их вскрытию.
  7. С помощью щипцов осторожно потяните и отщипните мозг и другие ткани дорсально к нейрочерепу. Удерживайте личинку неподвижно одной парой щипцов, а другой парой щипцов сделайте разрез посередине (Рисунок 1C, красная стрелка), а затем отщипните ткани (Рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении этого шага будьте осторожны с удалением тканей ближе к передним областям нейрочерепа, так как хрящ может оторваться вместе с ними.
  8. Отделите голову личинки от остального тела. Область головы после этой стадии в основном содержит нейрочереп и висцерокраниум, прикрепленные друг к другу в двух точках - на переднем и заднем концах - вместе с несколькими небольшими неокрашенными тканями, прикрепленными к этим черепно-лицевым структурам (рис. 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно полностью удалить неокрашенные ткани, непосредственно прикрепленные к нейрокраниуму и висцерокраниуму. Несмотря на то, что некоторые остаточные ткани будут присутствовать, их присутствие не повлияет на последующий анализ формы или размера, поскольку они не окрашены.
  9. Осторожно разорвите два соединения между нейрочерепом и висцерокраниумом, чтобы разделить их (рисунок 1F, красные пунктирные линии). На рисунке 2 приведены изображения нейрочерепа и висцерокраниума как в интактных, так и в препарированных эмбрионах.
  10. На чистое предметное стекло добавьте каплю или две 100% глицерина. С помощью щипцов аккуратно перенесите на это предметное стекло рассеченный нейрочереп или висцерокраниум. С помощью щипцов аккуратно наложите покровное стекло на эти салфетки, убедившись, что не образуются пузыри, и запечатайте покрывающее стекло на всех предметных стеклах лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C более года, не теряя пятна.

5. Количественная оценка размеров решетчатой пластины

  1. Получите изображения нёба с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу (рис. 2D). При отсутствии камеры научного класса прикрепите к стереомикроскопу стандартный смартфон для получения изображений.
  2. Для количественной оценки загрузите изображение нёба в FIJI22, а затем используйте линейный инструмент для измерения ширины и высоты решетчатой пластинки в микронах (см. рисунок 3A-C) и определите размеры с помощью пиксельного разрешения камеры.
  3. Нарисуйте контур вокруг решетчатой пластины и нажмите «Анализировать» | Установить мерки | площадь для получения площади решетчатой пластинки (рисунок 3D,E).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Черепно-лицевой скелет рыбки данио полностью хрящевой к 5 дням после оплодотворения (dpf) и, таким образом, может быть окрашен с использованием альцианского синего, который является основным красителем, способным связываться с гликозаминогликанами, в изобилии присутствующими в хрящах23. Это приводит к окрашиванию хряща в синий цвет (рис. 1), чтобы его можно было отличить от других тканей, присутствующих в личинке, с помощью стандартного стереомикроскопа, доступного в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Черепно-лицевые пороки развития составляют большинство всех врожденных дефектов у человека, часто приводя к младенческой смертности. Тем не менее, основная этиология большинства черепно-лицевых аномалий остается невыясненной25. Черепно-лицевые структуры сложны у любого конкретного позвоночного, и поэтому с точки зрения студентов первым требованием является наличие образовательного инструмента, который предоставляет студентам общий обзор различных структур в черепн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.

Благодарности

Выражаем признательность д-ру Калидасу Кохале и его команде за техническое обслуживание рыбного хозяйства. SRN выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Департамента атомной энергии (DAE) правительства Индии (номер идентификации проекта. RTI4003, DAE OM No 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 от 11.02.2020), программа Партнерской группы Общества Макса Планка (M.PG. A MOZG0010) и грант Совета по научным и инженерным исследованиям для стартапов (SRG/2023/001716). Мы благодарим доктора Швету Верму из лаборатории за содержательные комментарии. Мы благодарим Свету Нагараджана и Упала Чаттерджи за помощь в создании фигур для рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаЛонза бионаука50004Для покрытия чашек Петри
Альцианский синий 8G Сигма-ОлдричА3157Для окрашивания хрящей
Дигидрат хлорида кальцияСигма-Олдрич12022Для создания буферов
ФотоаппаратОлимпДП28Для получения изображений
DAPIРош Медико-Биологические Науки10236276001Для мечения ядер
ЭтанолХанивелл32221Растворитель для морилки от альцианского синего
ФИДЖИВерсия: ImageJ 1.54f
ЩипцыДюмонДюмонДля проведения рассечений
ГлицеринМП биомедицина193996Для изготовления моек и монтажных образцов 
Перекись водородаМП биомедицина194057Для приготовления отбеливающего раствора
Гексагидрат хлорида магнияSARD BiosciencesSBRC0217Для создания буферов
Гептагидрат сульфата магнияСигма-ОлдричМ2773Для создания буферов
MS-222 (трикаин)Сигма-ОлдричА5040Для обезболивания личинок
Хлористый калийСигма-ОлдричП9541Для создания буферов
Едкое калиСигма-Олдрич484016Для создания буферов
Калийфосфат одноосновнойСигма-ОлдричП0662Для создания буферов
Хлорид натрияСигма-ОлдричС3014Для создания буферов
Натрия фосфат двухосновнойСигма-Олдрич71640Для создания буферов
СтереоскопОлимпСЗХ61Для проведения рассечений
Подросток-20ХИМЕДИАТК287Моющее средство, используемое для проникновения клеток

Ссылки

  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafish

Похожие статьи