Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Оценка циркадных вариаций факторов роста богатого тромбоцитами фибрина: пилотное исследование

513 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68902

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Çukurova, 2Private Practice, 3Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Çukurova

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании изучаются циркадные вариации высвобождения фактора роста от богатого тромбоцитами фибрина (PRF) и изучается корреляция с уровнем кортизола с целью оптимизации времени проведения регенеративных процедур на основе PRF.

Аннотация

Обогащенный тромбоцитами фибрин (PRF) имеет широкое клиническое применение в стоматологии, в частности, для регенерации мягких и твердых тканей, заживления лунок при экстракции, лечении дефектов пародонта, увеличении пазух носа и процедурах на слизистой оболочке. PRF представляет собой биоматериал, полученный из тромбоцитов и богатый факторами роста, полученный с помощью одноступенчатого протокола центрифугирования. Это исследование было направлено на то, чтобы оценить, демонстрируют ли факторы роста, полученные из PRF, циркадные колебания между утренними и вечерними часами. В исследовании приняли участие двадцать здоровых добровольцев, каждый из которых предоставил шесть образцов венозной крови, три в 08:00 и три в 20:00. С каждой временной точки времени одну пробирку использовали для общего анализа крови, одну — для анализа кортизола в сыворотке крови и одну — для приготовления PRF (центрифугировали при 708 x gв течение 12 минут). Факторы роста (IGF-1, PDGF, FGFR, VEGF, TGFβ-1) при PRF измеряли через 24 ч и 72 ч с помощью иммуноферментного анализа. Их уровни сравнивались между временными точками и коррелировали с уровнями кортизола в сыворотке крови. Уровни FGFR были значительно выше через 72 ч, чем через 24 ч в вечерних пробах. Тем не менее, не было обнаружено существенных различий для IGF-1, PDGF, VEGF или TGFβ-1 между утром и вечером. Уровни кортизола отрицательно коррелировали с PDGF через 72 ч в утренних пробах и с IGF-1 через 72 ч в вечерних пробах; Однако других значимых корреляций не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что время забора крови существенно не влияет на содержание фактора роста PRF, что указывает на гибкость клинических протоколов в отношении времени отбора образцов.

Введение

Обогащенный тромбоцитами фибрин (PRF) является концентратом тромбоцитов второго поколения, широко используемым в регенеративной стоматологии благодаря своему аутологичному происхождению, простоте приготовления и биологически активному содержанию1. Образованный центрифугированием цельной крови без антикоагулянтов, PRF обеспечивает фибриновую матрицу, богатую тромбоцитами и лейкоцитами, которые секретируют факторы роста, такие как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста-бета-1 (TGF-β1), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и рецептор фактора роста фибробластов (FGFr). Эти биомолекулы играют центральную роль в клеточной пролиферации, ангиогенезе, ремоделировании внеклеточного матрикса и регенерации тканей2. По сравнению с обогащенной тромбоцитами плазмой (PRP), которая требует антикоагулянтов и экзогенной активации, PRF производится с помощью одноступенчатого процесса, не содержащего антикоагулянтов, в результате которого получается физиологический фибриновый каркас с захваченными лейкоцитами и тромбоцитами. Эта архитектура поддерживает более медленное и устойчивое высвобождение факторов роста и цитокинов, потенциально повышая стабильность раны и раннее восстановление тканей при одновременном снижении сложности и стоимости 1,2. Кроме того, отсутствие антикоагулянтов и активаторов сводит к минимуму вариабельность, связанную с манипуляциями, и может лучше сохранить нативное поведение тромбоцитов, предлагая практические преимущества для использования в кресле и стандартизациисреди операторов.

Несмотря на его широкое клиническое использование, временная динамика биоактивных компонентов PRF остается плохо изученной. Циркадный ритм, являющийся внутренним 24-часовым биологическим циклом, влияет на различные физиологические системы, включая иммунную функцию, секрецию гормонов и гематологические параметры 3,4. Кортизол, основной циркадный гормон, достигает пика ранним утром и постепенно снижается в течение дня5. Важно отметить, что исследования показали, что активность тромбоцитов, способность к агрегации и их количество также могут модулироваться циркадными механизмами, что влияет на коагуляцию и заживление ран6.

Поскольку PRF получают непосредственно из периферической крови, циркадное время забора крови потенциально может повлиять на статус активации тромбоцитов и последующее высвобождение факторов роста во время полимеризации фибрина. Несмотря на то, что суточные вариации количества тромбоцитов и факторов роста в обогащенной тромбоцитами плазме ранее были проанализированы Aoto et al.7, нет исследований, систематически изучающих, демонстрируют ли PRF, приготовленные в разное время суток, измеримые различия в составе факторов роста. Таким образом, данное пилотное исследование направлено на изучение циркадных вариаций факторов роста, полученных из PRF, путем сравнения образцов, собранных утром и вечером у здоровых людей. Кроме того, мы оценивали уровни кортизола в сыворотке крови в каждый момент времени и изучали их корреляцию с высвобождением фактора роста PRF. Понимание такой временной изменчивости может помочь оптимизировать клинические протоколы и способствовать стандартизации регенеративных методов лечения на основе PRF. Нулевая гипотеза этого исследования заключалась в том, что циркадное время забора крови существенно не влияет на концентрацию факторов роста, высвобождаемых из богатого тромбоцитами фибрина (PRF); однако, основываясь на известной циркадной регуляции активности тромбоцитов и секреции гормонов, первоначально была выдвинута гипотеза, что время сбора крови (утром или вечером) может изменить содержание фактора роста PRF. С клинической точки зрения, выяснение того, является ли содержание PRF фактора роста чувствительным к циркадным вариациям, имеет важное значение для стандартизации регенеративных протоколов. Если высвобождение фактора роста остается в основном стабильным в течение дня, врачи могут быть уверены, что время проведения венепункции может не оказать существенного влияния на результаты лечения, что обеспечивает гибкость в планировании процедур. И наоборот, если возникают тонкие различия в отдельных факторах, таких как те, которые участвуют в ангиогенезе или восстановлении тканей, время забора крови может быть оптимизировано в тех случаях, когда желателен максимальный регенеративный потенциал, например, в условиях ослабленного заживления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование проводилось на кафедре пародонтологии стоматологического факультета Университета Чукурова, г. Адана, Турция, с участием 20 здоровых добровольцев. Перед включением в исследование все участники были проинформированы о цели, методологии и процедурах исследования, а также получено письменное информированное согласие. Этическое одобрение было предоставлено Комитетом по этике клинических исследований медицинского факультета Университета Чукурова (Одобрение No: 125/55, Дата: 16.09.2022). Все процедуры, включая основные рекомендации по биобезопасности при обращении с кровью человека и инструкции по утилизации отходов биологически опасных материалов и химических реагентов, были выполнены в соответствии с рекомендациями NIH-CDC8. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Отбор участников

Участники, включенные в исследование, были здоровыми людьми в возрасте от 18 до 25 лет, без каких-либо известных системных заболеваний, которые продемонстрировали адекватное сотрудничество во время процедур. Пациенты были исключены, если у них было какое-либо системное заболевание, они были беременны или кормили грудью, или использовали какие-либо лекарства или гормональные средства, которые могли повлиять на гематологические или гормональные параметры.

2. Забор крови и распределение по группам

Всего у каждого участника было собрано шесть образцов венозной крови объемом 10 мл, три утром (08:00) и три вечером (20:00). В исследовании использовались стерильные пробирки PRF из стекла без добавок (10 мл). На утреннем сеансе пробирка 1 использовалась для общего анализа крови (ОАК), пробирка 2 — для анализа кортизола в сыворотке крови, а пробирка 3 — для подготовки PRF с последующим анализом факторов роста. На вечерней сессии пробирка 4 использовалась для общего анализа крови, пробирка 5 — для анализа кортизола в сыворотке крови, а пробирка 6 — для подготовки PRF и анализа факторов роста. В зависимости от времени забора крови образцы были разделены на две группы: группа 1 состояла из чистого PRF, приготовленного из утренней крови (08:00), и группа 2 состояла из чистого PRF, приготовленного из вечерней крови (20:00).

3. PRF подготовка

Образцы крови центрифугировали при давлении 708 x g в течение 12 мин при комнатной температуре с использованием центрифуги, оснащенной ротором с фиксированным углом наклона 40° и стеклянными пробирками объемом 10 мл. Используемое устройство имело радиус ротора, регулируемый в диапазоне от 88 мм до 110 мм; В этом исследовании для стандартизации протокола был выбран радиус 88 мм. Во время процедуры не использовались антикоагулянты. После центрифугирования полученные PRF были макроскопически оценены для обеспечения правильного формирования, которое характеризуется гладкой и однородной поверхностью, упругой и цилиндрической формой, а также компактной, твердой консистенцией.

4. Анализ фактора роста ИФА

Сгустки PRF были аккуратно отделены от слоя эритроцитов с помощью стерильных ножниц. Каждый сгусток взвешивали, и добавляли питательную среду RPMI-1640 в соотношении 1:1 по весу (г = мл) с целью стандартизации инкубационной среды для всех образцов и обеспечения последовательной диффузии растворимых факторов роста из матрицы PRF. Это соотношение позволяет проводить пропорциональную экстракцию на основе размера сгустка, сводя к минимуму изменчивость концентраций факторов роста из-за неравной массы сгустка. Образцы инкубировали в орбитальном вибростенде при 100 об/мин и 3 °C в течение 24 ч и 72 ч для обеспечения равномерной диффузии факторов роста из матрицы PRF в питательную среду. После инкубации надосадочную жидкость собирали и хранили при температуре −8 °C до проведения анализа. Концентрации факторов роста количественно определяли с помощью коммерческих наборов ИФА, включая FGFR, VEGF, IGF-1, PDGF и TGF-β1, в соответствии с протоколом подготовки производителя 9,10.

5. Этапы ИФА

Стандарты и образцы (по 100 мкл каждый) добавляли в лунки и инкубировали при 3 °С в течение 90 мин. Затем лунки трижды промывали промывочным буфером. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл меченого биотином антитела и инкубировали при 3 °C в течение 60 мин, после чего проводили три дополнительные промывки. Затем добавляли 100 мкл раствора пероксидазы хрена (HRP) и инкубировали при 3 °C в течение 30 мин. После еще трех промывок добавляли 100 мкл субстратного реагента и инкубировали в течение 15 минут. Наконец, в каждую лунку добавляли 50 мкл стоп-раствора, а абсорбцию измеряли при 450 нм.

6. Статистический анализ

Категориальные переменные были выражены в виде частот и процентов, в то время как числовые данные были представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения или медианы (минимум-максимум), в зависимости от ситуации. Нормальность числовых переменных оценивалась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Переменные, которые не соответствовали предположению о нормальности, в частности, концентрации факторов роста и уровни кортизола, были проанализированы с помощью непараметрических тестов, включая тест Вилкоксона со знаком для парных сравнений и коэффициент ранговой корреляции Спирмена для ассоциаций. Все статистические анализы были выполнены с помощью программного обеспечения IBM SPSS Statistics. p-значение <0,05 считалось статистически значимым. Все сравнения проводились в пределах испытуемого контроля на межиндивидуальную вариабельность.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все 20 добровольцев (10 женщин и 10 мужчин в возрасте от 18 до 25 лет) завершили исследование без потери выборки. Результаты общего анализа крови подтвердили, что тромбоцитарные и гематологические показатели находились в пределах нормы во всех образцах, что подтверждает надежность препаратов PRF.

Сравнение показателей крови между утренним и вечерним периодом
Уровни кортизола были значительно выше в утренних образцах по сравнению с вечерними (p < 0,001), что отражает физи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основываясь на известной циркадной регуляции активности тромбоцитов и секреции гормонов, первоначально была выдвинута гипотеза, что время сбора крови (утром по сравнению с вечером) может изменять содержание фактора роста PRF. Это исследование было направлено на то, чтобы проверить, существуют ли такие временные вариации, и если да, то коррелируют ли они с уровнем кортизола в сыворотке крови и гематологическими параметрами. Исследование было разработано в качестве пилотного иссле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЦЕНТРИФУЖНАЯ МАШИНАДУЭТ913023410238
Наборы ИФАFine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. IGF-1 (Каталожный номер: EH0165)
Наборы ИФАFine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. PDGF (Каталожный номер: EH3531)
Наборы ИФАFine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. FGFR (Каталожный номер: EH0715)
Наборы ИФАFine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. VEGF (Каталожный номер: EH0327)
Наборы ИФАFine Test, Wuhan FineBiotech Co., Ltd. TGF-β 1(Каталожный номер: EH0287)
Трубки PRFfigure-materials-16370

Ссылки

  1. Dohan, D. M., et al. Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generation platelet concentrate. Part I: Technological concepts and evolution. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 101 (3), e37-e44 (2006).
  2. Ehrenfest, D. M. D., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: From pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27 (3), 158-167 (2009).
  3. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nat Rev Immunol. 13 (3), 190-198 (2013).
  4. Haus, E., Smolensky, M. Biological clocks and shift work: Circadian dysregulation and potential long-term effects. Cancer Causes Control. 17, 489-500 (2006).
  5. Weitzman, E. D., et al. Twenty-four hour pattern of the episodic secretion of cortisol in normal subjects. J Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 14-22 (1971).
  6. Scheer, F. A., et al. The human endogenous circadian system causes greatest platelet activation during the biological morning independent of behaviors. PLoS One. 6 (9), e24549(2011).
  7. Aoto, K., et al. Circadian variation of growth factor levels in platelet-rich plasma. Clin J Sport Med. 24 (6), 509-512 (2014).
  8. Richmond, J. Y., McKinney, R. W. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , US Government Printing Office. (2009).
  9. Hyslop, P. A., Bender, M. H. Methods for sample preparation for direct immunoassay measurement of analytes in tissue homogenates: ELISA assay of amyloid β-peptides. Curr Protoc Neurosci. 18 (1), 7.20.21-7.20.27 (2002).
  10. ELISA sample preparation protocol. , FineTest. (2022).
  11. Karolczak, K., et al. Plasma concentration of cortisol negatively associates with platelet reactivity in older subjects. Int J Mol Sci. 24 (1), 717(2022).
  12. Bass, J., Takahashi, J. S. Circadian integration of metabolism and energetics. Science. 330 (6009), 1349-1354 (2010).
  13. Atkinson, G., Todd, C., Reilly, T., Waterhouse, J. Diurnal variation in cycling performance: Influence of warm-up. J Sports Sci. 23 (3), 321-329 (2005).
  14. Petrovsky, N., Harrison, L. C. The chronobiology of human cytokine production. Int Rev Immunol. 16 (5-6), 635-649 (1998).
  15. Hilderink, J. M., et al. Within-day biological variation and hour-to-hour reference change values for hematological parameters. Clin Chem Lab Med. 55 (7), 1013-1024 (2017).
  16. Xie, Y., et al. FGF/FGFR signaling in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 181(2020).
  17. Farooq, M., Khan, A. W., Kim, M. S., Choi, S. The role of fibroblast growth factor (FGF) signaling in tissue repair and regeneration. Cells. 10 (11), 3242(2021).
  18. Murgo, E., Falco, G., Serviddio, G., Mazzoccoli, G., Colangelo, T. Circadian patterns of growth factor receptor-dependent signaling and implications for carcinogenesis. Cell Commun Signal. 22 (1), 319(2024).
  19. McCarthy, T. L., Centrella, M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-I in skeletal cells. Endocrinology. 126 (3), 1569-1575 (1990).
  20. Dong, J., et al. The proliferative effect of cortisol on bovine endometrial epithelial cells. Reprod Biol Endocrinol. 17, 1-9 (2019).
  21. Moraes, L. A., et al. Ligand-specific glucocorticoid receptor activation in human platelets. Blood. 106 (13), 4167-4175 (2005).
  22. Deutsch, V., et al. Sustained leukocyte count during rising cortisol level. Acta Haematol. 118 (2), 73-76 (2007).
  23. Lightman, S. L., Conway-Campbell, B. L. The crucial role of pulsatile activity of the HPA axis for continuous dynamic equilibration. Nat Rev Neurosci. 11 (10), 710-718 (2010).
  24. Gabbitas, B., Pash, J. M., Delany, A. M., Canalis, E. Cortisol inhibits the synthesis of insulin-like growth factor-binding protein-5 in bone cell cultures by transcriptional mechanisms. J Biol Chem. 271 (15), 9033-9038 (1996).
  25. Gado, M., Baschant, U., Hofbauer, L. C., Bad Henneicke, H. to the bone: The effects of therapeutic glucocorticoids on osteoblasts and osteocytes. Front Endocrinol. 13, 835720(2022).
  26. Raica, M., Cimpean, A. M. Platelet-derived growth factor (PDGF)/PDGF receptors (PDGFR) axis as target for antitumor and antiangiogenic therapy. Pharmaceuticals. 3 (3), 572-599 (2010).
  27. Li, J., Forhead, A., Dauncey, M., Gilmour, R., Fowden, A. Control of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I expression by cortisol in ovine fetal skeletal muscle. J Physiol. 541 (2), 581-589 (2002).
  28. Al-Sharabi, N., et al. Proteomic analysis of mesenchymal stromal cells secretome in comparison to leukocyte- and platelet-rich fibrin. Int J Mol Sci. 24 (17), 13057(2023).
  29. Coucke, B., et al. Leukocyte- and platelet-rich fibrin for enhanced tissue repair: An in vitro study characterizing cellular composition, growth factor kinetics and transcriptomic insights. Mol Biol Rep. 51 (1), 954(2024).
  30. Chtourou, H., Souissi, N. The effect of training at a specific time of day: A review. J Strength Cond Res. 26 (7), 1984-2005 (2012).
  31. Kang, Y. H., et al. Platelet-rich fibrin is a bioscaffold and reservoir of growth factors for tissue regeneration. Tissue Eng Part A. 17 (3-4), 349-359 (2011).
  32. Miron, R. J., et al. Use of platelet-rich fibrin in regenerative dentistry: A systematic review. Clin Oral Investig. 21, 1913-1927 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Время забора кровиприготовление PRFодноэтапное центрифугированиекортизол в сыворотке кровианализ ELISAрегенерация мягких тканейрегенерация твердых тканей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.