Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание и поддержание органоидов рака предстательной железы, полученных от пациента: подробный протокол эксперимента

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68912

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

В этой статье

Краткое содержание

Гетерогенность рака предстательной железы и резистентность к лечению остаются проблемами. Мы описываем протокол генерации органоидов (PDO), полученных от пациента, которые сохраняют ключевые характеристики родительской опухоли. Эта стандартизированная модель поддерживает скрининг лекарств и достижения в области точной медицины.

Аннотация

Рак предстательной железы (РПЖ) является крайне гетерогенным злокачественным новообразованием и ведущей причиной смертности, связанной с раком, у мужчин, со значительными клиническими проблемами в борьбе с резистентностью к лечению и прогрессированием заболевания. Существующие доклинические модели, такие как двумерные (2D) клеточные линии и ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), имеют ограничения в точном повторении сложности РПЖ, включая гетерогенность опухоли, передачу сигналов андрогенных рецепторов (АР) и взаимодействия с микросредой. Чтобы восполнить этот пробел, в данном исследовании представлен надежный и воспроизводимый протокол для создания органоидов, полученных от пациента (PDO), которые сохраняют генетические, фенотипические и гистологические особенности родительских опухолей. Этот метод позволяет культивировать органоиды как из локализованных, так и из продвинутых РПЖ, обеспечивая биологически значимую модель для изучения механизмов заболевания, реакции на лекарства и открытия биомаркеров. Результаты демонстрируют способность протокола генерировать органоиды из различных клинических образцов с применением в высокопроизводительном скрининге лекарств и прецизионной медицине. Предлагая стандартизированный рабочий процесс, который решает ключевые технические проблемы, это исследование подчеркивает важность PDO как универсальных инструментов для продвижения исследований рака предстательной железы и разработки более эффективных терапевтических стратегий.

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) остается одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у мужчин во всем мире, уступая только раку легких по смертности, связанной с раком. Согласно последним эпидемиологическим исследованиям, глобальная заболеваемость РПЖ неуклонно растет, и прогнозируется, что число новых случаев рака предстательной железы ежегодно будет расти с 1,4 миллиона в 2020 году до 2,9 миллиона к 2040году1. Несмотря на достижения в области раннего выявления и разработки новых методов лечения, включая андрогенную депривационную терапию (АДТ) и таргетные препараты, рак предстательной железы остается серьезной клинической проблемой из-за его гетерогенного характера и неизбежного развития резистентности к лечению, особенно на поздних стадиях2. Кастрационно-резистентный рак предстательной железы (КРРПЖ), возникающий после неудачи АДТ, представляет собой летальную форму заболевания, характеризующуюся плохими исходами выживаемости и ограниченными терапевтическими возможностями3. Таким образом, понимание молекулярных механизмов, вызывающих прогрессирование заболевания и резистентность к нему, имеет решающее значение для определения новых терапевтических мишеней и улучшения результатов лечения пациентов.

Разработка доклинических моделей, которые точно имитируют сложность рака предстательной железы человека, имеет решающее значение для продвижения исследований в этой области. Традиционные 2D-клеточные культуры, хотя и широко используются, не в состоянии воспроизвести клеточную гетерогенность, архитектуру опухоли и микроокружение, наблюдаемые in vivo4. В результате, трансляционная полезность этих моделей ограничена, особенно для изучения прогрессии опухоли, лекарственной устойчивости и динамических взаимодействий между раковыми клетками и опухолевыммикроокружением. В противоположность этому, ксенотрансплантаты (PDX) и органоидные культуры стали более сложными инструментами, которые преодолевают разрыв между традиционными клеточными линиями и клиническими опухолями 4,5,6.

Системы органоидных культур произвели революцию в моделировании рака. Эти трехмерные (3D) структуры получены из тканей пациента и могут сохранять гистологические, геномные и фенотипические характеристики исходной опухоли 7,8,9,10. Важно отметить, что органоиды рака предстательной железы сохраняют критические характеристики гетерогенности заболевания, включая передачу сигналов AR, устойчивость к лечению и нестабильность генома, что делает их идеальными инструментами для трансляционныхисследований. По сравнению с моделями PDX, органоиды более экономичны, масштабируемы и поддаются генетическим манипуляциям, что способствует высокопроизводительному скринингу лекарств, открытию биомаркеров и функциональным исследованиям. Органоидные платформы уже показали многообещающие результаты при других злокачественных новообразованиях, включая колоректальный рак, рак молочной железы и поджелудочной железы, подчеркивая их потенциал для персонализированной онкологии.

Тем не менее, создание и поддержание органоидов рака предстательной железы (СПКЯ) представляет собой уникальные технические проблемы. Эпителий предстательной железы по своей природе зависит от андрогенной сигнализации и поддержки внеклеточного матрикса (ВКМ), что требует специализированных условий культивирования. Кроме того, рак предстательной железы демонстрирует широкий спектр клинических свойств, от локализованных гормон-чувствительных опухолей до высокоагрессивных, резистентных к лечению КРРПЖ, что еще больше усложняет развитие воспроизводимых органоидных систем11,12. Успешные протоколы генерации ПКЯ должны учитывать эти биологические сложности за счет оптимизации ключевых этапов, включая обработку тканей, ферментативное расщепление, встраивание ЭКМ и добавки с критическими факторами роста, гормонами и малыми молекулами. Такие протоколы необходимы для обеспечения верности органоидов их родительским опухолям и облегчения их применения в последующих анализах.

В этом исследовании мы представляем подробный и воспроизводимый протокол для создания и долгосрочного обслуживания PDO. Наш рабочий процесс охватывает весь процесс, от получения тканей и обработки биопсийных и хирургических образцов до пассирования органоидов, криоконсервации и реанимации (Рисунок 1). Этот протокол был оптимизирован для сохранения фенотипической и геномной целостности тканей рака предстательной железы, что позволяет создавать надежные 3D-системы культивирования, подходящие для широкого спектра применений, включая геномное профилирование, тестирование реакции на лекарственные препараты и функциональные анализы. Примечательно, что наш метод устраняет распространенные технические препятствия, такие как низкие показатели успеха в культуре органоидов, неоптимальный рост и трудности с последующим проходом, и предоставляет стандартизированные рекомендации, тем самым способствуя воспроизводимости в лабораториях.

Разработка надежных органоидных моделей рака предстательной железы имеет огромное значение как для фундаментальных, так и для трансляционныхисследований. Эти системы представляют собой мощную платформу для расшифровки механизмов заболеваний, выявления новых терапевтических мишеней и совершенствования подходов точной медицины, адаптированных к индивидуальным потребностям пациентов. Устраняя существующие технические пробелы и предоставляя всеобъемлющий протокол, наша работа направлена на ускорение внедрения органоидных технологий в исследования рака предстательной железы и поддержку глобальных усилий по борьбе с этимсложным заболеванием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было рассмотрено и одобрено Комитетом по медицинской этике Народной больницы Уси No 2 (номер одобрения: Y-38 (2023)). Все участники предоставили письменные формы информированного согласия. Данные пациентов прошли деидентификацию для обеспечения защиты конфиденциальности в соответствии с этическими нормами.

1. Забор образцов

  1. Забор тканей
    1. Подготовка перед отбором проб
      1. Критерии включения: Убедитесь, что у всех участников есть подтвержденный диагноз рака предстательной железы, определенный патологоанатомическим или визуализирующим обследованием. Получение образцов опухоли из хирургической резекции, биопсии или других клинических образцов. Убедитесь, что все участники старше 18 лет и не имеют других злокачественных новообразований, чтобы исключить потенциальное вмешательство других видов рака в изучение рака предстательной железы. От всех участников соберите письменное информированное согласие на участие в исследовании и разрешите использовать свои образцы для научных исследований.
      2. Критерии исключения: Исключите пациентов, чьи образцы не содержат достаточного количества опухолевой ткани для бактериологического исследования или анализа. Исключить пациентов, которые отзывают согласие или не могут предоставить требуемые образцы во время исследования.
    2. Образцы пункционной биопсии предстательной железы: используйте специальную иглу для получения образцов из ткани предстательной железы. Немедленно поместите ткань в консервирующий раствор (среда Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) + раствор ингибитора горных пород (разведение 1:2000)) и транспортируйте ее в лабораторию на льду, обеспечив доставку в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное нацеливание на ткани рака предстательной железы и выполнение многосайтового отбора проб в различных анатомических областях. Выполните 1-2 прокола на каждом участке, каждый из которых дает ≥ 1 см образцов керна.
    3. Образцы для радикальной простатэктомии: После сбора быстро поместите образцы в консервационный раствор (среда adDMEM/F-12 + раствор ингибитора породы (разведение 1:2000)) и транспортируйте на льду, обеспечив доставку в лабораторию в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью радикальной простатэктомии можно получить больше фрагментов ткани15.
      Соберите образцы ≥ 1 г (≈ диаметром 5 мм), минимизировав загрязнение нормальными тканями. Перед операцией согласовать с клиницистами следующие данные: 1) ядро опухоли; 2) околоопухолевая ткань; 3) нормальный контроль. Отдавайте предпочтение твердым фрагментам с серо-желтым обесцвечиванием. Если отсутствует, внедрите систематическую случайную выборку. Информация о сборе образцов приведена в таблице 1 .
  2. Обработка образцов
    1. Маркировка и категоризация: Четко маркируйте собранные образцы тканей (включая имя пациента, номер госпитализации, название ткани, участок ткани и тип ткани).
    2. Криоконсервация: Обрабатывайте образцы тканей немедленно (≤ 12 часов после сбора). Поместите образцы в предварительно охлажденный (4 °C) консервационный раствор (среда adDMEM/F-12 + раствор ингибитора горных пород (разбавление 1:2000)) и храните при температуре 4 °C. Продолжайте дальнейшие экспериментальные шаги в течение 4-6 часов для достижения оптимальных результатов.
  3. Транспортировка и хранение
    1. Транспортировка с холодовой цепью: транспортировка образцов тканей в лабораторию при низких температурах.
    2. Регистрация образца: По прибытии в лабораторию подробно проверьте и зарегистрируйте информацию об образце, включая основные личные данные пациента, тип ткани, название и место взятия образца.
  4. Лабораторная приемка и проверка:
    1. Осмотр образцов: Откройте образцы в шкафу биобезопасности и осмотрите их на предмет любых потерь, загрязнения или видимых отклонений.
    2. Вскрытие образца: Извлеките образец и поместите его в чашку для культивирования. С помощью тканевых ножниц или скальпеля разделите образец на небольшие кусочки (примерно 1-3 мм³) для использования в последующих экспериментах.

2. Экспериментальные методики

  1. Приготовление суспензий первичных клеток тканей
    1. Консервация: Поместите собранные блоки тканей в стерильные конические центрифужные пробирки объемом 50 мл, убедившись, что ткани классифицируются по типам. Промаркируйте каждую пробирку соответствующим образом. Добавьте консервационный раствор (среда adDMEM/F-12 + раствор ингибитора породы (разведение 1:2000)) в каждую пробирку до полного погружения ткани. Храните образцы при температуре 4 °C до дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типы тканей должны включать как опухолевые, так и неопухолевые ткани. На этикетках с образцами обычно должен быть указан номер медицинской карты.
    2. Разделение тканей: с помощью стерилизованного пинцета перенесите образцы ткани рака предстательной железы в чашку для культуры среднего размера. Промойте салфетку 2-3 раза 2 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (D-PBS) для удаления крови и мусора. Аккуратно удалите жировую ткань, мышцы и другие неэпителиальные компоненты с помощью пинцета с тонким наконечником, сохранив только эпителиальные области. Впоследствии очищенную ткань измельчить на мелкие фрагменты размером примерно 1-3 мм³ с помощью ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное удаление неэпителиальных компонентов имеет решающее значение для последующих применений, так как загрязнение стромальной или жировой ткани может снизить эффективность и специфичность выделения клеток. Поддерживайте стерильные условия на протяжении всей процедуры, чтобы свести к минимуму риск микробного загрязнения.
    3. Разложение тканей: Переложите подготовленные кусочки ткани в пробирки для обработки тканей. Добавьте раствор для разложения опухолевой ткани (табл. 2) в каждую пробирку. Активируйте устройство для разложения (аппарат для приготовления одноклеточной суспензии) с помощью программы диссоциации тканей средней твердости для ферментативно-механической диссоциации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол разложения следующий: вращение вперед при 200 об/мин в течение 3 с, обратное вращение при 200 об/мин в течение 3 с, вращение вперед при 300 об/мин в течение 4 с, обратное вращение при 300 об/мин в течение 4 с, вращение вперед при 600 об/мин в течение 5 с, обратное вращение при 600 об/мин в течение 5 с, вращение вперед при 400 об/мин в течение 3 с, Обратное вращение при 400 об/мин в течение 3 с. Такая последовательность составляет один цикл, который следует повторить три раза. После завершения первых двух циклов продолжайте медленное вращение со скоростью 20 об/мин в течение примерно 25 минут. Продолжительность может быть скорректирована в зависимости от условий эксперимента. Переваривайте ткани при температуре 37 °C в течение от 40 минут до 1 часа.
    4. Прекращение пищеварения: Добавьте равный или двойной объем среды adDMEM/F-12 с добавлением FBS в клеточную суспензию для прекращения ферментативной активности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если остался непереваренный осадок, соберите надосадочную жидкость, добавьте к остатку свежие пищеварительные ферменты и продолжайте сбраживание при температуре 37 °C еще 15-20 минут. Периодически контролируйте процесс и комбинируйте клеточные суспензии с обоих этапов пищеварения.
    5. Фильтрация: Предварительно смочите клеточный фильтр 100 мкм 1 мл среды adDMEM/F-12, затем отфильтруйте клеточную суспензию. Дважды промойте пробирку для обработки тканей и сетчатое фильтр 5 мл среды adDMEM/F-12 с добавлением раствора ингибитора горных пород (разведение 1:2000). Соберите фильтрат в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Пропустите суспензию через ситечко 70 мкм и соберите все клеточные суспензии в новую пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ступеней фильтрации и размер пор сетчатых фильтров могут быть отрегулированы в соответствии с характеристиками образца.
    6. Лизис эритроцитов:Центрифугируйте собранную клеточную суспензию при 200 × г в течение 5 мин при 25 °C. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Выдержать суспензию на льду в течение 2-3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для лизиса эритроцитов может быть скорректировано в зависимости от эффективности лизиса. Длительная инкубация может привести к усилению гибели клеток. Рекомендуется контролировать образец под микроскопом, чтобы обеспечить полный лизис эритроцитов без чрезмерного повреждения других типов клеток.
    7. Прекратить лизис: Добавьте в клеточную суспензию 6 мл среды adDMEM/F-12 с добавлением раствора ингибитора горных пород (разведение 1:2000). Переложите смесь в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 200 x g в течение 5 минут при 25 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте клеточную гранулу 1-2 раза той же добавкой и переложите конечную клеточную суспензию в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл.
    8. Оценка жизнеспособности: Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с равным объемом раствора трипанового синего и наблюдайте за жизнеспособностью клеток под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается значительное количество мертвых клеток или мусора, выполните низкоскоростное центрифугирование при 50 x g в течение 5 минут при 25 °C для их удаления, прежде чем приступать к подсчету.
    9. Подсчет клеток:Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл среды adDMEM/F-12, разбавьте суспензию по мере необходимости (обычно в соотношении 1:20) и поместите 6 мкл разведенной суспензии на гемоцитометр для подсчета клеток под микроскопом.
    10. Сбор клеточных гранул: центрифуга при 200 x g, 25 °C, в течение 5 минут. Соберите окончательную клеточную гранулу в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл.

3. Образование органоидов из первичных клеточных суспензий

  1. Посев: Определите необходимый объем матричного геля на основе количества клеток. С помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток (хранящихся при температуре -20 °C) осторожно перенесите соответствующий объем матричного геля на клеточную гранулу. Аккуратно перемешивайте клеточно-гелевую смесь на льду, не допуская образования пузырьков воздуха, чтобы обеспечить равномерный посев и оптимальную целостность геля матрицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте матричный гель при 4 °C в течение ночи перед использованием. Убедитесь, что все инструменты для работы, включая наконечники для пипеток и трубки, предварительно охлаждены, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.
  2. Покрытие: Нанесите смесь геля «клетка-матрица» на 24-луночный культуральный планшет с низкой адгезией, нанося примерно 30 мкл на каплю. Убедитесь, что каждая капля содержит более 10 000 ячеек для эффективного формирования трехмерной (3D) структуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного разбавления матричного геля. Для сохранения структурной целостности и поддержки формирования 3D-культуры матричный гель должен составлять более 70% от общего объема смеси. Органоиды, полученные из образцов биопсии человека и простатэктомии, эквивалентны по своей природе, в первую очередь различаясь по выходу жизнеспособных клеток, и в этом протоколе применялись идентичные плотности посева.
  3. Инкубация: Поместите культуральную тарелку во увлажненный инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 на 5 минут, дав матричному гелю предварительно затвердеть. Переверните пластину и оставьте на 20 минут, чтобы матричный гель сохранился в 3D-форме. Добавьте в каждую лунку по 800-1000 мкл питательной среды (табл. 3). Заменяйте питательную среду каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что матричный гель не нарушается во время этапа инверсии, чтобы сохранить 3D-структуру.

4. Пассирование органоидов

  1. Сбор и подготовка органоидов: С помощью предварительно охлажденного наконечника пипетки механически разрушайте матричный гель, чтобы фрагментировать органоидные кластеры. Промыть каждую лунку 1-2 раза средой adDMEM/F-12 + раствором ингибитора горных пород (разведение 1:2000). Переложите фрагментированные кластеры вместе с питательной средой в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 25 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда органоиды достигают диаметра 100 мкм (обычно на 14-й день культивирования). Если чрезмерный объем среды препятствует механическому разрушению, отсасывайте часть среды перед разрушением кластеров. Для получения остаточного матричного геля, который прилипает к поверхности пластины, аккуратно соскребите наконечником пипетки и промойте 2-3 раза средой adDMEM/F-12 + раствором ингибитора горных пород (разведение 1:2000). Все полоскания должны быть объединены с первоначальным сбором для достижения максимального выхода.
  2. Диссоциация органоидов: Ресуспендировать полученную гранулу в 2 мл предварительно подогретого раствора рекомбинантного трипсиноподобного фермента. Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы инициировать диссоциацию, затем инкубируйте при 37 °C в течение 15-30 минут. Контролируйте диссоциацию под микроскопом каждые 5 минут до тех пор, пока мелкие кластеры клеток (примерно 5-6 клеток на кластер) не будут доминировать в поле, затем переходите к следующему этапу.
    Примечание: Своевременное прекращение пищеварения имеет решающее значение для предотвращения чрезмерной диссоциации и сохранения жизнеспособности клеток. Частое микроскопическое наблюдение гарантирует, что пищеварение будет остановлено в оптимальное время для формирования кластеров.
  3. Прекращение пищеварения: Завершите пищеварение, добавив равный или двойной объем среды adDMEM/F-12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) для подавления ферментативной активности. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при 25 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Удаление матричного геля: Ресуспендируйте гранулу в 2 мл раствора для восстановления клеток и инкубируйте при 4 °C в течение 20-40 минут для растворения остаточного матричного геля. Центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и дважды повторите промывку со средой adDMEM/F-12 для удаления остаточных компонентов матрицы. Переложите готовую гранулу в стерильную пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл для дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкотемпературная инкубация имеет решающее значение для эффективной деполимеризации матричного геля с сохранением целостности клеток. Сведите к минимуму время пребывания вне холодной среды, чтобы предотвратить преждевременное повторное гелеобразование.
  5. Посев и культивирование: Продолжайте засеивать диссоциированные органоидные кластеры, следуя процедурам, описанным в шагах 3.1-3.3. Обеспечьте надлежащую плотность клеток и соотношение матричного геля для оптимального преобразования 3D-структуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы криоконсервации органоидов, размораживания, повторного встраивания и гистологической обработки предоставляются по запросу.

5. Криоконсервация органоидов

  1. Сбор органоидов: Извлеките культуральную пластину из инкубатора и механически диссоциируйте агрегаты органоидных гидрогелей с помощью предварительно охлажденного наконечника для пипетки. Переложите диссоциированные агрегаты вместе с питательной средой в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Промыть лунки 2-3 раза средой adDMEM/F-12, соединяя смывки с первичной суспензией. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 25 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить максимальный выход, осторожно разрушайте органоидные агрегаты, не вызывая чрезмерного повреждения. Все промывки следует совмещать с первичным сбором, чтобы уменьшить потери органоидов в процессе сбора.
  2. Ферментативная диссоциация: Добавьте 2-4 мл предварительно подогретого раствора рекомбинантного трипсиноподобного фермента в органоидную гранулу в конической пробирке и аккуратно перемешайте суспензию. Выдерживать суспензию при температуре 37 °C в течение 15-20 мин. Контролируйте процесс диссоциации под микроскопом каждые 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости осторожно пипетируйте пипетку, чтобы помочь разбить большие кластеры на более мелкие агрегаты (примерно 5-6 клеток на кластер). Для криоконсервации требуется более короткое время пищеварения, чтобы предотвратить чрезмерную диссоциацию и потерю жизнеспособности клеток. Частое наблюдение гарантирует, что пищеварение будет завершено на соответствующей стадии для сохранения целостности органоидов.
  3. Прекращение пищеварения: Добавьте равный или больший объем среды adDMEM/F-12, добавленной FBS, чтобы остановить ферментативную активность. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранула не содержит остаточного матричного геля, перейдите к шагу 5.5 для криоконсервации. Если загрязнение матричным гелем сохраняется, перейдите к шагу 5.4.
  4. Удаление матричного геля (по желанию): Следуйте процедуре, описанной в шаге 4.4, чтобы удалить матричный гель. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл раствора для восстановления клеток и инкубируйте при 4 °C в течение 20-40 минут. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 минут при 4°C, выбросьте надосадочную жидкость и повторите процесс промывки 1-2 раза, чтобы обеспечить полное удаление геля из матрицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление остаточного матричного геля имеет решающее значение для обеспечения криоконсервации только диссоциированных клеток. Неполное удаление геля может повлиять на жизнеспособность и структурную целостность органоидов после размораживания.
  5. Криоконсервация: Ресуспендирование клеточной гранулы в 1,5 мл органоидной замораживающей среды с помощью щадящего пипетирования для обеспечения равномерной суспензии. Перенесите суспензию в криовиальную камеру и храните при температуре -80 °C для кратковременной консервации. Через 24 ч переложите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда для криоконсервации тщательно перемешана с клетками, чтобы предотвратить неравномерное замораживание, которое может привести к повреждению клеток. Флаконы следует переводить в жидкий азот сразу после кратковременного хранения, чтобы обеспечить долгосрочную сохранность и предотвратить деградацию клеток.

6. Восстановление органоидов

  1. Размораживание криоконсервированных органоидов: Удалите криовиалы, содержащие органоиды, из хранилища с жидким азотом или температурой -80 °C. Немедленно погрузите флакон в водяную баню при температуре 37 °C и осторожно помешивайте до полного размораживания содержимого. Как только размораживание будет завершено, перенесите органоидную суспензию в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл с помощью предварительно охлажденного (-20 °C) наконечника для дозатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрое и равномерное размораживание имеет решающее значение для минимизации криоиндуцированного повреждения клеток. Используйте предварительно охлажденные наконечники для пипеток, чтобы предотвратить преждевременное нагревание и формирование геля матрицы во время переноса.
  2. Удаление криопротектора: Осторожно добавьте 1-2 мл среды adDMEM/F-12 вдоль стенки конической пробирки, чтобы постепенно разбавить криопротектор. Аккуратно перемешайте путем инверсии. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте энергичного пипетирования или вортексинга на этой стадии, так как внезапные осмотические сдвиги и механическое воздействие могут поставить под угрозу жизнеспособность органоидов. Подход медленного разведения сводит к минимуму клеточный шок.
  3. Промывка и восстановление: Добавьте 1 мл свежей среды adDMEM/F-12 в гранулы. Аккуратно суспендируйте клетки с помощью предварительно охлажденного (-20 °C) наконечника пипетки, чтобы предотвратить преждевременную адгезию геля к матриксу. Переложите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание низкой температуры во время стирки необходимо для предотвращения термической повторной сборки компонентов геля матрицы, которая может препятствовать последующему преобразованию органоидов.
  4. Сбор: Центрифугировать при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C и удалить надосадочную жидкость. Повторите этап промывки 2-3 раза, чтобы обеспечить полное удаление остатков криопротектора и загрязнений.
  5. Посев и культура: Ресуспендирование конечного клеточного гранулы в органоидной питательной среде, приготовленной в соответствии с экспериментальными потребностями. Приступайте к посеву в соответствии с протоколом, описанным в шагах 3.1-3.3, обеспечивая надлежащую пропорцию геля в матрице и плотность клеток для поддержки восстановления 3D-структуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность и восстановление клеток после размораживания в значительной степени зависят от бережного обращения, надлежащего разведения криопротекторов и немедленного восстановления благоприятной среды из 3D-матричного геля.

7. Предварительная обработка анализа для определения характеристик органоидов

  1. Сбор органоидов: Механическая диссоциация агрегатов, когда диаметр органоидов достигает 70-100 мкм, и перенос их в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую среду, для последующего культивирования. Промойте лунки 2-3 раза средой adDMEM/F-12 и соедините смывки с органоидной суспензией. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 25 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших сборов (например, 1-2 лунки) используйте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, чтобы обеспечить эффективную работу и уменьшить потери пробы. Будьте осторожны, чтобы не нарушить органоидные структуры во время диссоциации.
  2. Ресуспензия: Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл среды adDMEM/F-12 и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 минут при 25°C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гранула тщательно ресуспендирована перед центрифугированием, чтобы предотвратить образование комков и обеспечить равномерную обработку на последующих этапах.
  3. Промывка и фиксация: Добавьте 1 мл D-PBS в гранулу и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования или инверсии. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 минут при 25 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторите этап промывки 1-2 раза. Зафиксируйте гранулу с 1-2 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно выполняйте процедуры мойки, чтобы обеспечить тщательное удаление остатков среды и других загрязнений. Фиксация в параформальдегиде имеет решающее значение для сохранения морфологии органоидов для последующего анализа.
  4. Промывка после фиксации: Центрифугируйте образцы при температуре 200 × г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте зафиксированные образцы 2-3 раза с помощью D-PBS, осторожно перемешивая щелчками пальцев или осторожной инверсией, чтобы обеспечить правильное распределение буфера промывки и предотвратить потерю органоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надлежащая промывка после фиксации необходима для удаления избытка параформальдегида и уменьшения фонового окрашивания при последующих применениях, таких как иммуногистохимия.
  5. Повторная фиксация этанола: Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 70% этанола, осторожно перемешайте пальцами и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Центрифугируйте при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация этанола на этом этапе помогает сохранить целостность органоидов и подготовить образцы к встраиванию или дальнейшей обработке. Обеспечьте равномерную суспензию в этаноле, чтобы избежать неравномерной фиксации.
  6. Очистка матричного геля (необязательно): Если в грануле остались остатки матричного геля, следуйте протоколу, описанному в шаге 4.4, чтобы удалить его. Этот этап включает в себя повторную суспендию гранулы в растворе для восстановления клеток и инкубацию при 4 °C в течение 20-40 минут, за которой следует центрифугирование и многократная промывка для обеспечения полного удаления геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление матриксного геля особенно важно для последующего гистологического анализа или визуализации, так как остаточный гель может мешать срезу и анализу тканей.
  7. Заделка агарозы: Приготовьте около 6 мл 2% агарозы путем плавления при 96 °C во время фиксации органоидного этанола. Смешайте 100 μл расплавленной агарозы с органоидной гранулой, обеспечивая минимальное образование пузырьков воздуха. Переложите смесь в форму, затвердейте при 4°C, затем обработайте для заделки парафина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно подогрейте наконечники пипеток (с обрезанными концами) для предотвращения засорения. Заделка из агарозы способствует сохранению органоидной структуры, обеспечивая при этом простоту обработки и разрезания. Избегайте образования пузырьков во время смешивания, чтобы обеспечить равномерное заделывание и оптимальное сечение тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Морфологические и динамические особенности роста органоидов рака предстательной железы у пациентов
Органоиды рака предстательной железы, полученные от пациента, были успешно установлены из свежих опухолевых тканей, собранных во время клинических процедур. Первоначальное образование органоидов обычно наблюдалось в течение 5-7 дней после культивирования (Рисунок 2). При светлопольной микроскопии органоиды демонстрировали отчетливые морфолог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Создание PDO для PCa представляет собой критический шаг вперед в доклиническом моделировании, предлагая значительные преимущества по сравнению с традиционными 2D-культурами клеток и PDX16. Метод, представленный в этом исследовании, позволяет получить органоиды, которые точно повторяют гистологические, генетические и фенотипические характеристики исходной опухоли. Сохраняя гетерогенность опухоли, включая передачу сигналов AR и клеточную архитектуру, органоиды обесп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы выражают благодарность за поддержку Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 82172831) и ключевому исследовательскому проекту Комиссии по здравоохранению и планированию семьи провинции Цзянсу (грант No X20240121).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Кабинет биобезопасностиJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Решение для восстановления клетокКорнинг354253
центрифугаШэньчжэнь Руйводе Лайф Технотехническая Компания, ОООM1416R
Центрифугные трубкиNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex Reduced Growth Factor BME, тип 2R& D3533-005-02
Контейнеры для культуры (пластины с низкой адгезией на 24 лунки)термоNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Электронный балансNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Сыворотка плода для быкаGibco10099141
Glutamine Plus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
Увлажнённый инкубатор клеточных культур (37°; C, 5% CO2)Шанхайская компания Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
Ледяной ящикNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Блюда среднего размера культурыАбсинabs7005
Медиа-приложение N21-MAX (50 раз)R& DAR008
N-ацетилцистеинSigmaA9165-5G
НикотинамидR& D3533-010-02
НормоцинInvivogenANT-NR-2
Пипет-эйд пипетное устройствоNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
ПипеткиNanjing Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
ПримоцинInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Аппарат для подготовки подвески с одной ячейкойЗадний приводDSC-400
Тканевые ножницы/скальпельNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Набор для диссоциации опухоли, человекMiltenyi Biotec130-095-929
пинцетNanjing iResearch Biotechnology Co., Ltd
Водяная баняЧанчжоуская Чжунцзе Экспериментальная Инструментальная Производственная Компания, LtdHH-600
Y-27632 дигидрохлоридR& D1254/10

Ссылки

  1. James, N. D., et al. The lancet commission on prostate cancer: planning for the surge in cases. Lancet. 403 (10437), 1683-1722 (2024).
  2. Knutson, T. P., et al. AR alterations inform circulating tumor DNA detection in metastatic castration resistant prostate cancer patients. Nat Commun. 15 (1), 10648(2024).
  3. Haffner, M. C., et al. Framework for the pathology workup of metastatic castration-resistant prostate cancer biopsies. Clin Cancer Res. 31 (3), 466-478 (2025).
  4. Fang, Z., Li, P., Du, F., Shang, L., Li, L. The role of organoids in cancer research. Exp Hematol Oncol. 12 (1), 69(2023).
  5. Sachs, N., Clevers, H. Organoid cultures for the analysis of cancer phenotypes. Curr Opin Genet Dev. 24, 68-73 (2014).
  6. Zhou, L., Zhang, C., Zhang, Y., Shi, C. Application of organoid models in prostate cancer research. Front Oncol. 11, 736431(2021).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  8. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
  9. Puca, L., et al. Patient-derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nat Commun. 9 (1), 2404(2018).
  10. Pamarthy, S., Sabaawy, H. E. Patient-derived organoids in prostate cancer: improving therapeutic efficacy in precision medicine. Mol Cancer. 20 (1), 125(2021).
  11. Karkampouna, S., et al. Patient-derived xenografts and organoids model therapy response in prostate cancer. Nat Commun. 12 (1), 1117(2021).
  12. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nat Protoc. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  13. Neal, J. T., Kuo, C. J. Organoids as models for neoplastic transformation. Annu Rev Pathol. 11, 199-220 (2016).
  14. Waseem, M., Wang, B. D. Organoids: an emerging precision medicine model for prostate cancer research. Int J Mol Sci. 25 (2), (2024).
  15. Moschovas, M. C., Patel, V. Neurovascular bundle preservation in robotic-assisted radical prostatectomy: how I do it after 15,000 cases. Int Braz J Urol. 48 (2), 212-219 (2022).
  16. Li, Y., Qin, M., Liu, N., Zhang, C. Organoid development and applications in gynecological cancers: the new stage of tumor treatment. J Nanobiotechnology. 23 (1), 20(2025).
  17. Xiang, D., et al. Building consensus on the application of organoid-based drug sensitivity testing in cancer precision medicine and drug development. Theranostics. 14 (8), 3300-3316 (2024).
  18. Van Hemelryk, A., et al. Patient-derived xenografts and organoids recapitulate castration-resistant prostate cancer with sustained androgen receptor signaling. Cells. 11 (22), 3632(2022).
  19. Zhao, H., et al. Patient-derived bladder cancer organoids as a valuable tool for understanding tumor biology and developing personalized treatment. Adv Sci (Weinh). 12 (13), e2414558(2025).
  20. Polak, R., Zhang, E. T., Kuo, C. J. Cancer organoids 2.0: modelling the complexity of the tumour immune microenvironment. Nat Rev Cancer. 24 (8), 523-539 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Органоидыполученные из клеток пациентакультивирование органоидовпереваривание опухолевой тканиимплантация в матриковый гельподдержание жизнеспособности органоидовскрининг лекарственных препаратовперсонализированная медицинаэкспрессия андрогенных рецепторовпоиск биомаркеров
Создание и поддержание органоидов рака предстательной железы, полученных от пациента: подробный протокол эксперимента
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.