Методическая статья

Обнаружение поведения, склонного к аггрегации, у мутантных клетках рака молочной железы P53 V157F с помощью многоточечной флуоресценции тиофлавина

DOI:

10.3791/68921

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки рака молочной железы Hs578T, содержащие мутацию p53 V157F, демонстрируют значительно более высокую флуоресценцию тиофлавина T по сравнению с клетками MCF7, что указывает на усиленную агрегацию белков. Многоточечные флуоресцентные измерения повышают точность и надёжность обнаружения в выявлении агрегатов, богатых β листов, подчёркивая важность агрегационных мутаций p53 в исследованиях рака и разработке терапевтических стратегий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Супрессор опухолей p53, кодируемый геном TP53 , играет центральную роль в поддержании геномной стабильности. Мутации TP53 , особенно варианты горячих точек, встречаются примерно в 50% человеческих видов рака и могут привести к потере опухолоподавляющих функций или приобретению свойств усиления функции, включая агрегацию в прионоподобные структуры.

В этом исследовании мы оценили тенденцию агрегации мутации p53 V157F в клетках рака молочной железы Hs578T по сравнению с клетками MCF7, экспрессирующими дикий тип p53. Агрегация белков оценивалась с помощью окрашивания тиофлавина T (ThT), а затем квантифицированной флуоресценцией в 96-луночных пластинчатых анализах. Клетки окрашивались раствором ThT/Hoechst, промывались и анализировались с помощью считывателя микропластин в соответствии с определёнными параметрами возбуждения/излучения. Количественный анализ с использованием как одиночных, так и четырёхточечных флуоресцентных показаний показал, что клетки Hs578T-клетки демонстрировали 3,20–4,26-кратное увеличение интенсивности флуоресценции ThT по сравнению с MCF7, что указывает на значительно повышенный уровень β-листовых или амилоид-подобных агрегатов. Многоточечные измерения подтвердили широкое и стабильное присутствие белковых агрегатов на поверхности скважины. Эти результаты подтверждают использование многоточечного показания пластин для точного обнаружения агрегации белков в клеточных анализах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ген TP53, который кодирует белок супрессора опухолей p53, мутирует примерно в 50% человеческих видов рака 1,2. Такие мутации не только устраняют опухолоподавляющие функции p53, но и в некоторых вариантах горячих точек способствуют образованию прионоподобныхагрегатов 3,4. Эти агрегированные формы мутантного p53 часто приобретают свойства усиления функции, включая повышение устойчивости к противораковымтерапиям 5,6. Поэтому определение мутаций горячих точек p53 склонных к агрегации крайне важно для разработки эффективных стратегий лечения рака с мутацией p53 7,8.

В наших предыдущих исследованиях мы наблюдали, что специфические мутации p53 в плоскоклетной карциноме головы и шеи (HNSCC) и линиях рака молочной железы демонстрируют сильные сигналы окрашивания тиофлавина T (ThT), указывающие на наличие агрегированных белков. ThT — это бензотиазольный краситель, который специфически связывается с β-слоевыми амилоидными структурами, обеспечивая усиленную флуоресценцию присвязывании 9. Например, клеточная линия Detroit 562 HNSCC, несущая мутацию p53 R175H, демонстрировала сильные сигналы флуоресценцииThT 10. Аналогично, две другие линии клеток HNSCC, TW01 и HONE-1, обе с мутацией p53 R280T, также показали выраженное окрашиваниеThT 11. В этих случаях сигналы ThT колокализованы с p53, что подтверждает наличие агрегированного p5310,11.

В клетках рака молочной железы MDA-MB-231 (мутация p53 R280K) и T47D (мутация p53 L194F) также демонстрировали сильное окрашивание ThT с чёткой ко-локализацией p53/ThT 12. В отличие от этого, клетки MCF7, экспрессирующие дикий тип p53, и клетки MDA-MB-468 (мутация p53 R273H), обе демонстрировали лишь слабые сигналыThT 12. Аналогично, клетки OECM-1 HNSCC с мутацией p53 V173L демонстрировали низкий уровень окрашиванияThT 10.

По сравнению с другими методами обнаружения агрегации белков — такими как фильтрующие ловушки, трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) или иммунокрашивание с агрегированно-специфическими антителами — анализ флуоресценции ThT предлагает ряд преимуществ. Он неразрушителен, быстрый и применим как к живым, так и к фиксированным клеткам без обширной обработки. Хотя фильтрующие тесты эффективно захватывают нерастворимые заполнители, они требуют жёсткой денатурации и непригодны для использования в живыхклетках 13. TEM обеспечивает прямую визуализацию морфологии фибрилл, но является трудоёмким инизкопроизводительным 14. Агрегированно-специфическое иммунокрашивание позволяет выявлять на месте с помощью конформно-зависимых антител, хотя доступность и специфичность антител могутограничивать 15. В отличие от этого, флуоресценция ThT — особенно в сочетании с многоточечным показанием пластин — предлагает простой, количественный и пространственно надёжный подход к обнаружению β-слоевых или амилоидных структур.

Практические соображения также имеют ключевое значение для воспроизводимости. Флуоресценция ThT линейно коррелирует с концентрацией амилоида в широком диапазоне концентраций (0,2–500 мкм), а пиковый сигнал обычно достигается при 20-50 мкм, в зависимости от белка — хотя самофлуоресценция ThT может возникать при ≥5 мкм, а более высокие концентрации могут влиять на кинетику агрегации16. Поэтому рабочая концентрация ThT обычно рекомендуется около 10-20 мкм для баланса чувствительности при минимизации потенциального влияния на процессы агрегации16. В нашем протоколе запас 1 000x ThT (12 мМ) разбавляется в пропорции 1:1 000, чтобы получить рабочую концентрацию примерно 12. μM, что попадает в рекомендуемый диапазон.

ThT преимущественно связывается с β-слоевыми амилоидными структурами, характерными для амилоидных фибрилл. Эта специфичность возникает из-за взаимодействия красителя с архитектурой перекрёстного β амилоидных фибрилл, где поверхности, образованные β-цепями, служат сайтами связывания для ThT. Следовательно, ThT может не обнаруживать эффективно другие неправильно свернутые или неамилоидные агрегаты, которые не проявляют такую β-слойнуюструктуру 17. Поэтому, хотя ThT является ценным инструментом для идентификации амилоидных фибрилл, рекомендуется использовать методы дополнительной валидации — такие как ко-локализация с p53 иммунофлуоресценцией или биофизические методы — для подтверждения идентичности и специфичности обнаруженныхагрегатов 10,18.

Структурные исследования прогнозирования показывают, что мутация p53 V157F принимает конформацию, более склонную к агрегации, чем белок дикоготипа 19. В этом исследовании мы сравнивали сигналы флуоресценции ThT между клетками рака молочной железы Hs578T, которые содержат мутацию p53 V157F, склонную к агрегации, и клетками рака молочной железы MCF7, экспрессирующими дикий тип p53. Используя многоточечный тест окрашивания с считывателем пластин, мы стремились оценить склонность агрегации p53 V157F относительно дикого типа p53.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Посев ячеек

  1. Для оценки жизнеспособности клетки смешайте 10 мкл Trypan Blue с 10 мкл ресуспензированных клеток в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS) в микроцентрифуге и тщательно перемешайте.
  2. Загрузите 10 мкл смеси на счётчик, затем посчитайте живые ячейки с помощью автоматического счётчика.
  3. Исходя из подсчёта жизнеспособности, посейте 30 000 жизнеспособных клеток на скважину в 96-колодную культивационную пластину, при этом один колодец обозначен как неокрашенный контрольный, а оставшиеся три — для окрашивания.

2. Инкубация

  1. Поместите посевную пластину в инкубатор сCO2 и инкубуйте 12 часов при 37 °C.

3. Подготовка свежего морильного материала ThT (1000x)

  1. Весите 0,02 г (20 мг) порошка ThT и растворите его в 5,0 мл деионизированной воды. Тщательно перемешайте, пока порошок полностью не растворится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта подготовка даёт раствор с содержанием 1000x ThT с конечной концентрацией 4 мг/мл, что эквивалентно 12,5 мМ (ThT имеет молекулярную массу ~318,85 г/моль). Раствор 4 мг/мл эквивалент 4 г/л. Разделив 4 г/л на 318,85 г/моль, получается 0,0125 моль/л, или ~12,5 мМ).

4. Подготовка буфера для окрашивания ThT с ядерным контрокрашиванием

  1. Подготовьте раствор для окрашивания, добавив следующий раствор в 1 мл 1x DPBS и аккуратно перемешайте для обеспечения однородности.
    1. Добавьте 1 мкл свежеприготовленного бульона 1 000x ThT, что даёт итоговую концентрацию ThT 12,5 мкм (1x).
    2. Добавьте 1 мкл 1 мг/мл наложного раствора Hoechst 33342, получив итоговую концентрацию ~1 мкг/мл (=1,6 мкм).

5. Окрашивание пятен

  1. Удалите посевную среду из каждого колодца. Добавьте 100 мкл подготовленного буфера для окрашивания ThT/Hoechst в каждую окраску. Добавьте 100 мкл 1x DPBS к неокрашенной контролю.

6. Инкубация

  1. Поставьте тарелку в тёмное место при комнатной температуре (25 °C) на 30 минут.

7. Стирка

  1. Аккуратно аспирируйте или сбрасывайте раствор для окрашивания из каждой колодцы, стараясь не нарушить монослой клетки.
  2. Добавьте 100 мкл по 1× DPBS в каждую скважину и позвольте дополнительно мягко замачивать 30 секунд.
  3. Аккуратно аспирируйте или сбросьте раствор DPBS.
  4. Повторите промывку, добавив 100 мкл свежего 1x DPBS в каждую скважину, снова позволяя сделать 30-секундное мягкое замачивание, затем сбросьте раствор для промывки DPBS.
  5. После второй промывки добавьте 100 мкл свежего 1x DPBS в каждую скважину.

8. Измерение флуоресценции

  1. Перед чтением сигнала флуоресценции снимите крышку с пластины с 96 ямы. Измеряйте флуоресценцию одним из двух методов: одноточечным или четырёхточковым.
  2. Поместите 96-ядровую пластину в считыватель микропластин и измерите флуоресценцию по следующим параметрам: ThT-флуоресценция: возбуждение на 450 нм, излучение на 490 нм; Hoechst 33342 флуоресценция: возбуждение на 360 нм, излучение на 460 нм; Настройки чтения: Дрожь: 5 секунд до чтения; Инструкция чтения: Верхняя страница; Время интеграции: 140 мс; Высота считывания: 1,00 мм; Точки на well: 1 (конечная точка) или 4 (хорошо сканировано); Настройка сканирования скважины: (Настройка плотности: 2; Интервал между точками: 2.5).

9. Анализ данных

  1. Вычислим агрегацию белков следующим образом:
    figure-protocol-1
  2. Нормализуйте интенсивность флуоресценции ThT, установив соотношение в клетках MCF7 как 1 (базовый контроль).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения наличия белковых агрегатов, богатых β слоями, в клетках рака молочной железы линии клеток MCF7 и Hs578T подвергались окрашиванию ThT с последующим количественным оценкой флуоресценции. Как показано на рисунке 1, ячейки были засеяны в четыре колодца пластины с 96 лунками, одна из которых была обозначена как неокрашённая контрольная. Оставшиеся три скважины были окрашены ThT согласно стандартному протоколу. Флуоресценция измерялась с помощью двух ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При посеве ячеек в пластины с 96 колодцями часто сложно добиться равномерного распределения по поверхности колодца, так как аккуратное встряхивание или постукивание по пластине для распространения клеток не всегда возможно. Такое неравномерное распределение может привести к изменчивости интенсивности сигнала по всей яме. Многоточечное флуоресцентное измерение выявило значительные вариации между разными регионами в одной и той же яме, что подчёркивает это смещение и вероятность вводящих в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы с благодарностью выражают признательность за техническую помощь, оказанную Базовой медицинской основной лабораторией Медицинского колледжа Университета И-Шоу. Эта работа была поддержана грантами от больницы E-DA [EDAHJ114001 до C.-C.C.] и Национального совета по науке и технологиям Тайваня [NSTC 112-2813-C-214-032-B до B.-H. C]

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-колодцевая культурная плитаПростоPC396-0100
Скользящий слайдИнвитрогенC10228
Countess II FL Автоматический счётчик ячеекThermo Fisher Scientific AMQAF1000
dPBSПростоCC704-0500
Трубка ЭппендорфаПростоPC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Молекулярные устройства735-0391 
Тиофлавин ТСигма-ОлдричT3516
Trypan BlueИнвитрогенT10282

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Binayke, A., Mishra, S., Suman, P., Das, S., Chander, H. Awakening the "guardian of genome": Reactivation of mutant p53. Cancer Chemother Pharmacol. 83 (1), 1-15 (2019).
  2. Chen, C. C., et al. A simple and affordable method to create nonsense mutation clones of p53 for studying the premature termination codon readthrough activity of ptc124. Biomedicines. 11 (5), 1310(2023).
  3. Rangel, L. P., Costa, D. C., Vieira, T. C., Silva, J. L. The aggregation of mutant p53 produces prion-like properties in cancer. Prion. 8 (1), 75-84 (2014).
  4. Kim, S., An, S. S. Role of p53 isoforms and aggregations in cancer. Medicine (Baltimore). 95 (26), e3993(2016).
  5. Zhou, G., et al. Gain-of-function mutant p53 promotes cell growth and cancer cell metabolism via inhibition of ampk activation. Mol Cell. 54 (6), 960-974 (2014).
  6. Zhang, C., et al. Gain-of-function mutant p53 in cancer progression and therapy. J Mol Cell Biol. 12 (9), 674-687 (2020).
  7. De Oliveira, G. aP., et al. The status of p53 oligomeric and aggregation states in cancer. Biomolecules. 10 (4), 548(2020).
  8. Wang, H., Guo, M., Wei, H., Chen, Y. Targeting p53 pathways: Mechanisms, structures, and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 92(2023).
  9. Sulatskaya, A. I., Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. Interaction of thioflavin t with amyloid fibrils: Stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys Chem B. 115 (39), 11519-11524 (2011).
  10. Cai, B. H., et al. Nampt inhibitor and p73 activator represses p53 r175h mutated HNSCC cell proliferation in a synergistic manner. Biomolecules. 12 (3), 438(2022).
  11. Cai, B. H., et al. Chlorophyllides repress gain-of-function p53 mutated hnscc cell proliferation via activation of p73 and repression of p53 aggregation in vitro and in vivo. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (3), 167662(2025).
  12. Wu, K. -Y., et al. Synergistic anticancer activity of hsp70 inhibitor and doxorubicin in gain-of-function mutated p53 breast cancer cells. Biomedicines. 13 (5), 1034(2025).
  13. Nasir, I., Linse, S., Cabaleiro-Lago, C. Fluorescent filter-trap assay for amyloid fibril formation kinetics in complex solutions. ACS Chem Neurosci. 6 (8), 1436-1444 (2015).
  14. Goldsbury, C., et al. Amyloid structure and assembly: Insights from scanning transmission electron microscopy. J Struct Biol. 173 (1), 1-13 (2011).
  15. Kayed, R., et al. Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Mol Neurodegener. 2, 18(2007).
  16. Xue, C., Lin, T. Y., Chang, D., Guo, Z. Thioflavin t as an amyloid dye: Fibril quantification, optimal concentration and effect on aggregation. R Soc Open Sci. 4 (1), 160696(2017).
  17. Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of thioflavin-t binding to amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 1804 (7), 1405-1412 (2010).
  18. Yang-Hartwich, Y., et al. P53 protein aggregation promotes platinum resistance in ovarian cancer. Oncogene. 34 (27), 3605-3616 (2015).
  19. Lei, J., et al. Insights into allosteric mechanisms of the lung-enriched p53 mutants v157f and r158l. Int J Mol Sci. 23 (17), 10100(2022).
  20. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  21. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  22. Yoshimura, Y., et al. Distinguishing crystal-like amyloid fibrils and glass-like amorphous aggregates from their kinetics of formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14446-14451 (2012).
  23. Yang, D. S., et al. Mesoscopic protein-rich clusters host the nucleation of mutant p53 amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (10), e2015618118(2021).
  24. Hackl, E. V., Darkwah, J., Smith, G., Ermolina, I. Effect of acidic and basic ph on thioflavin t absorbance and fluorescence. Eur Biophys J. 44 (4), 249-261 (2015).
  25. Bom, A. P., et al. The p53 core domain is a molten globule at low ph: Functional implications of a partially unfolded structure. J Biol Chem. 285 (4), 2857-2866 (2010).
  26. Ano Bom, A. P., et al. Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: Implications for cancer. J Biol Chem. 287 (33), 28152-28162 (2012).
  27. Muller, P., Ceskova, P., Vojtesek, B. Hsp90 is essential for restoring cellular functions of temperature-sensitive p53 mutant protein but not for stabilization and activation of wild-type p53: Implications for cancer therapy. J Biol Chem. 280 (8), 6682-6691 (2005).
  28. Arsic, N., et al. Δ133p53β isoform pro-invasive activity is regulated through an aggregation-dependent mechanism in cancer cells. Nat Commun. 12 (1), 5463(2021).
  29. Zhao, L., Punga, T., Sanyal, S. Delta133p53alpha and delta160p53alpha isoforms of the tumor suppressor protein p53 exert dominant-negative effect primarily by co-aggregation. Elife. 14, RP106469(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

P53TTP53Hs578T

Похожие статьи