Методическая статья

Мутагенез на основе CRISPR-Cas9 у энтомопатогенного нематода Steinernema hermaphroditum и поддержание мутантных линий

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68932

⸱

30 декабря 2025 г.

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье демонстрируется геномная инженерия, опосредованная CRISPR-Cas9, у Steinernema hermaphroditum — энтомопатогенном (EPN: насекомо-паразитический) нематоде и новой генетической модели. Описанная технология полезна для создания мутантов, позволяя выяснить функции генов в биологии нематод, релевантные для мутуалистического и паразитического симбиоза.

Аннотация

Энтомопатогенные нематоды (ЭПН) родов Steinernema и Heterorhabditis поддерживают взаимовыгодные взаимодействия с симбиотическими бактериями Xenorhabdus и Photorhabdus соответственно. Вместе эти пары нематод-бактерий заражают и убивают насекомых-хозяев, которые в основном являются личинками отрядов чешуекрылых и жешкокрылых, образуя управляемую трёхчастную систему для анализа молекулярной основы мутуализма и паразитизма. Ключевым шагом к полному использованию этой модели является разработка стабильных и транспоколенческих генетических инструментов в ЭПН. Здесь мы демонстрируем надёжную платформу редактирования генома CRISPR–Cas9 в новой модели Steinernema hermaphroditum — виде, который легко поддерживается in vivo и in vitro, а также очень поддаётся гонадной микроинъекции. Важно, что его гермафродитное размножение значительно упрощает генерацию и поддержание гомозиготных мутантных линий. Мы предлагаем подробный протокол эффективного, целевого разрушения генов с использованием микроинъекции комплексов рибонуклеопротеинов Cas9. В качестве доказательства концепции мы модифицировали сохранённый ген, ассоциированный с мышцами, unc-22, что сформировало характерный фенотип подёргивания, подтверждающий целевой мутогенез в этой системе. Эта платформа CRISPR–Cas9 открывает путь к стабильной генетической манипуляции в S. hermaphroditum, такой как экспрессия трансгенов, и предоставляет рамки, которые могут быть расширены на дополнительные виды EPN сельскохозяйственного и экологического значения.

Введение

Энтомопатогенные нематоды (ЭПН) — это паразиты, убивающие насекомых, которые формируют видоспецифические взаимовыгодные партнёрства со своими бактериальнымисимбионтами 1. EPN состоят из двух семейств: Steinermatidae и Heterorhabditidae, которые ассоциируются с грамотрицательными бактериями Photorhabdus и Xenorhabdus spp, соответственно 2,3. Во время свободно живущей инфекционной ювенильной стадии (IJ) нематод Steinernema бактерии Xenorhabdus размещаются в кишечном кармане нематоды, известном как контейнер, и при проникновении насекомого в гемокоэль бактерии высвобождаются, после чего размножаются и убивают насекомое с помощьюсепсисемии 3,4. В этих взаимовыгодных отношениях бактерии вырабатывают антимикробные и инсектицидные соединения, которые защищают от иммунного ответа хозяина и обеспечивают питательную поддержкунематоде 5. Взамен бактерии получают выгоду от защиты, обеспечиваемой хозяином нематоды от микробов окружающей среды, и способствуют их распространению среди новых насекомых 6,7.

За последние несколько десятилетий партнёрство Steinernema-Xenorhabdus было установлено как мощная экспериментальная система для изучения различных аспектов паразитических и взаимовыгодных взаимодействий, таких как поведение насекомых по поискухозяев 3, колонизация бактерий в нематодномхозяине 8 и адаптивное поведение симбиотических бактерий, способствующее их переходам между нематодами и насекомыми хозяевами9. EPN также являются важными видами для устойчивости почвы и используются как органические средства для борьбы с вредителями для повышения сельскохозяйственнойпродуктивности 10,11.

Несмотря на быстрое развитие генетических инструментов у симбиотических бактерий Xenorhabdus и Photorhabdus12, устойчивые генетические инструменты в ЭПН остаются редкими. Гонадальная микроинъекция успешно установлена как у нематод Heterorhabditis, так и у нематод Steinernema 13,14. Ранее гонадная микроинъекция в Heterorhabditis bacteriophora использовалась для постоянного доставки двухцепочечной РНК с целью устранения генов у первого поколенияпотомков 13,15. Недавно была разработана редактирование генома CRISPR-Cas9 в Steinernema, осуществляемое с помощью гонадных микроинъекций, что привело к точным, стабильным и наследственныммутациям 14.

Один вид Steinernema, S. hermaphroditum, доказал свою высокую способность к лечению и обладает большим потенциалом как новый генетический модельный организм 4,14.Изначально изолированный из почвы вИндонезии 16 и повторно изолированный вИндии 17, S. hermaphroditum последовательно гермафродит, с небольшим числом самцов в каждом поколении, что облегчает адаптацию генетических инструментов классической модели нематоды C. elegans4. Кроме того, геном S. hermaphroditum был секвенирован и собран в хромосомы, что упростило задачу выявления потенциальных целевых участков Cas9 и разработкупраймеров 18.

Во время микроинъекции ЭПН инъекционная смесь, содержащая соответствующие реагенты, такие как дсРНК, белок Cas9 или направляющие РНК, подаётся в синцитиальную нематоду-гонаду с помощью иглы, взятой из кварцевого капилляра. Подходящий объём и давление при инъекции обеспечивают видимый «поток» жидкости по всей гонадной руке. Поскольку у этих нематод есть пара синцитиальных гонад, состоящих из ядер зародышевой линии, которые имеют один и тот жецитозоль 19, такой микроинъекциальный подход позволяет получить доступ к нескольким зародышным клеткам для редактирования до наступления цитокинеза, разделяя ядра зародышевой линии на развивающиесяяйцеклетки 20. Хотя гонадная микроинъекция служит последовательным методом генетической модуляции у нескольких видов нематодов, не относящихся к моделям(14,21,22,23,24,25), крайне важно адаптировать методы инъекции к соответствующим структурам гонад, жизненной стадии и физиологическому состоянию каждого вида нематод, чтобы обеспечить успех и высокую эффективность доставки. Методы восстановления после инъекций и поддержание мутантных линий важны для экономической эффективности этой техники.

В этом исследовании демонстрируется протокол редактирования генома CRISPR-Cas9 у Steinernema hermaphroditum. Гонадная микроинъекция описывается у молодого взрослого человека — стадии, устойчивой к микроинъекции высокого давления и восприимчивой к редактированиюгенов 14. Кроме того, приведены подробные методы, описывающие поддержание наследственных и стабильных мутантных линий как через криоконсервацию, так и через размножение через насекомых.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка нематоды перед микроинъекцией

  1. Подготовьте тарелки для роста среды нематод (NGM), засеянные бактериями Xenorhabdus griffiniae и Comamonas aquaticus.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивать нематоды S. hermaphroditum на их родной симбиотической бактерии Xenorhabdus griffiniae перед микроинъекцией для максимизации роста нематод, а также восстановить инъекционных животных на бактерии Comamonas aquaticus для повышения выживаемости послеинъекции 14.
    1. Полосы бактерии X. griffiniae на пластинках LB-пируватов агарных пластин (2,5 г экстракта дрожжей, 5 г триптона, 2,5 г хлорида натрия, 0,5 г пирувата натрия, 7,5 г агар в воде 500 мл) и инкубируется ночью при 30 °C.
    2. Разведите бактерию C. aquaticus на пластинах ЛБ агаров и инкубируют на ночь при 37 °C.
    3. Выберите одну колонию бактерий для инокуляции тёмной жидкой среды LB (5 г экстракта дрожжей, 10 г триптона, 5 г хлорида натрия в 1 л воды). Выращивайте бактериальную культуру за ночь (максимум 16 часов) с аэрацией (X. griffiniae при 30 °C и C. aquaticus при 37 °C).
    4. Приготовьте NGM агар: (3 г NaCl, 2,5 г пептона и 20 г агара, добавленных в 975 мл воды, с 1 мл холестерина, 1 мл 1 м CaCl2, 1 мл 1 М MgSO4, 25 мл 1 M KPO 4 добавлено после автоклавирования) 10 мл на 60 мм x 15 мм чашки Петри.
    5. Семенные бактерии: Добавьте несколько капель ночной бактериальной культуры на каждую пластину НГМ-агара, аккуратно встряхните, чтобы распределить бактериальные капли в участок.
    6. Инкубировать NGM-пластины с бактериальными семенами при комнатной температуре, чтобы агар высох и бактерии могли расти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: пластины с семенами X. griffiniae следует использовать как можно скорее; Пластины C. aquaticus можно хранить при комнатной температуре в течение 1-2 недель.
  2. Стадия нематод
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите стадию J3 гермафродита накануне инъекции, а молодых взрослых — в день инъекции.
    1. Собрать или нарезать нематод S. hermaphroditum на подготовленные пластины NGM, засеянные X. griffiniae. Инкубировать при температуре 25-28 °C для оптимального роста.
    2. Накануне микроинъекции выберите стадию J3 гермафродитов на NGM-агар, засеянный X. griffiniae. Как показано на рисунке 1A, стадия J3 оценивается по размеру нематоды и морфологии гонад и вульвы.
    3. В день микроинъекции выбирайте молодых взрослых гермафродитов (рисунок 1B).

2. Подготовка CRISPR-Cas9 для микроинъекции

  1. Выбор crРНК CRISPR и хранения реагентов
    1. Извлеките целевую последовательность гена из эталонного генома Steinernema hermaphroditum с помощью BlastP, PRJNA982879.
    2. Выберите раннюю последовательность кодирования экзонов, если возможно, желательно первой, и введите её в CRISPRScan с настройкамипо умолчанию 26 для генерации списка возможных РНК (crRNA).
    3. Сбросьте верхние crРНК с геномом S. hermaphroditum , чтобы выбирать только уникальные crРНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: подтвердить последовательность целевой области генома с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования Сэнгера перед проектированием crРНК, чтобы обеспечить эффективное связывание crRNA.
    4. Храните РНК CRISPR (crRNAs) и универсальные трансактивирующие РНК CRISPR (тракрРНК) при 100 мкм каждая в дуплексном буфере при -80 °C.
    5. Храните белок Cas9 при 10 мг/мл при -20 °C или -80 °C. Храните 1 млн KCl при 4 °C.
  2. Изготовление 2% агарозной прокладки для инъекций (адаптировано из Berkowitz et al.27)
    1. Растопите 2% агарозы в воде с помощью микроволновой печи.
    2. Перенесите 50 мкл расплавленной агарозы на стекло с крышкой (48 x 60 мм No1). Немедленно накройте агарозную каплю ещё одним стеклом.
    3. Дайте агарозе высохнуть при комнатной температуре 20 минут. Снимите стекло с верхней крышки. Пометьте переднюю сторону агрозного подушечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию: запекайте агрозную подушечку при 37 °C на ночь, чтобы дополнительно её высохнуть.
    4. Храните 2% агарозные прокладки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев или лет.
  3. Подготовка иглы
    1. Изготавливать кварцевые иглы с использованием следующих параметров на лазерном вытягивателе нити. С использованием игольного вытягивателя в этом исследовании рекомендуемая программа выглядит следующим образом: Тепло: 700, Филамент: 4, Скорость: 60, Задержка: 145, Натяжение: 175.
    2. Вытащите кварцевые иглы (OD: 1,0 мм, ID: 0,7 мм) непосредственно перед инъекцией или заранее и храните их в ящике для пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, нам также удаётся успешно вводить боросиликатные иглы (OD: 1,2 мм, ID: 0,68 мм). Обратите внимание, что разные размеры игл будут совпадать с разными размерами держателей для игл.

3. Микроинъекция CRISPR-Cas9 и восстановление нематод после микроинъекции

  1. Приготовьте микроинъекционную смесь CRISPR-Cas9 (адаптированную из Wang et al.28)
    1. Подготовьте свежие дуплексы направляющей РНК, смешивая выбранные crРНК и универсальные тракрРНК в соотношении 1:1, то есть от общего crRNA к тракрРНК в ПЦР-трубке:
      crRNA #1 (100 мкм) - 1,5 мкл
      crRNA #2 (100 мкм) - 1,5 мкл
      тракрРНК (100 мкм) - 3,0 мкл
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании co-CRISPR crRNA #1 нацелена на ген маркера unc-22 , а crRNA #2 может быть заменена другой последовательностью, направленной на второй интересующий ген.
    2. Инкубировать ПЦР-трубку в термоциклере при 94 °C в течение 2 минут, а затем охладить до комнатной температуры.
    3. Соберите инъекционную смесь, смешав следующее, затем инкубуйте 5 минут при комнатной температуре:
      Cas9 (10 мг/мл) — 2 мкл
      1M KCl — 0,58 мкл
      гРНК-дуплексы (начиная с шага 3.1.1) — 2.7 мкл
    4. Перемешайте три раза, щёлкая ПЦР-трубкой, затем короткое вращение (10-15 секунд) в мини-центрифуге, чтобы собрать содержимое трубки. После финального смешивания прокрутите вниз дольше, до 1 минуты.
  2. Загрузите и сломайте иглу
    1. Загрузите иглу 1-2 мкл инъекционной смеси с помощью наконечника микрозагрузчика.
    2. Соберите иглу к держателю пипетки (иглы), затем разломите кончик, проведя иглой по кусочку двусторонней ленты, покрытой галоуглеродным маслом. Проверьте открытие иглы с помощью функции CLEAN микроинжектора.
  3. Микроинъекция в синцитиальные гонады молодого взрослого нематода
    1. Перенесите небольшую каплю галоуглеродного масла на 2% агарозную площадку.
    2. Под расщепляющим стереоскопом используйте тонкую (мягкую) платиновую проволоку, чтобы поднять молодого взрослого гермафродитного нематода и промыть его в буфере M9 (на литр: 3 г KH2PO4, 11,3 г Na2HPO 4, 5 г NaCl, с добавлением 1 мл 1 MMgSO 4 после автоклава) для удаления бактерий (см. молодой взрослый нематод на рисунке 1).
    3. Переложите промытый нематод на агарозную подушечку и поместите её в каплю галоуглеродного масла. Используйте мягкую платиновую проволоку, чтобы аккуратно провести по нематоде, пока животное не обездвижится.
    4. Аккуратно положите агарозную подушечку на стадию микроинъекции. Ориентация гонадального синцития должна быть направлена на иглу примерно под углом 45°. Начните с увеличения 5x, затем переходите на 20x и 40x для инъекций.
    5. Убедитесь, что игла проникает в синцитий, затем используйте функцию CLEAN микроинжектора, чтобы вводить инъекционную смесь примерно при давлении 99 psi, пока не будет зафиксирован чистый гонадный поток жидкости, чтобы реагенты проникли в зародышевые клетки в гонадном синцитии.
    6. Если доступна вторая гонадная рука, переместите ступень, чтобы иглу для введения во вторую руку.
  4. Восстановление нематод после инъекции
    1. Сразу после инъекции введённое животное снова суспензируется в 1-2 мкл буфера M9 на агарозной подушечке.
    2. Используя тонкую платиновую проволоку, снимите введённую нематоду с агарозной подушки и смойте масло с помощью буфера M9.
    3. Извлечение нематод на пластинах NGM с помощью газона из бактерий C. aquatica (подготовка пластин NGM: см. шаг 1.1), что увеличивает выживаемость нематод послеинъекции 14. Инкубировать при 25 °C ночью.
    4. На следующий день изолируйте каждую введённую нематоду (P0) на отдельную пластину NGM, засеянную X. griffiniae. Позвольте животным P0 произвести потомство F1 за ночь (либо откладывая яйца, либо упаковывая в пакеты) для фенотипирования и генотипирования (см. шаг 4).

4. Скрининг для подтверждения нокаутов с помощью CRISPR-Cas9

  1. Никотиновый (CAUTION) скрининг F1 на подёргивающийся фенотип при использовании unc-22 в качестве маркера co-CRISPR
    1. Перенесите потомство F1 от инъекционных животных P0 в участок с раствором никотина 2%.
    2. Выберите отдельное дергающееся животное из никотинового пятна и сразу же поднимите его на NGM агаре, посеянном X. griffiniae. Изолируйте каждую дергающуюся F1 на отдельной пластине и дайте ей получить F2-животных для генотипирования (см. шаг 4.2).
  2. Генотипирование
    1. Выберите восемь потомков F2 или F3 из каждой линии Twitching F1 для генотипирования. К таким животным, вероятно, относятся как +/mut гетерозиготные, так и мут/ мут гомозиготные животные.
    2. Подготовьте свежий буфер для экстракции ДНК, добавив 20 мкл протеиназы K (10 мг/мл) в 180 мкл буфера лизиса червя (50 мМ KCl, 10 мМ Tris pH 8,0, 2,5 мМ MgCl2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% желатина).
    3. Добавьте нематод в 10 мкл буфера экстракции ДНК в ПЦР-пробирках. Инкубировать при 65 °C в течение 10 минут, затем при 95 °C в течение 15 минут для извлечения геномной ДНК.
    4. Генотипизуйте нематод путём PCR-амплификации целевой области Cas9 согласно инструкциям производителя, используя 1-2 мкл лизата из шага 4.2.2. Важно предусмотреть достаточно пространства, если возможно (не менее 300 ударных пунктов), между участками разреза Cas9 и сайтами связывания праймера на случай значительных делеций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агарозный гель электрофорез может быть использован для подтверждения успешного усиления перед секвенированием.
    5. Очищайте ПЦР-продукт с указаниями производителя, чтобы обеспечить точный анализ следов секвенирования Сэнгера.
    6. Секвенируйте ПЦР-ампликоны, полученные на шаге 4.2.4, с помощью секвенирования Сэнгера, и проанализируйте хроматограммы с помощью программыICE 29.
    7. Если мутантные аллели подтверждены на шаге 4.2.6, вернитесь к исходной дергающейся пластине F1 и изолируйте как минимум восемь гермафродитов на отдельных пластинках. Дайте каждой отдельной нематоде дать потомство, затем массуйте генотипирование потомства для подтверждения гомозиготности. Гомозиготные линии можно поддерживать в лаборатории, как описано на шаге 5.

5. Обслуживание линии CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует три основных метода обслуживания линии. К ним относятся криоконсервация на основе трегалозы-ДМСО (шаг 5.1), проход in vivo через восковых червей (шаг 5.2) и in vitro поддержание на пластинах NGM (шаг 5.3).

  1. Трегалозно-DMSO-криосохранение диких и мутантных линий
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя метод криоконсервации трегалозы-DMSO4, S. hermaphroditum можно стабильно хранить длительное время при -80 °C и восстанавливать на среде NGM. Нематоды замораживаются в криогенных флаконах объёмом 2 мл. Оптимальное замораживание достигается постепенным охлаждением с использованием контейнера из пенополистирола.
    1. Выращивать S. hermaphroditum на NGM, посеянном X. griffiniae (см. шаг 1.1), пока большинство популяции не станет J1 или гермафродитами для мешков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стадий инфекционного подростка (IJ), так как они плохо замораживаются при этом методе.
    2. Смойте нематодных червей с агарных пластин NGM в буфере M9 и соберите их в конических трубках объёмом 15 мл до отметки до 5 мл. Концентрируйте центрифугой (достаточно 1372 x g на 1-2:30 минуты).
    3. Удалите супернатант и промывайте раз в 5 мл буфера замораживания трегалозы-DMSO с помощью центрифуга, следуя параметрам, указанным на шаге 5.1.2.
    4. Восстановите червей в буфере заморозки трегалозы и DMSO комнатной температуры 5 мл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, держа трубку на боку. Это увеличивает уровень выживания.
    5. Раздайте 1 мл на пробирку в 4 криогенных флаконах.
    6. Поместите флаконы в коробки из пенополистирола в морозильнике при температуре -80 °C.
    7. Через неделю — тест-разморозка одного из флаконов.
    8. Переложите остальные флаконы в морозильные ящики при температуре -80°C и храните их постоянно.
    9. Тестовое оттаивание или восстановление S. hermaphroditum из замороженных запасов
      1. Достаньте флакон из морозилки и дайте ему полностью разморозиться при комнатной температуре.
      2. Вылейте жидкое содержимое на свежую тарелку NGM. Обратите внимание, что добавление симбиотической бактерии не обязательно, так как замороженный запас обычно содержит достаточно симбиотических бактерий. Глисты должны начать восстанавливаться в течение нескольких минут или нескольких часов.
      3. Наблюдайте движение и размножение нематоды. Через день-два перенесите несколько нематод на новые пластины NGM, посеянные X. griffiniae.
  2. Обслуживание in vivo через Galleria mellonella
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для роста in vivo размножайте мутантные линии S. hermaphroditum через личинки5-го возраста Galleria mellonella (воскового червя). Этот метод особенно полезен для линий, которые не становятся жизнеспособными после криоконсервации. Подробный и похожий протокол естественного распространения энтомопатогенных нематод через насекомых и другие среды для роста ЭПН можно найти в (McMullen и др.30). Вкратце:
    1. Позвольте нематодам голодать и превращаться в IJ на NGM-пластинах.
    2. Используйте буфер M9 для удаления IJ с пластин NGM.
    3. Перенесите IJ для заражения насекомых Galleria с помощью белой ловушки.
  3. Для in vitro обслуживания пластин NGM следуйте следующим шагам:
    1. Семенные NGM-пластины с примерно 100 мкл свежей жидкой культуры симбионта S. hermaphroditum , X. griffiniae.
    2. Дайте бактериальному участку полностью высохнуть, прежде чем переносить нематод на пластину.
    3. Храните тарелки при 25 °C и перемещайте нематоды на свежесеянные тарелки примерно раз в месяц.

Результаты

Были разработаны две РНК CRISPR (идентифицированные по номеру сайта Pam 3 и Pam 5), направленные на гомолог S. hermaphroditum UNC-22 на ранее опубликованных участкахPam 14 (рисунок 2A). Каждая crРНК комплексировала с тракрРНК, образуя одну направляющую РНК (sgRNA) и была включена в Cas9 для формирования рибонуклеопротеина, описанного на шаге 3.1. В этом протоколе две crRNA были разработаны для нацеливания на один и тот же ген; однако, если использовать метод co-CRISPR, разработанный для C. elegans31, crRNA #2 может быть заменён интересующим геном crRNA. В качестве альтернативы к двум crRNA unc-22 можно добавить к двум генам, направленным на интересующий ген, сохраняя соотношение 1:1 между общим crRNA и tracrRNA.

За день до микроинъекций хорошо сытные ранние нематоды J3 с видимыми гонадами (рисунок 1A) были собраны на свежую пластину, засеянную симбиотической бактерией Xenorhabdus griffiniae , и позволили вырасти в молодых взрослых за ночь при комнатной температуре (рисунок 1B). В день инъекций молодые взрослые (рисунок 1B), имевшие мало или вовсе не имевших оплодотворённых эмбрионов, были выделены на новую чашку Петри для инъекций. Согласно наблюдениям, у молодых нематод кутикула была относительно более проникаемой; однако после инъекции они выздоравливались реже. Игла была изготовлена (см. шаг 2.3), загружена инъекционной смесью и разбита, как описано в шаге 3.2. Нематода была промыта в буфере M9 и обездвижена каплей галоуглеродного масла на агарозной площадке (шаг 2.2). В месте инъекции (рисунок 1C) внешнее давление от микроинжектора использовалось для создания видимого потока жидкости в гонадальных синцитиях, обеспечивая погружение ядра зародышевой линии в инъекционную смесь (шаг 3.3). По возможности обе гонады вводились для увеличения вероятности получения отредактированного потомства F1.

Введённый нематод (P0) был быстро извлечен путём промывания в буфере M9 и инкубирован на ночь на пластинах NGM, засеянных бактериями Comamonas aquaticus , для ночного восстановления (шаг 3.4). Примерно 40%–90% инъекционных животных P0 выздоравливали вскоре после инъекции, а 20%–90% введённых нематод P0 выжили ночью на C. aquatica. (Таблица 1). Выживших животных P0 затем изолировали на NGM-петри-чашки, засеянные X. griffiniae , с коэффициентом переноса 20%–90%. Скрининг никотина на фенотип делеции unc-22 проводился на животных с категориями F1, F2 и F3 для определения наследственности делеции (шаг 4.1). Нематоды S. hermaphroditum с делецией гена unc-22 дергаются при воздействии 2% никотина, тогда как нематоды дикого типа парализованы, что позволяет проводить скрининг и отбор животных с предполагаемымиделециями 28. В этом эксперименте до 64% нематод F1, выделенных из введённого P0, образуют постоянно дергающиеся потомки F2 (Таблица 1). Для удобства скрининга инъекций co-CRISPR отдельные подёргивающиеся нематод можно отслеживать и количественно оценивать с помощью систем визуализации и отслеживания, один из примеров приведён на рисунке 2B.

Для подтверждения генотипа дергающегося потомства из нематод F3 была извлечена геномная ДНК для генотипирования локуса unc-22 (шаг 4.2). Путём ПЦР-амплификации геномной области вокруг целевых участков были обнаружены несколько слабых полос, указывающих на малые и крупные вставки и делеции (инделы) (рисунок 2C,D), некоторые из которых были подтверждены секвенирующим анализом (рисунок 2E). Эти данные свидетельствуют о том, что CRISPR-Cas9 создавал двухцепочечные разрывы на геномных целевых участках, которые восстанавливались с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ). Для подтверждения специфической модификации генома на нуклеотидном уровне были проанализированы продукты с помощью ПЦР-амплифицированных из целевых участков с помощью секвенирования Сэнгера: выравнивание хроматограмм как дергающихся, так и диких нематод позволило выявить вставки или делеции в целевых участках (рисунок 2E). После подтверждения с помощью фенотипирования и генотипирования мутантные линии CRISPR можно поддерживать в лаборатории, проходя через насекомое Galleria mellonella (воскового червя) или сохранять с помощью криоконсервации (шаг 5). Если unc-22 используется как маркер ко-CRISPR, см. рисунок 3 для иллюстрации предложенной стратегии выделения потомков F2 и F3, несущих мутации в гене-мишени.

figure-results-1
Рисунок 1: Развитие S. hermaphroditum в лабораторных условиях. (A) Оценка стадий развития гермафродитов, выращиваемых на НГМ-агаре, питающихся симбиотической бактерией X. griffiniae. Шкала = 50 мкм. v = вульва; g = гонада. (B) Молодой взрослый гермафродит на соответствующей стадии развития для микроинъекции в гонады. Синяя коробка: место гонадального укола. (C) Синцитиальная гонада гермафродита, предназначенная для микроинъекции. Обе гонады окрашены в разные оттенки жёлтого для облегчения визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты редактирования генома CRISPR-Cas9 у S. hermaphroditum. (A) Структура гена гомолога S. hermaphroditum unc-22 . Синяя коробка: целевой экзон. Чёрная звезда: целевой пункт Pam 3. Красная звезда: Целевой пункт Pam 5. (B) Фенотипический анализ репрезентативного дергающегося потомства на основе рывочного движения при обработке 2% никотина. Блю: вздрагивающий взрослый человек из линии мутантов unc-22 . Оранжевый: взрослая особня, парализованная 2% никотина. (C,D) Генотипирование девяти независимых подёргивающихся линий F3 (1-9) от двух инъекционных животных P0. Каждый образец содержит четыре потомка F3 из одной линии F1. Праймеры использовались для усиления геномной области вокруг Pam 3 (C) и Pam 5 (D). '+': управление диким типом; "-": отрицательный контроль без загруженной ДНК. Синие коробки: пример подтверждённого гетерозиготного ампликона на агарозном геле. Чёрная стрелка в (C), ампликон, проанализированный в (E). (E) Анализ ICE мутанта UNC-22 в Pam 3. ПЦР-образец 5 из (C) (чёрная стрелка) был секвенирован и проанализирован с помощью ДВС, показав, что 50% аллелей были дикого типа, а различные мутации делеции (от 20 до 31..) были обнаружены в геномной ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Рабочий процесс скрининга Co-CRISPR для выделения мутантов в целевом гене. При использовании unc-22 в качестве маркера co-CRISPR нематоды F1 скринингуются с 2% никотина, а подёргивающиеся F1 выделены на отдельные NGM-пластины, засеянные симбиотической бактерией X. griffiniae. Затем потомки дергающихся F1 F2 проходят скрининг, а не дергающиеся F2 изолируют на отдельных пластинах. После того как F2 могут производить потомство, F3 генотипизируются, чтобы определить, был ли выведен целевой ген. Недергающиеся братья и сестры дергающихся нематод также могут иметь инделы в интересующих генах и должны быть включены в генотипирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

ВоспроизведениеНет. вводится P0Нет. P0, переживший инъекции*Нет. P0, который прожил ночьНет. P0 перенесён на X. griffiniae нашивкиНет. P0 с подёргиваниями F2% инъекции P0, вызывающего подёргивание F2
1844300
29444333.33
311101010763.64
49422222.22

Таблица 1: Репрезентативные результаты модификации гомолога S. hermaphroditum unc-22 посредством микроинъекции и скорость успеха, что подтверждается подёргиваниями потомков . *Выживаемость определялась движением глоточного насоса примерно через 30 минут после микроинъекции.

Обсуждение

Нетрадиционные генетические модели животных предоставляют ценные возможности для изучения функции эукариотических генов в экологическом и физиологическом контексте, где эти признаки естественно встречаются, например, в присутствии паразитического хозяина или его родного микробиома. В энтомопатогенных нематодах (ЭПН) генетическая манипуляция опиралась на некоторые случаи РНК-основанныхподходов 13,32. Хотя РНКи позволяет проводить функциональные генетические исследования у некоторых видов, она ограничена временным характером дсРНК, и заглушание генов может быть ненадёжно наследственным. Эти ограничения подчёркивают необходимость в стабильных транспоколенческих генетическихинструментах 33,34. В данной работе описывается первый протокол точного редактирования генома у стейнернематид, одной из двух семейств EPN в порядке Rhabditida, как показано в Cao (2023)14.

Успешный мутагенез CRISPR–Cas9 с использованием этого протокола зависит от тщательного обращения с нематодами. Плохо кормленные особи часто имеют схлопнувшиеся гонады, которые трудно пробить иглой. Объём инъекции необходимо регулировать, либо немного увеличив отверстие иглы, либо тонко настроив давление инъекции, чтобы гонада была правильно промыта с инъекционной смесью. Быстрый перенос инъекционных животных из агарозной площадки на пластину восстановления C. aquatica необходим для выживания после инъекции, а скорость исполнения значительно улучшается с опытом. После инъекции важно, чтобы раненые нематоды не подвергались воздействию симбиотической бактерии, так как выздоровление у X. griffiniae составляетнизкий уровень 14.

Засор иглы — распространённая техническая проблема, с которой сталкивается при микроинъекциях. Засоры иногда можно удалить, аккуратно проведя иглой по двусторонней ленте, погруженной в галоуглеродное масло. Тщательное промывание нематод в M9 перед микроинъекцией также предотвращает проникновение симбиотических бактерий и засор иглы. Если закупорка сохраняется, аккуратное расширение отверстия кончика иглы может восстановить поток, хотя чрезмерное удаление может привести к неконтролируемому удалению инъекционной смеси. Переход отборосиликат-14 к кварцевым капиллярам для изготовления игл значительно улучшил эффективность впрыскивания. Кварцевые иглы дают более острые кончики, что способствует успешным инъекциям немного пожилым людям с более толстой кутикулой, тем самым увеличивая выживаемость.

Текущим ограничением этого протокола является то, что вставка трансгенов на основе CRISPR остаётся сложной и требует дальнейшей оптимизации. Гомологично-ориентированное восстановление (HDR) двухцепочечных разрывов, индуцированных Cas9, было труднодостижимым у S. hermaphroditum с помощью коротких доноровssDNA 14,35. Точная вставка трансгенов является ключевой возможностью в любой генетической модели, позволяющей осуществлять высокоточные модификации, такие как замены отдельных аминокислот или транскрипционныерепортеры 36. Таким образом, разработка надёжного протокола knock-in, опосредованного CRISPR-Cas9, значительно продвинует генетический набор инструментов для ЭПН и принесёт пользу более широким исследовательским сообществам в области паразитологии, микробного симбиоза и других исследований.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Мы благодарим Маргарет МакФолл-Нгай и Эдварда Руби за использование их конфокального микроскопа. Благодарим Алексиса (Коди) Харгадона и Гришу Чен за обучение конфокальной микроскопии, а также Карли Р. Майерс за помощь в получении фотографий и анализе видео с подёргиваниями. Мы также благодарим Стефани Хэмптон за выделение средств на покупку системы микроинъекций. Институт науки Карнеги поддержал эту работу.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агар (сетка 80-100)Fisher ScientificBP26411Также используется в пластинах LB пирувата
АгарозеFisher Scientific16500500Также используется в генотипировании
Alt-R CRISPR-Cas9 тракрРНКIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Боросиликатные иглыWorld Precision Instrument1B120F-4
Хлорид кальция (CaCl2)Сигма ОлдричC4901
Холестерин  VWR4335 мг/мл этанола
Comamonas aquatica (DA1877)
Крышное стекло для агарозного прокладкиЛаборатории исследований мозга#4860-1D48 x 60 мм толщина No1
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
Диметилсульфоксид (DMSO)Сигма-Олдрич4723010,5 м
ДНК-чистка и концентратор-5 Zymo ResearchD4014
FemtoJet 4x Microinjector с набором головок Grip, 4 размера 0 держателя для иглыЭппендорф/Калибр5253000017
Личинки 5-го возраста Galleria melonellaGrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
Гелевая система визуализацииAzure400AZI400-01
Гель-нагрузочный красительТермо Фишер СайентификB72
Желатин (2%)Сигма ОлдричG1393
GelRedБиотиум#41003
Праймеры для генотипирования: олиго ДНК, 25 нмольIDTН/Д
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto TryptoneFisher ScientificDF0123-17-3Также используется в тёмных LB, LB пируватных пластинах и nbsp;
Экстракт дрожжей Gibco BactoFisher ScientificDF0127-17-9Также используется в тёмных LB, LB пируватных пластинах и nbsp;
Комплект головки рукоятки 4 размера 1 держателя для иглыКалибрEPE-5196083008(в паре с боросиликатной иглой 1B120F-4)
Галоуглеродное масло 700Сигма ОлдричH8898
Жёсткий платиновый фильтр для проволочного червя для ежедневного обслуживанияTritech ResearchPT-9901
Вывод правок CRISPR (ICE)SynthegoН/ДПрограммное обеспечение, используемое для анализа последовательностей Сэнгера с целью идентификации инделов
KClСигма ОлдричP9541
Лазерный игольчатый вытягиватель P-2000СаттерP-2000G
Хлорид магния (MgCl2)Сигма ОлдричM8266
Сульфат магния (MgSO4)Сигма ОлдричM7506Для буфера M9, также используется в NGM
Кончик микрозагрузчика 2x96STКалибр930001007
Адаптер крепления микроманипулятора для Zeiss Axio Observer и Axiovert 200Tritech ResearchNZ-19-2
МикроскопTritechSMT1
НикотинСигма ОлдричN3876
NP-40Термо Фишер Сайентифик85124
Дуплексный буфер без нуклеазыIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
Ящик для хранения пипетокИнструменты СаттераBX10
Хлорид калия (KCl)Сигма Олдрич793590
Калийфосфат, дибазичный (K2HPO4)Сигма ОлдричP3786KOH для NGM
Калийфосфат, монобазический (KH2PO4)Сигма ОлдричP5655Для буфера M9, также используется в NGM
Протеиназа KСигма ОлдричP6556
Кварцевые иглыИнструменты СаттераQF100-70-10
S. hermaphroditium геномNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNAIDTН/Д
Хлорид натрия (NaCl)VWRSS0430Также используется в пластинах M9, Dark LB, LB пирувата
Фосфат натрия, дибазический (Na2HPO4.7H20)Сигма ОлдричS9390Для буфера M9
Пируват натрияСигма ОлдричP2256Также используется в пластинах LB Pyruvate 
Мягкий платиновый медиатор с проволочным червям для микроинъекцииSurepure Chemetals6824Платина 90%, иридиум, 10% сплавная проволока, диаметр 0,002 дюйма и длина 5 футов
Стандартный держатель для иглыTritech ResearchHI-7
Steinernema hermaphroditum
СтереомикроскопLeicaInveta 3
ТрегалозаКоул-ПармерEW-88195-990,08 м
Tris Fisher ScientificAM9855GpH 8.0
Tween 20Сигма ОлдричP1379
Вертикальный адаптер крепления микроманипулятораTritech ResearchNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

Ссылки

  1. Stock, S., Blair, H. G. Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association. Symbiosis. 46, 65-75 (2008).
  2. Murfin, K. E., et al. Nematode-bacterium symbioses--cooperation and conflict revealed in the "omics" age. Biological Bull. 223 (1), 85-102 (2012).
  3. Dillman, A. R., et al. An entomopathogenic nematode by any other name. PLoS Pathog. 8 (3), e1002527(2012).
  4. Cao, M., Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Sternberg, P. W. The entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum is a self-fertilizing hermaphrodite and a genetically tractable system for the study of parasitic and mutualistic symbiosis. Genetics. 220 (1), iyab170(2022).
  5. Sergeant, M., et al. Identification, typing, and insecticidal activity of Xenorhabdus isolates from entomopathogenic nematodes in United Kingdom soil and characterization of the xpt toxin loci. Appl Environ Microbiol. 72 (9), 5895-5907 (2006).
  6. Walsh, K. T., Webster, J. M. Interaction of microbial populations in Steinernema (Steinernematidae, Nematoda) infected Galleria mellonella larvae. J Invertebr Pathol. 83 (2), 118-126 (2003).
  7. Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: The two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat Rev Microbiol. 5 (8), 634-646 (2007).
  8. Flores-Lara, Y., Renneckar, D., Forst, S., Goodrich-Blair, H., Stock, P. Influence of nematode age and culture conditions on morphological and physiological parameters in the bacterial vesicle of Steinernema carpocapsae (Nematoda: Steinernematidae). J Invertebr Pathol. 95 (2), 110-118 (2007).
  9. Cao, M., Goodrich-Blair, H. Ready or Not: Microbial adaptive responses in dynamic symbiosis environments. J Bacteriol. 199 (15), e00883-e00916 (2017).
  10. Lacey, L. A., et al. Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. J Invertebr Pathol. 132 (C), 1-41 (2015).
  11. Campos-Herrera, R., et al. Intraspecific virulence of entomopathogenic nematodes against the pests Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) and Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J Nematol. 53 (1), 1-14 (2021).
  12. Rill, A., Zhao, L., Bode, H. B. Genetic toolbox for Photorhabdus and Xenorhabdus: pSEVA based heterologous expression systems and CRISPR/Cpf1 based genome editing for rapid natural product profiling. Microb Cell Fact. 23 (1), 98(2024).
  13. Ratnappan, R., et al. RNAi-mediated gene knockdown by microinjection in the model entomopathogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora. Parasit Vectors. 9 (1), 160(2016).
  14. Cao, M. CRISPR-Cas9 genome editing in Steinernema entomopathogenic nematodes. bioRxiv. , (2023).
  15. Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and genetically manipulating entomopathogenic nematodes. J Vis Exp. (181), e63885(2022).
  16. Stock, S. P., Griffin, C. T., Chaerani, R. Morphological and molecular characterisation of Steinernema hermaphroditum n. sp. (Nematoda: Steinernematidae), an entomopathogenic nematode from Indonesia, and its phylogenetic relationships with other members of the genus. Nematology. 6 (3), 401-412 (2004).
  17. Bhat, A. H., Chaubey, A. K., Shokoohi, E., William Mashela, P. Study of Steinernema hermaphroditum (Nematoda, Rhabditida), from West Uttar Pradesh, India. Acta Parasitol. 64 (4), 720-737 (2019).
  18. Schwarz, E. M., et al. Genomes of the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum and its associated bacteria. bioRxiv. , (2025).
  19. Haglund, K., Nezis, I. P., Stenmark, H. Structure and functions of stable intercellular bridges formed by incomplete cytokinesis during development. Commun Integr Biol. 4 (1), 1-9 (2011).
  20. Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748(2021).
  21. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathog. 13 (10), e1006675(2017).
  22. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Sci Rep. 9 (1), 483(2019).
  23. Culp, E., et al. Genome editing in the nematode Caenorhabditis briggsae using the CRISPR/Cas9 system. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa003(2020).
  24. Hellekes, V., et al. CRISPR/Cas9 mediated gene editing in non-model nematode Panagrolaimus sp. PS1159. Front Genome Ed. 5, 1078359(2023).
  25. Patel, R., et al. The generation of stable transgenic lines in the human-infective nematode Strongyloides stercoralis. G3 (Bethesda). 14 (8), jkae122(2024).
  26. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: Designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nat Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  27. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833(2008).
  28. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3 (Bethesda). 8 (11), 3607-3616 (2018).
  29. Conant, D., et al. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. CRISPR J. 5 (1), 123-130 (2022).
  30. McMullen, J. G. 2nd, Stock, S. P. In vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae). J Vis Exp. (91), e52096(2014).
  31. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  32. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: A nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Dev Biol. 7 (1), 101(2007).
  33. Du, X., McManus, D. P., French, J. D., Jones, M. K., You, H. CRISPR/Cas9: A new tool for the study and control of helminth parasites. Bioessays. 43 (1), e2000185(2021).
  34. Quinzo, M. J., Perteguer, M. J., Brindley, P. J., Loukas, A., Sotillo, J. Transgenesis in parasitic helminths: A brief history and prospects for the future. Parasit Vectors. 15 (1), 110(2022).
  35. Schwartz, H. T., Tan, C. -H., Peraza, J., Raymundo, K. L. T., Sternberg, P. W. Molecular identification of a peroxidase gene controlling body size in the entomopathogenic nematode Steinernema hermaphroditum. Genetics. 226 (2), (2024).
  36. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Редактирование геномаэнтомопатогенные нематодынарушение работы генагонадальная микроинъекцияподдержание мутантных линийрибонуклеопротеиновые комплексыгенсвязанный с мышечной тканьюэкспрессия трансгена
Мутагенез на основе CRISPR-Cas9 у энтомопатогенного нематода Steinernema hermaphroditum и поддержание мутантных линий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.