Этот протокол оценивает защитную роль гиперэкспрессии клото в кардиомиоцитах H9C2 при гипоксигенации с помощью молекулярных и функциональных анализов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Этот протокол оценивает защитную роль гиперэкспрессии клото в кардиомиоцитах H9C2 при гипоксигенации с помощью молекулярных и функциональных анализов.
Целью данного исследования было изучение защитной роли клото в кардиомиоцитах, подвергшихся повреждению гипоксии/реоксигенации (H/R). Была создана модель H/ R in vitro с использованием крысиных кардиомиобластов H9C2, которые были трансфектированы лентивирусными векторами с гиперэкспрессией клото. Клетки были разделены на шесть экспериментальных групп: контрольная, H/R, отрицательная контрольная (NC), клото-гиперэкспрессия, PDTC (ингибитор NF-κB) и комбинированная группа, обработанная клото и липополисахаридом (LPS). Уровни экспрессии Klotho определялись с помощью количественного ПЦР в реальном времени и западного блотинга. Жизнеспособность клеток измерялась с помощью MTT-анализа, а апоптоз — с помощью потоковой цитометрии. Экспрессия белков, участвующих в сигнальном пути NF-κB, была проанализирована методом вестерн-блоттинга, а клеточная экспрессия провоспалительных цитокинов — с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Гиперэкспрессия Klotho значительно повышала уровень клото в клетках H9C2 и приводила к улучшению жизнеспособности клеток, снижению апоптоза и снижению клеточной экспрессии провоспалительных цитокинов по сравнению с группой H/R. Вестерн-блот показал, что гиперэкспрессия клото, а также лечение PDTC, подавляют активацию путей NF-κB, что подтверждается снижением соотношения p-P65/P65 и повышением уровня p-IκBα/IκBα. Эти эффекты были частично устранены при совместном лечении с ЛПС. Эти результаты свидетельствуют о том, что клото обеспечивает кардиозащиту от повреждений, вызванных H/R, модулируя сигнализацию NF-κB, снижая воспаление и способствуя выживанию клеток. Этот протокол предоставляет воспроизводимый метод изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе ишемии-реперфузионного повреждения миокарда, а также терапевтического потенциала клото при сердечном воспалении.
Острый инфаркт миокарда (ОМП) в первую очередь вызван ишемией, за которой следует реперфузия, что стало стимулом для обширных исследований механизмов гипоксии/реоксигенационного повреждения миокарда (H/R) 1,2,3. Ключевым аспектом повреждения миокарда H/R является клеточный апоптоз, который значительно способствует патологическому прогрессированиюAMI 4,5.
Недавние исследования задействовали сигнальный путь ядерного фактора каппа B (NF-κB) в повреждении миокарда через его модуляцию воспалительных реакций на такие стимулы, как липополисахарид (LPS)6,7,8. Активация NF-κB происходит через два различных механизма: канонический и неканоническийпути 9. В каноническом пути активация основана на фосфорилировании деградации ингибитора каппа B альфа (IκBα)10. Однако также сообщалось, что фосфорилирование субъединицы NF-κB p65 может стимулировать апоптоз, потенциально независимо от деградацииIκBα 11. Klotho, однопроходный трансмембранный белок, регулирует обмен фосфатов и кальция и подавляет сигналыинсулина 12,13,14. Новые данные свидетельствуют о том, что Клото оказывает тормозирующее влияние на активацию NF-κB в различных тканях, включая почки, гиппокамп и стареющие клетки, тем самым смягчая воспаление и повреждениетканей 15,16,17. Несмотря на эти достижения, роль Клото в AMI и его возможное взаимодействие с NF-κB при повреждении миокарда остаются в значительной степени неизученными.
С методологической точки зрения, модель in vitro H/R с использованием кардиомиобластов крыс H9C2 обладает рядом преимуществ по сравнению с животными моделями, включая контролируемое напряжение кислорода, воспроизводимость и снижение вариабельности. Кроме того, лентивирусно-опосредованная гиперэкспрессия Клото обеспечивает стабильную и эффективную модуляцию экспрессии генов, что позволяет непосредственно исследовать её функциональное воздействие. Эти подходы делают протокол практичным, экономичным и доступным для механистических исследований, при этом избегая этических и логистических сложностей экспериментов in vivo .
С практической точки зрения, клетки H9C2 широко используются в кардио-сосудистых исследованиях, поскольку сохраняют многие свойства, похожие на кардиомиоциты, хотя не полностью имитируют фенотип зрелых кардиомиоцитов. Выбранное состояние H/R (5 часов гипоксии с последующим 1 час реоксигенации) находится в диапазоне, часто используемом для моделирования ишемии-реперфузионного повреждения in vitro. Аналогично, лентивирусная трансдукция с множественными инфекциями (MOI) около 100 является стандартным подходом для достижения эффективной гиперэкспрессии с управляемой цитотоксичностью. Хотя эти функции повышают применимость протокола, следует учитывать ограничения, такие как неполное повторение среды in vivo . Поэтому настоящее исследование направлено на изучение того, как Klotho защищает клетки миокарда от повреждений H/R, а также на создание воспроизводимого протокола для оценки его взаимодействия с NF-κB сигналами.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры, связанные с линией кардиомиобластов крыс H9C2 (ATCC, CRL-1446), проводились в соответствии с институциональными нормами биобезопасности. В этом исследовании непосредственно не участвовали животные или люди. Рисунок 1 иллюстрирует графический рабочий процесс конвейера экспериментального проектирования и анализа. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Культура клеток
Линия крысиных кардиомиобластов H9C2 (ATCC, CRL-1446) была криоконсервирована в жидком азоте с использованием замораживающей среды, состоящей из модифицированной среды Eagle Medium Дульбекко (DMEM, с высоким содержанием глюкозы, 4,5 г/л), дополненной 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS) и 10% диметилсульфоксидом (DMSO). Для извлечения замороженные флаконы быстро размораживались в водяной бане при температуре 37 °C в течение 2-3 минут и немедленно перемещались в предварительно нагретый DMEM. Культурная среда была приготовлена с 10% FBS, 100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 3,7 г/л бикарбоната натрия и 1 мМ пирувата натрия. Клетки поддерживались при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Для всех экспериментов использовались ячейки H9C2 между проходами 6 и 20. Ранние проходы (P20) не использовались для предотвращения фенотипического дрейфа, связанного с проходами.
2. Лентивирусная гиперэкспрессия Klotho в клетках H9C2
Для установления стабильной гиперэкспрессии в клетках H9C2 был применён самоинактивирующий лентивирусный вектор третьего поколения, кодирующей полноразмерный ген крысы Klotho (Kl), контролируемый промотором EF1α. Конструкция содержала репортёр P2A-EGFP для визуализации, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита вудчака (WPRE) и элементы центрального полипуринового тракта (cPPT) для стабильности транскрипта, а также кассету с резистентностью к пуромицину, управляемую промотором PGK для отбора. Лентивирусные частицы получались в HEK293T клетках путём котрансфекции переносной плазмиды с плазмидами psPAX2 (gag/pol/rev) и pMD2.G (VSV-G) в соотношении 4:3:1 с использованием полиэтиленимина (PEI; ДНК: PEI = 1:3, ч/ж). Супернатанты собирались через 48 и 72 часа, очищались центрифугированием при 3 000 × г в течение 10 минут, фильтровались через мембрану PES диаметром 0,45 мкм и концентрировались ультрацентрифугированием при 25 000 × г в течение 2 часов при 4 °C. Вирусные гранулы были повторно суспендированы в PBS, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), а функциональные титры (TU/mL) определялись путём ограниченного разбавления HEK293T клеток с показанием EGFP через 72 часа. Клетки H9C2 были засеяны в пластинах с 6 колодцями по 2 × 105 клеток на колодцу, что приводило к примерно 60% слияния на момент трансдукции. Лентивирусные частицы были добавлены с коэффициентом множения инфекции (MOI) 100 в 1 мл свежей культурной среды с добавлением полибрена (8 мкг/мл) для повышения эффективности инфекции. Инокулюм был снят через 12 часов и заменён на 2 мл полного материала. Через 72 часа после заражения эффективность трансдукции была подтверждена флуоресценцией EGFP под флуоресцентным микроскопом. Для установления стабильных клеточных линий пуромицин (2 мкг/мл, предварительно титрированный) наносился в течение 3–5 дней, начиная с 48 часов после инфекции, с изменениями среды каждые 48 часов. Гиперэкспрессия Klotho была подтверждена с помощью RT-qPCR и иммуноблоттинга. Все лентивирусные процедуры проводились в условиях изоляции уровня биобезопасности 2 (BSL-2), а все вирусные отходы были инактивированы с помощью 10% отбеливателя не менее 30 минут до утилизации.
3. Экспериментальные группы
Клетки H9C2 были засеяны в пластины с 6 колодцями (площадь роста 9,6 см²) при 3 × 10⁵ ячейках на скважину, что дало примерно 70%–80% слияния через 24 часа — необходимую плотность для обработки гипоксии/реоксигенации (H/R) и последующих анализов. После ночного прикрепления клетки были разделены на шесть экспериментальных групп: (1) контрольная группа, которая не получала дополнительного лечения; (2) группа H/R, которая подверглась гипоксии/реоксигенации (H/R) в герметичной модульной камере гипоксии, после чего последовала воздействие 5 часов гипоксии (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) и 1 часа реперфузии (5% CO₂), как описаноранее 18; (3) Отрицательная контрольная (NC) группа, в которой клетки были трансфектированы пустым вектором за 24 часа до обработки H/R; (4) Группа Клото, в которой клетки были трансфектированы лентивирусными векторами, кодирующими Klotho за 24 часа до обработки H/R; (5) Группа лечения пирролидина дитиокарбамата (PDTC), которая была обработана ингибитором пути NF-κB с концентрацией 200 мг/л PDTC в течение 24 часов до H/R 19; (6) Группа Klotho + LPS, в которой клетки были трансфектированы лентивирусными векторами, кодирующими Klotho, и затем обработаны липополисахаридом в дозе 1 мг/л в течение 24 часов перед лечением H/R 20.
4. qRT-PCR
Клетки H9C2 были засеяны в пластины с 6 колодцями с плотностью 1 × 10⁶ ячеек на колодцу. После лечения тотальная РНК была выделена с помощью протокола экстракции фенол-хлороформа. Кратко: в каждую скважину добавляли 1 мл реагента, затем экстракцию хлороформа, осаждение изопропанола и промывку с 75% этанолом. РНК-гранулу сушили на воздухе и растворяли в воде без РНКаз. Концентрация и чистота РНК определялись спектрофотометрически. Для синтеза кДНК 1 мкг общей РНК был обратно транскрипирован с помощью коммерческого комплекта обратной транскрипции согласно протоколу производителя, включая геномное удаление ДНК и случайное гексамерное праймирование. Количественная ПЦР в реальном времени проводилась в системе ПЦР в реальном времени с химией SYBR Green при следующих условиях: начальная денатурация при 95 °C в течение 30 с, затем 40 циклов при 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 секунд. Последовательности праймеров были разработаны с использованием Primer-BLAST (NCBI) и синтезированы коммерческим поставщиком: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTATTAT-3′; (2) β-актин (внутренний контроль): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Относительные уровни экспрессии рассчитывались с помощью метода 2^-ΔΔCT, а специфичность амплификации подтверждалась одним пиком кривой плавления.
5. Вестерн блот
Белки извлекались из клеток H9C2 с помощью буфера радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) (200 мкл на лунку пластины с 6 лучками), дополненного коктейлем ингибиторов протеазы на льду. Концентрации белков измерялись с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA), и равные количества белка (20-30 мкг) загружались на 10% гель SDS-PAGE для электрофоретического разделения. Белки переносились на мембраны поливинилидендифторида (PVDF) с использованием системы влажного переноса при 100 В в течение 90 минут при 4 °C. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком, приготовленным в TBST в течение 1 часа при комнатной температуре, затем инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против Klotho (1:500), фосфо-p65 (1:500), p65 (1:500), фосфо-IκBα (1:500), IκBα (1:500) и β-актина (1:1000). После трёх промываний с ТБСТ мембраны инкубировали с помощью вторичных антител, конъюгированных пероксидазой хрена (HRP) (1:1000), в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые диапазоны визуализировались с помощью усовершенствованной системы обнаружения хемилюминесценции, а интенсивность сигнала количественно измерялась с помощью программного обеспечения ImageJ с использованием одинаковых пороговых параметров.
6. MTT-анализ
Ячейки H9C2 засеивались в пластины с 96 лунками с плотностью 2 × 10³ ячеек на скважину в 100 мкл полной среды и инкубировали ночью для обеспечения присоединения. В каждую скважину добавляли 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в PBS) и инкубировали 4 часа при 37 °C при увлажнённых условиях с 5% CO₂. После инкубации супернатант аккуратно удаляли, добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (DMSO) для растворения кристаллов формазана, после чего следовала инкубация в течение 10 минут при комнатной температуре с лёгким встряхиванием. Затем поглощание измерялось на 490 нм с помощью считывателя микропластин. Ожидаемым визуальным результатом стало появление фиолетовых кристаллов формазана в жизнеспособных клетках до добавления ДМСО и однородного фиолетового раствора после растворения.
7. Потоковая цитометрия
Клетки были собраны через 24 часа после обработки методом трипсинизации и собраны центрифугой при 1 500 × г в течение 5 минут при 4 °C. Клеточная гранула была ресуспендирована в 100 мкл 1× связывающего буфера (10 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl₂, pH 7,4). Annexin V-APC и йодид пропидия (PI) смешивались в соотношении 1:2 для получения раствора для окрашивания 15 мкл, который добавлялся в суспензию ячейки. Смесь инкубировала 10 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации добавлялось 400 мкл того же буфера связывания, и образцы анализировались немедленно с помощью потокового цитометра. Всего было собрано 10 000 событий на одну пробу. Данные анализировались с помощью программного обеспечения FlowJo. Клетки сначала были защищёны на основе прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для исключения мусора, затем квадрантное гейтинг Annexin V против PI для различия жизнеспособных клеток (Annexin V-/PI-), ранних апоптотических клеток (Annexin V+/PI-) и поздних апоптотических/некротических клеток (Annexin V+/PI+). Окрашивание Annexin V-положительно/PI-отрицательное указывало на ранний апоптоз, тогда как двойное положительное окрашивание Annexin V/PI указывало на поздний апоптоз или некроз.
8. Иммунофлуоресценция
Клетки H9C2 посеивались на стерильные стеклянные накладные плиты в пластинах с 6 лунками с плотностью 1 × 10⁵ клеток на скважину и подвергались обработке. Клетки фиксировались с помощью 4% параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре, пермеабилизировали с помощью 0,1% тритона X-100 в PBS в течение 10 минут и блокировали 5% бычьей сывороткой альбумина (BSA) в PBS на 30 минут при комнатной температуре. Коверскользы инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) и IL-6 (1:100). После трёх промывок в PBS клетки инкубировали с фикоэритрином (PE) вторичными антителами (1:500) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Ядра были заменены DAPI в течение 5 минут. Накладки устанавливались на стеклянные стекла с монтажной средой против фейда, а флуоресцентные сигналы визуализировались с помощью флуоресцентного микроскопа. Изображения анализировались с помощью ImageJ (версия 1.54). Красная флуоресценция указывала на экспрессию цитокинов, а синяя флуоресценция — ядра.
9. Статистический анализ
Все данные анализировались с помощью программного обеспечения SPSS. Результаты выражаются как среднее ± стандартного отклонения (SD) как минимум из трёх независимых экспериментов. Для множественных сравнений применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым следовал пост-хок тест Тьюки. P-значение < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Гиперэкспрессия клото улучшает выживаемость клеток и ослабляет воспалительные повреждения, опосредованные NF-κB.
Для подтверждения эффективности доставки генов экспрессия Klotho была количественно измерена как на уровнях мРНК, так и белка. Клетки, переэкспрессирующие Клото, показали устойчивое увеличение по сравнению как с гипоксией/реоксигенацией (H/R), так и с отрицательными контрольными гру...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом исследовании была изучена защитная роль Клото в кардиомиоцитах, подвергшихся повреждению гипоксии/реоксигенации (H/R), и было установлено, что гиперэкспрессия Клото значительно улучшает жизнеспособность клеток, снижает апоптоз и подавляет экспрессию провоспалительных цитокинов. Эти эффекты сопровождались снижением фосфорилирования p65 и усилением фосфорилирования IκBα, что свидетельствует о том, что ингибирование сигнализации NF-κB способствует формированию защитного фенотипа. Фар...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% параформальдегид | Biosharp | XG1050 | |
| Раствор для окрашивания Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Набор для синтеза cDNA | Цягэн | 205410 | |
| Решение DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Дульбекко Модифицированный Eagle Medium (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Комплект реагентов для обнаружения ECL | Мейлунбио | MA0186-1 | |
| Электрофорезный блок питания (POWER PAC 200) | Био-Рад | POWER PAC 200 | |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Потоковый цитометр (Gallios) | Бекман Коултер | Галлиос | |
| Флуоресцентный микроскоп (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Растворитель Формазан | Solarbio | M1020 | |
| HRP-конъюгированное козлиное антитело IgG | Бетил | A120-101P | |
| LPS (NF-κ Агонист пути B) | Сигма-Олдрич | L2630 | |
| Считыватель микропластин (модель K3) | Термо | K3 | |
| Модульная инкубаторная камера (камера гипоксии) | Биллупс-Ротенберг | MIC-101 | |
| Решение MTT | Кайман | 21795 | |
| PDTC (NF-κ Ингибитор пути B) | Сигма-Олдрич | P8765 | |
| PE-конъюгированный козий антиантител IgG | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Полибрен (гексадиметрин бромид) | Инвитроген | X2351 | |
| Мембрана PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Rabbit Anti-Rat IL-1β Антитела | Биорбит | orb378927 | |
| Антитела к IL-6 против крыс против кроликов | ДЗЕН-БИОГРАФИЯ | 384702 | |
| Rabbit Anti-Rat Iκ Bα Антитела | Биорбит | orb223182 | |
| Антитело Кроликов против крыс Клото | Биорбит | orb333711 | |
| Антитело против крыс p65 Rabbit Anti-Rat | Биорбит | orb229138 | |
| Кролик против крыс Phospho-Iκ Bα Антитела | Биорбит | orb223035 | |
| Кролик против крыс Phospho-NF-и каппа; Антитела к B p65 | Биорбит | orb304662 | |
| Rabbit Anti-Rat TNF и альфа; Антитела | Биорбит | orb106548 | |
| Антитела против крыс и бета-актина против кроликов | Хуабио | ET1702 | |
| Система количественного ПЦР в реальном времени (LightCycler 96) | Рош | Light Cycler96 | |
| RIPA Lysis Buffer | Мреда | MO52447 | |
| Набор для подготовки геля SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Набор реагентов TRIzol | Жизненные технологии | 15596-018 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.