Анализ фосфолипидного оттока липопротеинов высокой плотности

Краткое содержание

В данной работе мы описываем протоколы измерения количества флуоресцентного фосфолипида, специфически удаленного из донорских липидных частиц липопротеином высокой плотности (ЛПВП), присутствующим в цельной плазме или сыворотке крови человека. Мы показали, что этот показатель функциональности ЛПВП предсказывает возникновение сердечно-сосудистых заболеваний.

Аннотация

Уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (ЛПВП) в плазме крови в настоящее время является ключевым показателем для клинической оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). ЛПВП-опосредованное удаление липидов бляшек из клеток и внеклеточных отложений в артериальной стенке является одной из нескольких антиатерогенных функций ЛПВП, которые могут объяснять его обратную связь с риском ССЗ. Опосредованное ЛПВП удаление клеточного холестерина in vitro недавно оказалось еще лучшим предиктором риска сердечно-сосудистых заболеваний, чем ХС ЛПВП.

ЛПВП состоит из гетерогенной популяции частиц, которые выполняют различные функции. Частицы ЛПВП, участвующие в удалении липидов атеросклеротических бляшек, содержат обменные аполипопротеины, в основном аполипопротеины A-I, которые диссоциируют от частицы, а затем удаляют липиды бляшек. Зарождающийся ЛПВП образуется в результате солюбилизации и удаления фосфолипидов и холестерина из доменов клеточной плазматической мембраны, генерируемых ABCA1, обменными аполипопротеинами, полученными из ЛПВП. Этот процесс играет решающую роль как в профилактике, так и в регрессии атеросклеротических бляшек.

В данной работе мы описываем протокол для анализа бесклеточного, специфичного для ЛПВП фосфолипидного эффлюкса (HDL-SPE), который, как мы ранее показали, может предсказывать риск возникновения ССЗ. Этот анализ конкретно измеряет опосредованное ЛПВП аполипопротеином удаление необменного флуоресцентного фосфолипида из липидной донорской частицы. Наши клинические исследования типа «случай-контроль» показали, что анализ ЛПВП-SPE работает так же хорошо, а потенциально даже лучше, чем «золотой стандарт» клеточного анализа емкости оттока холестерина, трудоемкий и технически сложный анализ, в котором часто используется радиоактивный холестерин.

Цель этого протокола состоит в том, чтобы позволить фундаментальным и клиническим исследователям оценить функциональность ЛПВП в мобилизации липидов с помощью простого, стандартизированного, бесклеточного, высокопроизводительного анализа. Этот анализ может быть использован фундаментальными исследователями для получения представления о механизмах, лежащих в основе ЛПВП-опосредованного оттока липидов, и для скрининга новых терапевтических агентов, повышающих функциональность ЛПВП. ЛПВП-SPE также может служить в качестве клинического лабораторного диагностического анализа для оценки риска ССЗ.

Введение

Анализ фосфолипидного оттока липопротеинов высокой плотности (HDL-SPE) измеряет функциональность ЛПВП и предназначен для использования в биомедицинских исследованиях и клинических диагностических лабораториях с целью (i) получения более глубокого понимания механизмов, лежащих в основе опосредованного ЛПВП удаления липидов из атеросклеротических поражений, (ii) использования в качестве новой платформы для улучшения клинической оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний и (iii) разработки новых терапевтических средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Холестерин ЛПВП (ХС-ЛПВП) является важным фактором, определяющим риск ССЗ¹, но его полезность ставится под угрозу, поскольку повышенные уровни ХС-ЛПВП (>80 мг/дл) связаны с повышенным риском ССЗ ^2,3,4,5. Повышенный уровень ХС-ЛПВП может представлять собой накопление дисфункционального ЛПВП, который имеет сниженную способность удалять липиды артериальных бляшек⁶.

Анализ клеточной способности к оттоку холестерина (CEC) был первым анализом in vitro, разработанным для измерения функциональности ЛПВП. В этом анализе культивируемые макрофаги (мышиные или человеческие), обычно меченные ^3-H- или флуоресцентным холестерином Бодипи, инкубируются с апоВ-обедненной плазмой или сывороткой. Процент оттока холестерина рассчитывается на основе количества флуоресценции/радиоактивности, ассоциированной с клетками и средой ^7,8,9. Было показано, что анализ CEC является лучшим предиктором инцидента с сердечно-сосудистыми заболеваниями, чем HDL-C⁷. Анализ CEC не поддается преобразованию в обычный клинический диагностический анализ, в основном из-за его требований к клеточной культуре и большой продолжительности (например, дней). Кроме того, анализ CEC ограничен присущей ему изменчивостью (например, различные типы клеток, методы мечения и ПЭГ-истощение β-липопротеинов, что изменяет состав ЛПВП¹⁰).

Несколько исследовательских групп разработали анализы бесклеточного оттока холестерина ЛПВП для использования в качестве инструментов для получения нового понимания функции ЛПВП и для потенциального перевода в клинический диагностический анализ для лучшей оценки риска ССЗ^11,12. Эти анализы оттока обычно включают в себя несколько этапов и используют липидную донорскую частицу, меченную флуоресцентным холестерином, и, как и анализ CEC, они требуют либо истощения β-липопротеинов, либо, в качестве альтернативы, захвата частиц, содержащих апоА-I, с помощью антител против апоА-I, для измерения оттока холестерина ЛПВП в плазме. Несмотря на то, что было подтверждено, что эти альтернативные анализы в разной степени связаны с риском ССЗ, на сегодняшний день было показано, что только один тест¹³, который оценивает обменный курс apoA-I, предсказывает риск возникновения ССЗ¹⁴. Интересно, что было показано, что кинетика обмена апоА-I на ЛПВП в плазме и вне ее независимо связана с CEC¹⁵ и заметно снижается у пациентов с острым коронарным синдромом¹⁶. Кроме того, было показано, что несколько обменных аполипопротеинов ЛПВП опосредуют как холестерин, так и фосфолипиды из ABCA1-экспрессирующих клеток in vitro¹⁷.

Нами разработан альтернативный подход к оценке функциональности ЛПВП¹⁸. Для описанного здесь простого, быстрого и надежного анализа требуются только два компонента, а именно цельные образцы плазмы или сыворотки человека (или животного) (свежие или замороженно-размороженные) и флуоресцентная донорская частица, покрытая липидным покрытием. Анализ измеряет способность apoA-I и других ЛПВП-ассоциированных обменных аполипопротеинов в цельной плазме/сыворотке удалять необменный, меченный головной группой флуоресцентный фосфатидилэтаноламин (ПЭ) из донорской частицы¹⁸ , покрытой липидной оболочкой (Рисунок 1).

Донорные частицы в этом анализе состоят из кристаллов гидрата силиката кальция (CSH), покрытых холестерином, фосфолипида фосфатидилхолина (PC) и флуоресцентного PE. Обменные ЛПВП-ассоциированные аполипопротеины, в основном апоА-I, высвобождаемые из частиц ЛПВП, связываются с донорскими частицами, а затем диссоциируют от них вместе с липидами донорских частиц, включая флуоресцентный ПЭ. Таким образом, ЛПВП, но не другие липопротеины, присутствующие в цельной плазме/сыворотке, специфически приобретают флуоресцентный ПЭ из донорских частиц^18,19. Цельную плазму/сыворотку инкубируют с флуоресцентными покрытыми липидами частицами-донорами силиката кальция (LC-CSH) и физиологическим раствором при 37 °C с встряхиванием в течение 1 ч. Поскольку плотность LC-CSH примерно в два раза превышает плотность воды, донорные частицы легко отделяются от плазмы с помощью низкоскоростного центрифугирования.

Процентный отток ПЭ, измеренный в клинических исследованиях, обычно нормализуют путем деления величины флуоресценции ПЭ, полученной ЛПВП в надосадочной жидкости реакционной смеси клинического образца, на величину, полученную ЛПВП в плазме крови контрольного образца сравнения. Нормализация до референсной плазмы выполняется для коррекции вариаций в подготовке реагентов. Для исследовательских применений % эффика ПЭ может быть определен путем вычисления флуоресценции супернатанта ПЭ, деленной на общую флуоресценцию (флуоресценция супернатанта ПЭ + флуоресценция LC-CSH). Значения измерения надосадочной жидкости вставляются в шаблон в файлы электронных таблиц для расчета %PE Effflux (Дополнительная таблица 1 для тройных измерений и Дополнительная таблица 2 для повторяющихся измерений). Инструкции по выполнению этих расчетов в электронной таблице представлены в виде дополнительных файлов (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3, Дополнительный файл 4, Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6, Дополнительный файл 7 и Дополнительный файл 8), а пример расчета представлен в виде дополнительной таблицы 3.

Рисунок 1: Анализ на ЛПВП-СЭО. Специфический для ЛПВП фосфолипидный отток анализируют в 96-луночных планшетах. На 96-луночные планшеты загружаются солевой раствор, кристаллы силиката кальция (серого цвета), покрытые липидами (LC-CSH), в том числе невзаимозаменяемый фосфатидилэтаноламин, меченный лиссаминераламином (LRh-PE; красные мембранные слои), и до 30 образцов цельной плазмы/сыворотки (желтые; в трех экземплярах). После смешивания в течение 1 часа при 37 °C в термомиксере планшеты кратковременно центрифугируются для гранулирования донорских частиц LC-CSH. Аликвоты надосадочной жидкости, содержащие ЛПВП, специфически меченные LRh-PE, переносятся на черную пластину, содержащую моющее средство (для растворения Lh-Rh-PE) и физиологический раствор. Затем флуоресценция ПЭ измеряется с помощью флуориметра. Физиологический раствор (отрицательный контроль; NC) для коррекции фона и объединенной здоровой человеческой плазмы (Positive Control; ПК) для нормализации планшетов, загружаются вместо образца плазмы/сыворотки в последний набор лунок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

Забор крови осуществляется в соответствии с правилами Хельсинкской декларации 1975 года (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), пересмотренной в 2013 году, и должен соответствовать институциональным рекомендациям в отношении информированного согласия.

1. Получение флуоресцентных меченых фосфолипидами донорских липидных частиц

1. Образование липидной пленки
   ВНИМАНИЕ: Готовьте и дозируйте исходные растворы в химическом колпаке. Наденьте лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Растворы хлороформа утилизируются в органических химических отходах, растворы Triton X-100 (без плазмы) — в химических отходах, плазмосодержащие растворы — в биологически опасных/медицинских отходах.
   1. Приобретите липидные стоковые растворы в хлороформе у поставщика или изготовьте их в лаборатории:
      25 мг/мл: 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC):
      10 мг/мл: Холестерин
      1 мг/мл: 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссаминералодамин B сульфонил) [LRh-PE]
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте герметичные стеклянные трубки с завинчивающейся крышкой. Запечатайте колпачок тефлоновой лентой.
      Хранить при температуре -20 ^оС.
   2. Определите количество LC-CSH, которое понадобится, и подготовьте соответствующее количество стеклянных пробирок.
      В вытяжной шкаф с химическими веществами добавьте в каждую пробирку из боросиликатного стекла диаметром 10 мм 150 мм: 472 мкл стокового раствора DMPC (17,7 мкмоль, 11,8 мг), 339 мкл стокового раствора холестерина (8,8 мкмоль, 3,39 мг) и 305 мкл LRh-PE (200 нмоль, 0,305 мг). Вихрь коротко перемешать.
   3. В вытяжном шкафу для химикатов высушите липидную смесь в стеклянной трубке под слабой струей N₂ в течение 1 ч, чтобы на дне пробирки образовалась сухая липидная пленка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поток N₂ должен вызывать лишь небольшую рябь на поверхности жидкости.
   4. Для анализов, требующих нескольких 96-луночных планшетов в течение нескольких дней или недель, изготовьте большую партию LC-CSH, которую можно зализовать в пробирки или использовать для изготовления готовых к использованию планшетов LC-CSH, которые хранятся при температуре -20 °C или -80 °C. Смотрите шаги 2.2.1-2.2.2 ниже.
2. Покрытие гидрата силиката кальция флуоресцентной липидной пленкой
   ВНИМАНИЕ: Носите лабораторный халат, перчатки, маску для лица и защитные очки при работе с гидратом силиката кальция.
   1. Вставьте конус для весовой бумаги в стеклянную трубку, содержащую высушенные липиды. Добавьте 80 мг порошка гидрата силиката кальция (CSH) (реагент для удаления липидов) в стеклянную пробирку с помощью конуса бумаги для взвешивания, чтобы направить порошок к основанию пробирки. Немедленно добавьте 2 мл нормального физиологического раствора в стеклянную пробирку, содержащую высушенные липиды и ХСГ. Накройте верхнюю часть трубки парапленкой.
   2. Вихрем вручную выбить основную массу липидов со дна стеклянной трубки. Вставьте стеклянную трубку в отверстие, сделанное в пенопластовой платформе, прикрепленной к вершине вихря. Закрепите трубку на вихревой платформе с помощью армированной ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно отрегулируйте скорость вихря, чтобы смесь могла подняться примерно на полпути вверх по стеклянной трубке.
   3. Вортекс в течение 10 мин. После вортекса убедитесь, что на стенке трубки не осталось липидов. При необходимости вручную делайте вихри по мере необходимости, пока не останется липидов. Перенесите весь объем стеклянной пробирки в коническую пластиковую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1 мл. Промойте стенки стеклянной трубки 3 мл дополнительного физиологического раствора и переложите в ту же коническую пластиковую трубку объемом 15 мл.
3. Мойка LC-CSH
   1. Центрифугируйте пластиковую пробирку объемом 15 мл, содержащую покрытый липидами CSH (LC-CSH), в течение 2 мин при 935 × г при 4 °C для гранулирования донорских частиц. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирации с помощью длинного очень тонкого наконечника пипетки.
   2. Начните с верхней части надосадочной жидкости и, медленно скользя наконечником пипетки по боковой стороне трубки, наклоните трубку по мере удаления надосадочной жидкости. Оставьте небольшое количество (≈ 200 мкл) физиологического раствора, чтобы предотвратить случайную аспирацию LC-CSH из гранулы. Добавьте достаточно физраствора, чтобы довести общий объем до 5 мл.
   3. Повторите шаги 1.3.1-1.3.2 четыре раза. После окончательной промывки добавьте достаточно физраствора, чтобы довести окончательный объем до 2,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить в препаратах LC-CSH при температуре 4 °C в течение 2 недель или при температуре -20 °C или -80 °C до 6 месяцев.
4. Подготовка больших партий для готовых к использованию пластин LC-CSH
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такой подход позволяет изготавливать измерительные пластины с однородным составом реагентов из одной и той же партии LC-CSH, тем самым сводя к минимуму вариативность измерений между пластинами.
   1. Подготовьте 12 пробирок LC-CSH (2,5 мл x 12 пробирок), как описано в шагах 1.1.1-1.3.2 выше. Соедините все содержимое всех 12 пробирок в коническую пластиковую пробирку объемом 50 мл (общий объем 30 мл). Тщательно перебейте вихрь, чтобы получить однородное распределение частиц LC-CSH, и диспонируйте 6 мл в пластиковую коническую пробирку объемом 15 мл. Повторите четыре раза, чтобы получить в общей сложности 5 пластиковых конических пробирок, каждая из которых содержит 6 мл LC-CSH.
   2. Каждая пробирка обеспечит достаточное количество LC-CSH для изготовления 5 готовых к использованию пластин LC-CSH (содержащих 50 μL на лунку для всех 96 лунок в одной пластине). Смотрите шаги 2.2.1-2.2.2 ниже.

2. Инкубация образцов плазмы/сыворотки с флуоресцентными фосфолипид-мечеными донорскими липидными частицами (LC-CSH)

1. Индивидуальные пластины для немедленного использования.
   1. Пипетку внесите 75 мкл физиологического раствора в каждую лунку 96-луночного планшета объемом 0,3 мл, используя столько лунок, сколько необходимо для анализируемого набора образцов. Пипетка 100 мкл физиологического раствора в тройные лунки отрицательного контроля (НК) и 75 мкл физиологического раствора в дублирующие положительные контрольные лунки (ПК) (рис. 2). Используйте многолуночный дозатор для дозирования.
   2. Перед нанесением LC-CSH проведите 3 раза по 10 с пластиковой пробиркой объемом 15 мл по 10 с. С помощью пипетки с одной лункой диспенсируйте 50 мкл LC-CSH вдоль правой стороны лунок, содержащих физиологический раствор. Быстро дозируйте по 50 мкл в 3 лунки. Повторите протокол вихря перед дозированием LC-CSH в следующие 3 лунки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы тяжелый LC-CSH, который спонтанно оседает, был равномерно взвешенным, что позволяло распределять одинаковые количества в каждую скважину.
   3. Поверните 96-луночную пластину на 180° так, чтобы левая сторона лунок оказалась вправо. Пипетка 25 мкл образцов плазмы/сыворотки вдоль правой стороны лунки (рис. 2). Для лунок ПК добавьте 25 мкл стандартной нормолипидической плазмы/сыворотки человека. Общий объем на лунку для анализа составляет 150 μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает перекрестное загрязнение плазмы/сыворотки LC-CSH, поскольку они дозируются вдоль противоположных сторон лунок.
   4. Плотно заклейте пластину клеевой пленкой. Инкубируйте герметичный 96-луночный планшет в темноте в течение 1 ч при 37 °C при 1200 об/мин в термомиксере. После того как инкубация будет завершена, достаньте тарелку из термомиксера и поставьте ее на лед. Центрифугируйте планшет в течение 2 мин при 4 °C (чтобы остановить реакцию переноса) при 935 g для гранулирования донорских частиц.
2. Готовые к использованию пластины LC-CSH
   1. Для использования разморозьте замороженные готовые к использованию тарелки (см. шаги 1.4.1-1.4.2 для подготовки тарелки) на холоде (от 4 °C до 10 °C) в течение 2 часов (или, при необходимости, на ночь). Центрифугируйте в течение 2 минут при 4 °C при 935 × g , чтобы собрать весь материал (125 μL) вместе. Аккуратно снимите клейкую пленку, чтобы не разбрызгать содержимое лунок.
   2. Нанесите 25 мкл образцов плазмы/сыворотки, физиологического раствора и эталонной плазмы человека в трех экземплярах в соответствующие лунки (рис. 1) готового к использованию планшета на льду и запечатайте клейкой пленкой. Герметичную 96-луночную камеру инкубировать в темноте в течение 1 ч при 37 °C при 1200 об/мин в термомиксере. Снимите тарелку с термомиксера и поставьте ее на лед. Центрифугируйте планшет в течение 2 мин при 4 °C (для остановки реакции переноса) при 935 × g (для гранулирования донорских частиц).

Рисунок 2: Дозирование реагентов в лунки без перекрестного загрязнения. Дозируйте плазму/сыворотку и LC-CSH на противоположных стенках лунок. Перекрестное загрязнение сводится к минимуму при повороте пластины на 180° после первого дозирования LC-CSH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Измерение оттока флуоресцентных фосфолипидов в плазму/сыворотку ЛПВП

1. Перенос на черную пластину и измерение флуоресценции
   1. Осторожно снимите клейкую пленку, чтобы не потревожить гранулы LC-CSH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит разрушение гранул, снова центрифугируйте.
   2. Перенесите 50 мкл надосадочной жидкости с 96-луночного реакционного планшета в лунки 96-луночного планшета с плоским дном из черного полистирола для измерения флуоресценции. Используйте многолуночный пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не отсасывайте LC-CSH. Если это произойдет, закачайте обратно в скважину и снова центрифугируйте.
   3. Наполните резервуар обычным физиологическим раствором. Добавьте 50 мкл физиологического раствора в каждую лунку с помощью многолуночной пипетки.
   4. Приготовьте 1% TX-100, добавив 90 мл дистиллированной воды к 10 мл 10% стокового раствора Triton X-100 в пластиковую колбу Эрленмейера объемом 125 мл. Наполните резервуар 1% Тритоном-Х 100.
   5. Добавьте 100 мкл 1% Triton X-100 комнатной температуры в каждую лунку и перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз 2-3 раза с помощью многолуночной пипетки. Избегайте образования пузырей. Лопните пузырьки воздухом из переводной пипетки объемом 3 мл.
   6. Измерьте флуоресценцию лиссаминходамина флуориметром (возбуждение 540 нм/излучение 600 нм).
2. Расчет оттока %PE
   1. Расчет оттока ПЭ
      1. %PE отток = ([Total Supernatant Plasma or Serum FLU - Supernatant NC FLU]/Total FLU)) × 100
         FLU = единицы флуоресценции; NC = отрицательный контроль. Поскольку для измерения флуоресценции на лунку используется только 50 мкл из 150 мкл надосадочной реакционной смеси, необходимо внести следующие поправки:
      2. Общий надсадочный слой FLU/лунка = Измеренный FLU 50 мкл (черная пластина) × 3
      3. Общее количество ГРИПП на 150 мкл реакционной смеси/лунки = Общее количество ГРИППа, выделяемое 50 мкл ЖХ-ХСС.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция LC-CSH рассчитывается в соответствии с приведенным ниже описанием (шаг 4.2.5).
   2. Расчет нормализованного оттока %PE
      1. Используйте нормализованный отток %PE для коррекции различий между анализами, выполненными в разных условиях (т.е. эксперимент, проведенный в разные дни, различия в партиях).
      2. Используйте эту формулу для вычисления нормализованного оттока %PE:
         Нормализованный %PE Effflux = Образец супернатанта %PE effflux (FLU)/положительный эталонный контрольный супернатант %PE effflux FLU.
      3. В качестве контрольного уровня используйте идентичную объединенную человеческую плазму от здоровых доноров с нормальным липидным профилем. Нет необходимости рассчитывать общий супернатант FLU/well, так как это значение одинаково как для образца, так и для эталона.
      4. Для тройных выборок вставьте необработанные данные, полученные на шаге 3.1.6, в таблицу (Дополнительная таблица 1). Для дубликатов образцов вставьте исходные данные, полученные на шаге 3.1.6, в таблицу (Дополнительная таблица 2).

4. Стандартная кривая LC-CSH

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая LC-CSH используется для расчета количества флуоресцентного сигнала PE, присутствующего в аликвоте LC-CSH на лунку. Как правило, используется 50 мкл LC-CSH/лунка. Это значение может быть использовано для расчета оттока %ПЭ в ЛПВП в образце, нормализованном до общего ГРИПП (см. шаг 3.2.1), присутствующего в реакционной смеси.

%PE отток = ((супернатантные единицы флуоресценции образцов [FLU] - супернатант физиологического раствора FLU)/(общий LC-CSH FLU)) x 100.

1. Серийное разведение ЖХ-ЧСГ
   1. Готовят 10-кратные и 100-кратные разведения исходного ЛК-ЧШ (как приготовлено на этапах 1.1.1-1.3.3):
      10-кратное разведение: 100 μл LC-CSH + 900 μл 1% Triton X-100
      100-кратное разведение: 100 мкл 10-кратного разбавления LC-CSH + 900 мкл 1% Triton X-100
   2. Дозируйте тройные образцы 10- и 100-кратного разбавления LC-CSH в 96-луночный инкубационный планшет для стандартной кривой (см. Рисунок 3).
   3. Добавьте достаточный объем 1% Triton X-100 в лунки, содержащие LC-CSH, чтобы довести конечный объем до 200 μL (см. Таблицу 1).
2. Солюбилизация ЖХ-ЧШ для измерения флуоресценции
   1. Запечатать пластину клейкой пленкой и выдерживать в течение 1 ч при температуре 24 °C с встряхиванием при 1200 об/мин. Центрифуга в течение 2 мин при 4 °C при 935 × г. Аккуратно снимите клейкую пленку.
   2. С помощью многолуночной пипетки перемешайте образцы, дозируя вверх и вниз 2-3 раза. С помощью многолуночной пипетки переведите 100 μл LC-CSH на лунку на 96-луночный планшет из черного полистирола с плоским дном для измерения флуоресценции.
   3. Добавьте 100 мкл на лунку 1% Triton-X при комнатной температуре в каждую лунку с помощью многолуночной пипетки. Перемешайте пипеткой вверх и вниз 2-3 раза.
   4. Измерьте флуоресценцию с помощью флуориметра (возбуждение 540 нм/излучение 600 нм).
   5. Вставьте значения флуоресценции, измеренные с помощью флуориметра, в шаблон линейного регрессионного анализа в Дополнительной таблице 1 , как указано в Дополнительном файле 3. Конечные концентрации LC-CSH в стандартной измерительной пластине кривой приведены в таблице 2.

Рисунок 3: Пластина для стандартной кривой LC-CSH. Серийно разбавленный LRh-PE-меченый LC-CSH дозируют в 96-луночный планшет, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Окончательная концентрация	Разбавленный в 10 раз	Разбавленный в 100 раз	1% Тритон Х-100	Итог
ЛК-ЧШ	ЛК-ЧШ	ЛК-ЧШ	Очищающий	Том
(μл/лунка)	(мкл)	(мкл)	(мкл)	(мкл)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Таблица 1: Объемы реагентов, добавляемых в лунки инкубационной пластины для стандартной кривой LC-CSH.

Солюбилизированный	Соляной	Итог	Добавили	Измеренный
ЛК-ЧШ	Том	Том	ЛК-ЧШ	ЛК-ЧШ
(мкл)	(мкл)	(мкл)	(μл/лунка)	(μл/лунка)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Таблица 2: Объемы добавляемых реагентов в лунки измерительной пластины для стандартной кривой LC-CSH.

Результаты

Аналитические методы

Как отмечалось выше, анализ образцов HDL-SPE может быть модифицирован для различных применений, как показано ниже. Перед проведением исследований с исследовательскими образцами сначала проводится валидация стандартной кривой LC-CSH, воспроизводимость и анализ концентрации в плазме для освоения необходимых методов. Во-первых, выполните анализ стандартной кривой ЖХ-ЧСГ для оценки качества препаратов ЖХ-СГ. Затем проведите ан...

Обсуждение

ХС-ЛПВП является ключевым определяющим фактором, используемым для клинической оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и, следовательно, потребности в гиполипидемических или других потенциальных профилактических методах лечения¹. Было показано, что функция ЛПВП в оттоке холестерина в клетках in vitro является еще лучшим предиктором сердечно-сосудистых заболеваний, чем ХС-ЛПВП⁷. К сожалению, этот клеточный анализ не поддае...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,2-димиристоил-сн-глицеро-3-фосфохолин	Avanti Research	850345	14:0 PC (DMPC) Хлороформ Солуитон
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(лиссамин-родамин B-сульфонил) (соль аммония)	Avanti Research	810150-C	Хлороформный раствор LRh-PE
Клейкая плёнка	Прикладные биосистемы	4306311	MicroAmp Clear Adhesive Film
Тефлоновая лента Bay Corporation высокой плотности 1/2 дюйма x 520	Решения для медицинских испытаний	86732
боросиликатные стеклянные трубки диаметром 20 мм и остро; 150 мм	Fisher Scientific	14-961-33
Центрифуга	Thermo Scientific	Серия Sorvall X Pro
Хлороформ	Сигма-Олдрич	366927	подходящим для HPLC и ГЭ; 99.8%
Порошок холестерина	Сигма-Олдрич	C8667	3&бета;-Гидрокси-5-холестен, 5-Холестен-3&бета;-ол
Бумага для взвешивания стеклянного сина	Коул-Палмер	UX-01338-02	Для обработки LC-CSH
Инкубационная пластина	США Scientific	1402-9700	TempPlate 96, полуюбка, 0,2 мл, ПЦР-пластины
Средство для удаления липидов (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Измерительная пластина	Greiner bio-one	655076	Микропластина, PS, 96-колодца, F-ДНО (ДЫМОХОДНАЯ ЯМА), ЧЁРНАЯ; ФЛУОТРАК, МЕДИЦИНСКИЙ ПЕРЕПЛЕТ
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Версия 2507
Наконечники пипетов MultiFlex	Fisher Scientific	50-550-206	Для аспиратинга супернатанта во время промывки LC-CSH
Многомарковый считыватель пластин	Перкин Элмер	1420-050	Многомарковый счетчик Victor3 Wallac1420
Обычный физиологический раствор	Quality Biological	114-055-101	Для множественного применения
Парафильм	Коул-Палмер	HS23452	Чтобы закрыть верхнюю часть стеклянной трубки во время вихря
Поликабонные колбы Эрленмайера	Fisher Scientific	10-041-8	Для 10% раствора тритон-X
Собранная человеческая плазма (кровь получена) Ли Гепарин)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Эталонная плазма, положительный контроль (PC)
Surfact-Amps X 100	Thermo Scientific	28314	10% Triton X-100, разведите 10 раз дистиллированной водой
Термомиксер	Эппендорф	5382000023	Термомиксер C с термоблоком на 96 лунок
Термомиксер Smartblock	Эппендорф	5306000006	96-ядровый SmartBlock
Трансферные пипетки (3 мл, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Для удаления пузырьков с верхней части колодца
Вихревой миксер	Дайггер	3030A	Держатель крепления для стеклянной трубки сверху