Анализ данных многомерной микроскопии с помощью Cell-ACDC

Francesco Padovani; Timon Stegmaier; Benedikt Mairhörmann; Kurt M. Schmoller

doi:10.3791/68954

Method Article

Анализ данных многомерной микроскопии с помощью Cell-ACDC

DOI:

10.3791/68954

⸱

November 7th, 2025

Francesco Padovani*¹ , Timon Stegmaier*¹ , Benedikt Mairhörmann¹^,²^,³ , Kurt M. Schmoller¹

¹Institute of Functional Epigenetics, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, ²Institute of Network Biology, Molecular Targets and Therapeutics Center, Helmholtz Zentrum München, ³Institute of AI for Health, Computational Health Center, Helmholtz Zentrum München

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точный анализ данных многомерной микроскопии требует сложных рабочих процессов. В данной статье показано, как пользоваться программным обеспечением Cell-ACDC. Он использует современные модели на основе искусственного интеллекта для сегментации, отслеживания, анализа родословной клеток и количественной оценки данных микроскопии. Важно отметить, что он дополняет эти модели инновационной платформой для полуавтоматической коррекции выходных данных моделей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние достижения в области количественной микроскопии для медико-биологических наук позволили биологам-экспериментаторам исследовать клетки с беспрецедентным разрешением и скоростью. В то же время революция в области искусственного интеллекта резко увеличила объем информации, которую можно извлечь из данных многомерной микроскопии. Однако большой объем генерируемых данных и сложность современных моделей искусственного интеллекта представляют собой серьезное узкое место на этапе анализа изображений. Cell-ACDC — это удобное программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое представляет собой мощное комплексное решение для сегментации, отслеживания и количественного анализа отдельных клеток в многомерных данных микроскопии. Он предназначен для биологов-экспериментаторов, которым может не хватать передовых технических знаний, необходимых для реализации таких моделей. В этой статье показано, как использовать эту среду для простого использования самых последних моделей, наряду со многими инструментами для интеллектуальной и полуавтоматической коррекции данных, чтобы максимизировать объем получаемой биологической информации. Cell-ACDC поддерживает многоканальные, покадровые и z-стековые данные микроскопии, а также предоставляет специальный набор инструментов, адаптированный к каждому типу размерности данных. Благодаря своей модульной конструкции, которая позволяет биологам легко интегрировать новые модели и получить к ним прямой доступ, Cell-ACDC может служить эталонным инструментом для анализа данных микроскопии.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия стала основополагающим фактором для ускорения биологических открытий на всех этапах исследований и разработок, от фундаментальной науки ^1,2,3 до разработки и тестирования лекарств ^4,5 и в удивительном диапазоне размеров, от клеточных культур до тканей ^6,7, органоидов ^8,9 и целых организмов¹⁰. Однако эти передовые методы микроскопии имеют два основных недостатка. Во-первых, данные микроскопии по своей природе являются^{большими11}, особенно при получении множественных измерений (например, времени и объемов). Во-вторых, точное извлечение богатой биологической информации в данных требует развертывания передовых структур анализа изображений, которые часто основываются на моделях искусственного интеллекта. Эта задача может быть сложной для биологов-экспериментаторов. Таким образом, этапы обработки, обработки и анализа данных могут значительно замедлить научные исследования, снижая при этом потенциал для новых открытий. В идеале программные платформы для анализа биоизображений должны помогать пользователю на каждом этапе анализа, от обработки необработанных микроскопических файлов через сегментацию и отслеживание до последующего анализа для извлечения биологических данных. На практике быстрая разработка нового программного обеспечения для анализа биоизображений, хотя и является положительным результатом, имеет побочный эффект, заключающийся в создании разрозненного ландшафта инструментов, специфичных для конкретного этапа анализа или требующих продвинутых знаний в области программирования. Это ставит перед пользователем сложную задачу сборки рабочего процесса анализа, что часто приводит к неоптимальным конвейерам, в которых данные сохраняются, обрабатываются и преобразуются несколько раз, чтобы сделать их совместимыми со следующим инструментом. Кроме того, разработка анализа биоизображений не стандартизирована до единого языка программирования, при этом многие инструменты разрабатываются в виде плагинов ImageJ¹² или QuPath¹³ (Java), плагинов Napari (Python)¹⁴ или скриптов Python. В некоторых случаях эта сложная среда заставляет ученых выбирать ручной анализ, который не только медленный, но и вносит человеческую предвзятость и препятствует воспроизводимости.

Чтобы решить эту проблему, был разработан Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵ — набор программных инструментов с открытым исходным кодом на основе графического интерфейса, написанный на языке Python для анализа многомерных данных микроскопии. Важно отметить, что Cell-ACDC предоставляет множество предварительно реализованных и автоматически устанавливаемых (при необходимости) современных моделей для обеих сегментаций (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate и т. д.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26^,^27,28) и слежения (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC и т.д.19,29,30,31,32,33,34). Эти модели дополняются фреймворком для визуализации аннотированных данных и компьютерных ручных корректировок. Кроме того, в рамках той же структуры Cell-ACDC предоставляет модуль для каждого этапа конвейера анализа изображений, автоматически заботясь об обработке, обработке и сохранении данных (рис. 1). В частности, он позволяет пользователю выполнять сегментацию экземпляров (например, отдельных клеток), отслеживание объектов, аннотацию состояний клеток (например, стадию клеточного цикла) и различные формы количественной оценки, включая анализ доступных каналов флуоресценции.

Одним из основных преимуществ Cell-ACDC является анализ данных покадровой микроскопии живых клеток, что создает значительные трудности из-за необходимости обеспечения согласованности во временных точках. Несмотря на то, что существует множество моделей для автоматизированной сегментации и отслеживания отдельных клеток, ручная коррекция остается важной для решения сложных биологических вопросов. Cell-ACDC предлагает набор инструментов, специально разработанных для оптимизации процесса коррекции. В него интегрированы интеллектуальные алгоритмы, позволяющие свести к минимуму количество ручных регулировок. Примечательно, что поправки автоматически распространяются на все соответствующие будущие и прошлые кадры, сохраняя целостность данных на протяжении всего анализа. Учитывая модульную конструкцию и растущую пользовательскую базу, постоянное развитие этого программного обеспечения является приоритетом, при этом постоянные усилия сосредоточены на интеграции новых моделей и удовлетворении растущих потребностей сообщества.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Cell-ACDC разработан таким образом, чтобы быть максимально понятным и интуитивно понятным для пользователей без опыта программирования. В основном это достигается за счет разбивки рабочего процесса анализа на более мелкие, простые для понимания шаги и предоставления дополнительной информации с помощью всплывающих подсказок и информационных кнопок. Поскольку Cell-ACDC охватывает широкий спектр шагов, порядок выполнения которых часто не является последовательным, диаграмма принятия решений показана на рисунке 2. В следующем руководстве будет рассмотрен конкретный пример. Шаги 10 и 11 можно использовать для импорта других данных вместо использования предоставленных данных, загруженных на шаге 3.

1. Установка Cell-ACDC

ПРИМЕЧАНИЕ: Cell-ACDC в настоящее время распространяется как пакет Python через Python Package Index (PyPI) и может быть установлен с помощью команды pip install "cellacdc[torch]".

Настройка Miniforge
1. Скачайте установщик с сайта Miniforge (подробности см. в Таблице материалов ).
2. Установите Miniforge: Для Windows запустите загруженный установщик и следуйте инструкциям. Для Mac или Linux откройте терминал и выполните следующую команду:
  curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
3. После завершения установки откройте нужный терминал, следуя приведенным ниже инструкциям:
  1. В Windows нажмите Win + S, введите Miniforge Prompt и нажмите Enter.
  2. Для Mac/Linux: откройте приложение «Терминал».
Управляйте виртуальной средой.
1. В командной строке введите следующую команду, чтобы создать виртуальную среду. Затем нажмите клавишу Enter для выполнения команды.
  conda create -y -n acdc python=3.12
2. Активируйте среду, выполнив:
  Conda Activate ACDC
Установка
1. Когда среда активна, установите Cell-ACDC, выполнив следующую команду:
  pip install "cellacdc[torch]"
2. После установки запустите Cell-ACDC -y , чтобы дать программе завершить настройку.

2. Работающий Cell-ACDC

Откройте правильный терминал (см. шаг 1.1.3).
Активируйте окружение, выполнив команду:
Conda Activate ACDC
Запустите Cell-ACDC, выполнив следующую команду:
Ячейка-ACDC

3. Загрузка образцов данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры данных будут загружены в "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" в Windows и в "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" в MacOS и Linux. Если приветственное руководство не отображается, выберите Help > Welcome Guide (рисунок 3B) в строке меню главного окна запуска Cell-ACDC (рисунок 1), .

Выберите Загрузить и протестировать с помощью примера интервальной съемки (рис. 3B).
Дождитесь завершения загрузки.
Нажмите «Нет», чтобы остановить загрузку данных непосредственно в графический интерфейс.

4. Модуль подготовки данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть выровнены перед сегментацией, а также могут быть выбраны области интереса (ROI). Эти действия являются необязательными, но полезными, если поле зрения со временем смещается или если интерес представляют только части данных соответственно.

Нажмите на кнопку Запустить модуль подготовки данных... в главном окне, чтобы открыть модуль подготовки данных (Рисунок 1A, Модуль предварительной обработки данных).
Выберите папку с данными.
1. Нажмите на значок папки на панели инструментов нового окна, чтобы загрузить данные микроскопии (рисунок 4A).
2. Выберите папку с данными, затем подтвердите выбор, нажав кнопку «Выбрать папку».
Выберите канал для процесса выравнивания с помощью раскрывающегося меню для выбора канала phase_contr . Затем нажмите Ok , чтобы подтвердить выбор (Рисунок 4B).
Нажмите Ok для подтверждения свойств изображения (рис. 4C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы работаете с данными z-стека, но для сегментации необходимо использовать только один срез, выберите подходящий z-срез с помощью ползунка. При необходимости используйте кнопки на панели инструментов, чтобы применить выделение к другим кадрам.
Запустите процесс выравнивания.
1. Нажмите кнопку «Пуск », которая также находится на панели инструментов (рисунок 5A).
2. Нажмите кнопку Да , чтобы начать процесс выравнивания.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите Нет , чтобы пропустить выравнивание.
3. Нажмите Ok, чтобы подтвердить, что информация о заполнении была подтверждена.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание может занять некоторое время, в зависимости от размера данных.
4. Нажмите Ok, чтобы завершить выравнивание после завершения процесса.
Установите ROI и фоновые ROI.
1. Перейдите к последнему кадру видео сегментации с помощью ползунка выбора кадров в нижней части графического интерфейса подготовки данных.
2. Настройте автоматически добавленный ROI фона, перетащив его по изображению или изменив его размер с помощью ромбов. Убедитесь, что в фоновом ROI нет ячеек. Оставьте ROI как есть (рисунок 5B).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить дополнительные ROI, нажмите кнопку «Добавить ROI обрезки » (расположенную на панели инструментов) и выберите их в просмотрщике. Как правило, ROI должен быть как можно меньше, но при этом охватывать все интересующие ячейки в соответствующих кадрах. Тем не менее, для обеспечения воспроизводимости в рамках этого протокола рекомендуется не модифицировать его.
Чтобы обрезать выбранные ROI в новые файлы изображений, нажмите крайнюю левую кнопку «Обрезать ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным. Если обрезанные изображения не нужны, окно можно закрыть. Координаты всех ROI и фоновых ROI сохраняются автоматически и могут быть использованы позже для сегментации. Если ROI не был изменен, эти кнопки ничего не сделают. Параметры обрезки включают направления XY, z-срезы или определенные временные диапазоны. Каждая кнопка помечена размерами, которые будут обрезаны.
Сохранение выровненных данных
1. Закройте окно с помощью кнопки «Закрыть окно» (например, с помощью крестика в правом верхнем углу в Windows или красной точки в левом верхнем углу в macOS или Linux).
2. Нажмите Да, сохранить выровненные данные, чтобы сохранить выровненные данные.
3. Нажмите Да, сохранить выровненные данные еще раз для подтверждения.
Сохраните обрезанные данные, если шаг 4.7 не был пропущен и ROI не был изменен.
1. Выберите Да, сохранить обрезанные данные, чтобы сохранить обрезанные данные.
2. Нажмите Да, обрезать пожалуйста, чтобы подтвердить сохранение урожая.
3. Нажмите «ОК», чтобы подтвердить путь к папке по умолчанию.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите другую папку, чтобы сохранить необрезанные данные.
4. Выберите Да, перезаписать, чтобы подтвердить, использовался ли путь по умолчанию ранее.
5. Нажмите Ok для подтверждения после завершения процесса.

5. Поиск оптимальной модели и параметров для сегментации

ПРИМЕЧАНИЕ: Cell-ACDC предлагает графический интерфейс пользователя с обратной связью в режиме реального времени для поиска наилучших параметров сегментации (Рисунок 6). Как правило, эти модели предоставляются третьими лицами, каждая из которых имеет свою документацию. Пользователь несет ответственность за определение наилучшей модели сегментации и ее оптимальных параметров, а для получения дополнительной информации пользователи должны ознакомиться с документацией соответствующей модели, которую они используют.

Нажмите на кнопку Запустить графический интерфейс... в главном окне (Рисунок 1A, Визуализация и коррекция модуля).
Загрузите образец данных.
1. Нажмите на значок папки на панели инструментов нового окна, чтобы открыть меню выбора папки.
2. Выберите папку, содержащую данные, затем нажмите «Выбрать папку », чтобы подтвердить выбор.
Выберите канал для визуализации. В раскрывающемся меню выберите phase_contr канала для сегментации, а затем нажмите «ОК » для подтверждения.
Завершите загрузку данных.
1. Нажмите Ok, чтобы подтвердить имя маски сегментации по умолчанию.
2. Нажмите Ok для загруженных позиций, чтобы подтвердить свойства изображения.
3. Выберите Нет , чтобы предотвратить загрузку дополнительных данных флуоресценции.
В селекторе режимов (рисунок 6, "Выбор режима") выберите режим Сегментация и отслеживание.
Найдите лучшие настройки предварительной обработки.
1. Перейдите в раздел Изображение > Предварительная обработка... в верхней строке меню, чтобы открыть окно пользовательской предварительной обработки (рисунок 7A).
2. Выберите «Удалить горячие пиксели » или другой требуемый шаг предварительной обработки в раскрывающемся меню.
3. Используйте значок шестеренки для инициализации и изменения настроек шага. Используйте кнопку info для отображения информации о шаге и доступных параметрах. Оставьте настройки без изменений.
4. Используйте значок плюса , чтобы добавить еще один шаг.
5. Выберите «Изменить масштаб интенсивности » и подтвердите настройки, повторив шаги 5.6.1 и 5.6.2.
6. Установите флажок предварительного просмотра , чтобы увидеть результаты действий в режиме реального времени.
7. Нажмите кнопку «Применить ко всем кадрам» (рис. 7B).
8. Нажмите кнопку Сохранить предварительно обработанные данные, чтобы начать процесс сохранения.
9. Нажмите Ok, чтобы подтвердить имя по умолчанию.
10. Закройте окно Рецепт предварительной обработки .
Найдите лучшие настройки сегментации.
1. Выберите Сегмент > Сегментировать отображаемый кадр на верхней ленте, затем выберите YeaZ_v2 (рис. 8A).
2. Нажмите Ok, чтобы загрузить YeaZ_v2 если будет предложено.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка может занять несколько минут. Прогресс отображается в окне консоли. Не закрывайте графический интерфейс во время загрузки, даже если он не отвечает.
3. Оставьте параметры по умолчанию без изменений.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство параметров имеют информационные кнопки, которые предоставляют подробные инструкции.
4. Включите постобработку, установив флажок Параметры сегментации постобработки (рис. 8B).
5. Примите параметры, нажав Ok.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация может занять некоторое время, в зависимости от сложности модели, размера изображения и технических характеристик компьютера. В частности, Cellpose версии 4 может быть очень медленным.
6. Если вам будет предложено активировать автоматическую сегментацию, выберите Нет.
7. Убедитесь, что сегментация работает хорошо.
8. Повторите шаг 5.7.1, чтобы снова открыть параметры сегментации.
9. Если результаты сегментации соответствуют ожидаемым, нажмите Сохранить все параметры в файл рецепта. В противном случае измените параметры сегментации и повторите шаги с 5.7.4 по 5.7.8.
10. Используйте текстовый ввод , чтобы дать рецепту сегментации название теста.
11. Нажмите Ok, чтобы принять имя.
12. Нажмите Ok, чтобы завершить сохранение рабочего процесса.
13. Закройте экран выбора параметров.
Закрытие окна графического интерфейса пользователя
1. Закройте окно с графическим интерфейсом.
2. Нажмите Нет , чтобы не сохранять перед закрытием.

6. Сегментация и отслеживание (пакетная обработка)

Нажмите на кнопку Запустить модуль сегментации... в главном окне (Рисунок 1A, модуль "Сегментация и отслеживание").
1. Выберите образец данных. Используйте селектор папок Cell-ACDC, чтобы выбрать папку, содержащую данные, затем нажмите Select Folder для подтверждения выбора.
Выберите параметры для пакетной обработки.
1. Выберите phase_contr_preprocessed канала в качестве канала для сегментации. Нажмите Ok для подтверждения выбора.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые модели используют дополнительный канал в качестве входа. Этот канал в дальнейшем может быть выбран при настройке других параметров сегментации.
2. Подтвердите свойства изображения, нажав Ok.
Задайте параметры модели сегментации.
1. Выберите YeaZ_v2 в качестве модели, которая должна использоваться для сегментации, затем подтвердите выбор, нажав кнопку ОК.
2. Нажмите кнопку Загрузить сохраненный рецепт..., чтобы загрузить ранее сохраненный рецепт.
3. Выберите segmentation_recipe_test.ini из списка, затем подтвердите выбор, нажав «ОК».
4. Закройте сообщение об успешной загрузке, нажав клавишу «ОК».
5. Подтвердите параметры, нажав Ok.
Подтвердите другие настройки сегментации.
1. Нажмите Ok, чтобы принять имя по умолчанию для файла сегментации.
2. Выберите Нет , чтобы подтвердить, что все изображение должно быть сегментировано.
3. Нажмите кнопку «ОК», чтобы установить стоп-кадр в качестве последнего кадра таймлапса.
Установите настройки отслеживания. Выберите YeaZ в качестве используемого метода отслеживания, затем подтвердите выбор, нажав Ok.
Запустите процедуру сегментации и отслеживания.
1. Нажмите кнопку Запустить сейчас, чтобы запустить конвейер сегментации и отслеживания.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько часов в зависимости от размера изображения, сложности модели и технических характеристик компьютера. В тестовых прогонах сегментация тестовых данных с помощью YeaZ_v2 занимала примерно 2 минуты на устройстве без графического процессора.
2. Нажмите Ok, чтобы завершить сегментацию.

7. Исправление ошибок сегментации и отслеживания

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ячейки, отсутствующие в текущем кадре по сравнению с предыдущим, обозначаются желтым контуром и идентификатором. Вновь обнаруженные ячейки отображаются с красным идентификатором и толстым контуром. Ячейки, которые были признаны потерянными, отображаются зеленым контуром и идентификатором.

Нажмите на кнопку Запустить графический интерфейс... в главном окне (Рисунок 1A, модуль "Визуализация и коррекция").
Загрузите образец данных.
1. Нажмите на значок папки на панели инструментов в новом окне.
2. Выберите папку, содержащую данные, затем нажмите «Выбрать папку », чтобы подтвердить выбор.
Выберите канал для визуализации. В раскрывающемся меню выберите phase_contr_preprocessed канала, затем нажмите «ОК » для подтверждения.
Выберите имя маски сегментации. Выберите Загрузить выбранный , чтобы загрузить файл сегментации, созданный на предыдущем шаге.
Завершите процесс загрузки данных.
1. Подтвердите свойства изображения, нажав Ok для загруженных позиций.
2. Выберите Нет , чтобы предотвратить загрузку дополнительных данных флуоресценции.
Используйте селектор режимов (рисунок 6, "Выбор режима") для выбора режима сегментации и отслеживания .
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флажки в нижней части графического интерфейса для изменения отображаемых аннотаций. На левом и правом изображениях могут отображаться разные аннотации.
Выберите трекер в реальном времени. В строке меню (Рисунок 6, "Строка меню") перейдите в раздел Отслеживание > Выберите алгоритм слежения в реальном времени и выберите нужный трекер в реальном времени. Используйте Cell-ACDC или Cell-ACDC 2 steps для почковающихся дрожжей или симметричное деление Cell-ACDC для других организмов.
Корректируйте сегментацию и отслеживание.
1. Используйте клавиши со стрелками влево и вправо для перехода между кадрами.
2. Перейдите к кадру 10.
3. Нажмите клавишу S , чтобы активировать ручной инструмент для отделения шишек.
4. Используйте щелчок правой кнопкой мыши, чтобы автоматически разделить маску сегментации ячейки 1.
5. Перейдите к кадру 14.
6. Нажмите клавишу B , чтобы активировать щетку.
7. Нарисуйте недостающую маску сегментации для бутона с помощью левой кнопки мыши.
8. Пройдитесь по последующим кадрам, исправляя ошибки сегментации и отслеживания. Используйте доступные инструменты (Рисунок 6, "Панель инструментов редактирования"). Исправляйте хотя бы до 42 кадра.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство инструментов имеют всплывающую подсказку, объясняющую их функциональность. Наведите указатель мыши на средство, чтобы отобразить подсказку.

8. Аннотации клеточного цикла

ПРИМЕЧАНИЕ: Переходите к этому шагу только после завершения сегментации и коррекции отслеживания для всех интересующих кадров. Используйте правильный режим аннотации в зависимости от типа деления клетки (симметричный, например, клетки млекопитающих, или асимметричный, например, почковающиеся дрожжи). Образец данных см. в разделе «Асимметрично делящиеся клетки», шаг 8.1. В шаге 8.2 описан общий рабочий процесс для симметричных делений клеток.

Асимметрично делящиеся клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для таких организмов, как почковающиеся дрожжи, почки могут быть отнесены к матерям. Оба объекта должны присутствовать в одном кадре. По умолчанию отображается ожидаемая стадия клеточного цикла на основе аннотаций для почковающихся дрожжей. Стадия клеточного цикла бутонов отображается красным цветом, в то время как стадия клеточного цикла всех остальных объектов отображается белым. Матери соединены со своими бутонами пунктирной желтой линией.
1. Активируйте функцию Анализ клеточного цикла с помощью переключателя режимов (Рисунок 6, "Выбор режима").
2. Выберите Да, перейдите к кадру 1 при появлении запроса.
3. Используйте клавиши со стрелками влево и вправо для перехода между кадрами.
4. Перейдите к кадру 41. Нажмите кнопку ОК, чтобы согласиться на инициализацию таблицы аннотаций цикла ячеек при появлении соответствующего запроса.
5. Щелкните правой кнопкой мыши по ячейке 1 или ее бутону, чтобы отделить соединение и аннотировать событие деления клетки.
6. Продолжайте до тех пор, пока не будут просмотрены все соответствующие кадры. Исправьте ошибки в автоматическом назначении материнских бутонов с помощью доступных инструментов (Рисунок 6, "Редактировать панель инструментов").
7. Доступные инструменты
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструменты, за исключением инструмента Break/Rebind Mother-Bud Association , могут быть активированы с помощью настраиваемого сочетания клавиш или нажатием соответствующих кнопок на панели инструментов.
  1. Назначить бутон матери (А): активируйте инструмент Назначить бутон матери . Нажмите и удерживайте правую кнопку мыши на бутоне. Перетащите курсор к соответствующей материнской ячейке и отпустите кнопку мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот инструмент, когда автоматическое назначение бутонов мамам неверно.
  2. Аннотировать неизвестную историю (U): Активируйте инструмент Аннотировать неизвестную историю . Используйте правую кнопку мыши , чтобы щелкнуть по ячейке, которая должна быть помечена как имеющая неизвестную историю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот инструмент для ручного аннотирования ячеек с неизвестной историей, помогая исправить неоднозначности происхождения там, где автоматический вывод недостаточен.
  3. Повторная инициализация аннотации клеточного цикла
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эту опцию для повторного запуска алгоритма аннотации цикла ячейки, начиная с текущего кадра. Это обеспечивает согласованность с последними исправлениями или обновлениями, внесенными в данные сегментации/отслеживания.
  4. Разрыв/повторное связывание связи между матерью и бутоном: Убедитесь, что не выбран другой инструмент. Щелкните правой кнопкой мыши на существующей паре «мать-бутон», чтобы разорвать связь, или щелкните правой кнопкой мыши еще раз, чтобы восстановить соединение.
Симметричные делящиеся клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция находится в стадии бета-тестирования и скоро будет официально выпущена. Существует возможность отнести две или более дочерних клеток к одной материнской клетке. Потенциальные материнские клетки — это клетки, присутствующие в предыдущем кадре, но отсутствующие в текущем, в то время как потенциальные дочерние клетки — это вновь появляющиеся клетки в текущем кадре.
1. Активируйте Нормальное деление: Дерево родословной с помощью селектора режимов (Рисунок 6, "Выбор режима").
2. Выберите Да, перейдите к кадру 1 при появлении запроса.
3. Используйте клавиши со стрелками влево и вправо для перехода между кадрами.
4. Исправьте ошибки в автоматических назначениях матери и дочери с помощью доступных инструментов (Рисунок 6, "Панель редактирования").
5. Допоставляйте изменения при появлении запроса с помощью кнопки Распространить.
6. Доступные инструменты
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эти инструменты можно активировать с помощью ярлыка или соответствующих кнопок на панели инструментов.
  1. Найти мать для нового идентификатора ячейки (F): Активируйте инструмент Найти мать для нового идентификатора ячейки . Щелкните правой кнопкой мыши по новой клетке, чтобы циклически перебрать кандидаты в материнские клетки. Shift + щелчок правой кнопкой мыши для переключения назад по кандидатам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот инструмент для назначения или изменения материнского стержня дочерней ячейки.
  2. Установить неизвестную мать (U): Активируйте инструмент Установить неизвестную мать . Щелкните правой кнопкой мыши по клетке, мать которой неизвестна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот инструмент, чтобы вручную обозначить мать клетки как неизвестную.

9. Сохранение данных

Перейдите к разделу Файл > Сохранить на верхней ленте.
Нажмите Установить измерения..., чтобы выбрать нужные измерения.
Установите флажок рядом с метриками mCitrine или любыми другими нужными измерениями.
Нажмите «ОК» для подтверждения.
Нажмите « Да », чтобы сохранить измерения.
Нажмите Ok, чтобы подтвердить кадр, до которого должны быть сохранены измерения.
Нажмите кнопку «Нет» при появлении запроса на объединение данных.

10. Создание структуры данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе обсуждается подготовка данных микроскопии для сегментации и отслеживания. Это можно пропустить, если используются демонстрационные данные, которые загружаются в разделе "Загрузка образцов данных". Структура данных, которая будет сгенерирована, показана на рисунке 9.

Поместите файл (файлы) микроскопии в пустую папку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживаются такие форматы микроскопии, как .czi (Zeiss), .lif (Leica) и .nd2 (Nikon), а также отдельные файлы .tif и .png.
Нажмите на модуль 0. Создание структуры данных... в главном окне (Рисунок 1A, модуль "Создание структуры данных").
Выберите BioIO или Fiji Macro.
1. Если используется Windows , нажмите «Использовать BioIO», а для пользователей MacOS и Linux выберите «Использовать макрос Fiji».
  ПРИМЕЧАНИЕ: Далее предполагается, что используется Windows.
2. Если вам будет предложено установить BioIO, нажмите Ok для установки.
3. Выберите расположение файлов микроскопии. Выберите вариант, который соответствует расположению файлов микроскопии, с помощью раскрывающегося меню, затем нажмите Ok для подтверждения.
Выбор исходной и целевой папок и стратегии загрузки данных
1. Нажмите «Готово», чтобы подтвердить, что файлы находятся в пустой папке.
2. Используйте селектор папок Cell-ACDC для выбора папки, содержащей файлы.
3. Нажмите кнопку «Выбрать папку», чтобы выбрать папку.
4. Нажмите кнопку «Выбрать папку» еще раз, чтобы выбрать ту же папку, что и папка назначения.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанный файл микроскопии не удаляется.
5. Выберите Да, загрузить всю позицию сразу.
Если появится запрос на установку подпакета BioIO, нажмите Ok для установки.
Задайте метаданные для входного файла.
1. Исправьте метаданные.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Дважды проверьте «Порядок размеров», нажав на маленький значок глаза рядом с полями «Название канала ». Другие метаданные, которые не удалось загрузить из необработанного файла, выделяются.
2. Нажмите Ok для подтверждения метаданных.
3. Нажмите Да , чтобы подтвердить порядок измерений.
Дождитесь окончания процесса.
Нажмите Да , чтобы закрыть окно после завершения процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание структуры данных может занять несколько часов в зависимости от размера данных.

11. Утилиты предварительной обработки данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В главном окне доступно несколько вариантов обработки изображений перед переходом к анализу. Чтобы получить доступ к этим инструментам, перейдите в выпадающее меню «Утилиты » в строке меню главного окна (Рисунок 1B, «Утилиты»), наведите курсор на «Предварительная обработка изображений», а затем выберите вариант, который следует использовать. Вот два примера:

Объединить каналы: используйте этот параметр для объединения двух или более каналов изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, два флуоресцентных канала могут быть усреднены.
Изменение размера изображений: используйте эту команду для уменьшения размера очень больших наборов данных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может значительно ускорить время обработки и во многих случаях практически не влияет на качество сегментации.

12. Устранение неполадок

Если Cell-ACDC дает сбой, создайте отчет об ошибке на странице Cell-ACDC GitHub, перейдя на вкладку «Проблемы » и нажав зеленую кнопку «Новая проблема ». Следуйте предоставленному шаблону, чтобы включить в него все необходимые сведения для диагностики и устранения проблемы. Кроме того, вы можете обратиться за помощью на image.sc форуме, используя тег #cell-acdc , или связаться с одним из авторов, отвечающих за переписку. Во многих случаях, особенно после установки пакета, простой перезапуск программного обеспечения может решить проблему.
Если Cell-ACDC зависает или перестает отвечать, проверьте наличие обновлений прогресса в консоли. Длительное время сегментации, особенно при использовании моделей с интенсивными вычислениями, таких как Cellpose версии 4, или при обработке больших наборов данных, является нормальным явлением. Если Cell-ACDC продолжает не отвечать, обратитесь к шагу 12.1 для получения дальнейших инструкций.
Если автоматическая сегментация неправильно включает фон, проверьте, не привел ли этап предварительной обработки к чрезмерному сглаживанию фона. Многие модели сегментации обучаются на необработанных (не обработанных) изображениях и могут работать плохо, если фону не хватает текстуры.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественное определение объема ядра в опухолевых сфероидах в 3D

Автоматизированная 3D-микроскопия (z-стек) позволяет ученым визуализировать сложные многоклеточные системы, такие как органоиды. Для количественной оценки морфологических и флуоресцентных свойств сигнала на уровне отдельных клеток часто требуется сегментация клеток в 3D. Следующий пример демонстрирует, как Cell-ACDC может сегментировать ядра в органоиды, содержащие тысячи клеток из канала ядерного окрашивания, и количественно оценить их объем (данные из ссылки ⁹). Сегментация была выполнена с использованием пользовательской модели Cellpose, которая была обучена и опубликована в ^Ref.9. Обученную модель Cellpose можно использовать непосредственно в Cell-ACDC, указав путь к файлу весов в графическом интерфейсе при выборе параметров модели для Cellpose v2. Сегментация проводилась с помощью второго модуля Cell-ACDC для пакетной обработки всех изображений (рис. 1A, модуль "Сегментация и отслеживание"). Далее результат был визуализирован в графическом интерфейсе третьего модуля (Рисунок 1A, модуль "Визуализировать и исправить"). Этот модуль был оптимизирован для визуализации тысяч отдельных объектов с несколькими вариантами аннотаций (например, контурами, наложенными масками сегментации или текстовыми идентификаторами). После того, как были рассчитаны измерения с помощью 3D-масок, все доступные измерения были задокументированы непосредственно в графическом интерфейсе. Они доступны, перейдя в верхнюю строку меню (Рисунок 6, "Строка меню"), выбрав меню "Измерения ", а затем "Установить измерения...". Всплывающее диалоговое окно позволяет пользователям получать информацию об измерениях с помощью информационных кнопок и выбирать, какие измерения следует сохранить. Для репрезентативных результатов, показанных на рисунке 10, был использован «cell_vol_fl_3D», который представляет собой объем каждого объекта, рассчитанный путем умножения общего количества вокселей в объекте на квадрат размера пикселя и глубину вокселя. Эти свойства либо автоматически извлекаются из исходного файла микроскопии, либо предоставляются пользователем. Для вычисления измерений из этого графического интерфейса требуется загрузка необработанных изображений. Таким образом, чтобы оптимизировать процесс и обеспечить пакетную обработку, измерения также можно вычислить в меню «Утилиты » (рисунок 1B, «Утилиты»), перейдя в подменю «Измерения », а затем «Вычислить измерения для одного или нескольких экспериментов». Наконец, распределение ядерного объема было построено в виде репрезентативного результата (рис. 10). Этот анализ выявляет значительную долю малых ядер, вероятно, из-за артефактов сегментации. Их можно легко удалить, отфильтровав мелкие объекты из маски сегментации. В то же время, очень большие ядра могут быть обусловлены слиянием ядер во время сегментации. Всегда рекомендуется строить график объемного распределения объектов (например, отдельных клеток) для выявления артефактов и извлечения дополнительной биологической информации о размере клеток.

Количественная оценка данных покадровой микроскопии

С помощью покадровой микроскопии клеточную динамику можно непосредственно наблюдать на уровне отдельных клеток. Помимо сегментации клеток, извлечение временной динамики требует дополнительного анализа, включая отслеживание клеток и аннотацию родословной клеток. Из-за взаимозависимости этих этапов анализа ошибки, допущенные на ранних этапах конвейера, могут распространиться на более поздние этапы. В связи с этим необходимо постоянно визуализировать и исправлять ошибки сегментации, отслеживания и аннотации. Ниже приведено доказательство того, что Cell-ACDC подходит для решения этих задач. Были выбраны два набора данных двух различных модельных организмов: 1) почковающиеся дрожжи (штамм DCY001-1 из ^Ref.35, где два белка гистона H2B, Htb1 и Htb2, помечены mCitrine) и 2) эмбриональные стволовые клетки мыши (mESCs, данные из ^Ref.22).

Эти два набора данных выделяют два режима аннотации, доступные в Cell-ACDC: асимметричный и симметричный (т. е. симметричный цитокинез, или «нормальный») деление клеток. Поскольку способ деления различается, эти два организма требуют разной системы отслеживания и аннотации.

При асимметричном делении материнская клетка образует бутон, который растет и в конечном итоге отделяется, становясь дочерней клеткой. После деления материнская клетка сохраняет свой исходный идентификатор клетки, и ее номер поколения увеличивается на единицу, в то время как дочерней клетке присваивается новый идентификатор клетки, а ее номер поколения устанавливается равным единице. Фаза почкования соответствует фазам S/G2/M клеточного цикла и аннотируется как таковая в Cell-ACDC. Эти варианты аннотаций помогают ответить на типичные биологические вопросы, связанные с клеточным циклом в почковающихся дрожжах.

В случае «симметричного» деления (например, в клетках млекопитающих) материнская клетка делится на две дочерние клетки. Материнская клетка, т.е. ее идентификатор, исчезает при делении, а две дочерние клетки получают новые идентификаторы. Кроме того, число поколений дочерних клеток увеличивается на единицу относительно материнской клетки. Cell-ACDC также отслеживает родительский ID, корневой ID (исходная родительская ячейка в начале линии) и сестринский ID.

Для обоих режимов аннотаций была разработана инновационная среда для исправления ошибок аннотаций, при которой поправка автоматически распространяется на все прошлые и будущие соответствующие временные точки. Визуализация, аннотация и коррекция выполнялись в графическом интерфейсе третьего модуля (Рисунок 1A, модуль "Визуализация и коррекция" и Рисунок 6). Для сегментации и отслеживания клеток в наборе данных 1 модель YeaZ_v2²⁶ была применена к фазово-контрастному каналу, а для ядерного (гистонового) канала использовалась модель StarDist²⁵ . Затем, используя утилиту «Отслеживание» и «Происхождение > Отслеживание и/или подсчет субклеточных объектов (рис. 1B, строка меню «Утилиты »), Cell-ACDC присвоил каждому ядру идентификатор соответствующей клетки, обеспечив согласованность между таблицами, сгенерированными из масок клеток и ядер.

Для набора данных 2 использовалась модель сегментации DeepSea²² . Все три модели уже доступны в Cell-ACDC, демонстрируя преимущество интеграции нескольких моделей сегментации в программное обеспечение.

После того, как были исправлены ошибки сегментации и отслеживания, родословные клеток были аннотированы, вычислены числовые признаки, а затем был проведен анализ. Для набора данных 1 TaYFP_amount_autoBkgr столбца и количество сегментированных ядер (рис. 11A) были построены в зависимости от времени. «TaYFP» — это название ядерного канала. «amount_autoBkgr» является косвенным показателем общего количества клеточного белка, извлеченного из эпифлуоресцентных изображений³⁶. Он рассчитывается как разница между средней интенсивностью флуоресценции в каждой маске ячейки и фоновой медианой, умноженная на площадь клетки (в пикселях). Здесь медиана фона вычисляется из всех пикселей, которые не сегментированы как ячейки. Как и ожидалось, количество H2B начинает увеличиваться при появлении почек (рисунок 11A-ii) и достигает постоянного значения перед делением ядра (рисунок 11A-iii). Это важный фактор контроля качества в гомеостазе гистоновых белков, так как ожидается, что количество гистоновых белков будет зависеть от клеточного цикла. Кроме того, построение графика количества ядер с течением времени подтверждает, что количество белка гистона достигает максимума примерно в районе деления ядра.

Для набора данных 2 была построена диаграмма площади клеток с течением времени для выбранной клетки, подвергающейся делению. Как и ожидалось, площадь клеток увеличивается до достижения максимального значения (рисунок 11B-i). Затем он уменьшается до тех пор, пока клетка не будет делиться (рис. 11B-ii) по мере того, как клетка сокращается. Наконец, цикл возобновляется для двух дочерних клеток. Это еще один рекомендуемый анализ, поскольку проверка изменений размера клеток в течение клеточного цикла имеет важное значение для подтверждения того, что клетки растут и делятся так, как ожидалось (или нет в случае конкретных мутантов).

figure-results-1
Рисунок 1: Модули Cell-ACDC. (A) Обзор 4 основных модулей, которые могут быть запущены с основной пусковой установки Cell-ACDC. После сегментации, отслеживания и аннотирования данных микроскопии числовые характеристики могут быть вычислены либо из третьего модуля («Визуализация и коррекция»), либо из меню «Утилиты» в верхней строке меню (B). «Утилиты» — это подпрограммы, которые могут автоматически запускаться на нескольких наборах данных без ввода данных пользователем. Помимо вычисления измерений, другие утилиты включают объединение нескольких выходных таблиц в одну таблицу, отслеживание субклеточных объектов и предварительную обработку изображений. Cell-ACDC поддерживает 2D, 3D (z-стек или интервальная съемка) и 4D данные (z-стек во времени) с любым количеством дополнительных каналов. Выходная таблица с числовыми признаками может быть затем использована для последующего анализа и биологических открытий (рис. 10 и рис. 11). Для этого на странице GitHub Cell-ACDC доступны записные книжки Jupyter, которые включают примеры графиков, которые можно получить из выходной таблицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Блок-схема принятия решений Cell-ACDC. Блок-схема с описанием модуля, используемого в зависимости от типа набора данных и требований к анализу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Загрузка примеров данных. (a) Откройте Welcome Guide. (B) Загрузите пример данных, необходимых для репликации протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Загрузка данных для подготовки данных. (A) Загрузите данные в графический интерфейс подготовки данных. (B) Выберите канал для загрузки. (C) Редактирование и подтверждение метаданных изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Запуск процесса подготовки данных. (А) Начните процесс. (B) Позиционные ROI (для обрезки) и фоновые ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Третий модуль графического интерфейса для визуализации и коррекции результатов. Скриншот третьего графического интерфейса модуля («Визуализировать и исправить» на рисунке 1A) с выделенными элементами. Обратите внимание, что большинство кнопок на панелях инструментов имеют всплывающую подсказку (доступную при наведении курсора мыши на кнопку), объясняющую, как использовать эту конкретную функцию. С помощью селектора режимов можно переключаться между 5 режимами: "Просмотрщик", "Сегментация и отслеживание", "Анализ клеточного цикла" (для асимметрично делящихся клеток), "Нормальное деление: Дерево родословной" (для симметрично делящихся клеток, например, клеток млекопитающих) и "Пользовательские аннотации". Обратите внимание, что панель инструментов или строка меню часто присутствуют в других графических интерфейсах (например, в модуле "Предварительная обработка данных", рисунок 1). Панель инструментов «Правка » содержит все функции, которые можно использовать для редактирования и исправления ошибок сегментации и отслеживания (например, кисть, ластик, идентификатор редактирования и т. д.). Загруженное изображение отображается в двухпанельном виде, что полезно, когда требуются различные варианты аннотаций (например, информация о цикле ячеек на левом изображении и идентификаторы на правом изображении). Правое изображение также можно отключить (щелкните правой кнопкой мыши изображение и снимите флажок «Показать зеркальное изображение»). На каждой панели изображения есть ползунок LUT сбоку для быстрой настройки уровней интенсивности. Щелкнув правой кнопкой мыши элемент управления LUT, пользователь может выбрать различные цветовые карты для изображений интенсивности. Кроме того, с правой стороны находится селектор LUT для наложения цвета меток сегментации на изображения интенсивности (опция аннотации называется Segm. masks). Слева от опций аннотации к левому изображению есть дополнительные переключатели для управления некоторыми настройками, такими как автосохранение, размер шрифта и т. д. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Визуализируйте предварительную обработку в основном графическом интерфейсе. (A) Откройте диалоговое окно предварительной обработки. (B) Диалог предварительной обработки с параметрами, используемыми в инициализированном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: Визуализируйте результаты сегментации в основном графическом интерфейсе. (A) Выберите модель сегментации. (B) Настройте параметры сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Структура папок, требуемая Cell-ACDC. Для работы с Cell-ACDC данные должны быть расположены в определенной структуре папок. Хотя Cell-ACDC предоставляет модуль для автоматической генерации этой структуры, важно понимать, как эта структура должна выглядеть. Во-первых, все файлы должны находиться в папке под названием «Изображения». Далее все они должны начинаться с одного и того же названия, так называемого «basename_». Минимальный набор необходимых файлов — это одноканальный файл TIFF (2D, 3D z-stack или 3D+time) и CSV-файл, оканчивающийся на «_metadata.csv». Этот файл должен быть таблицей с двумя столбцами, первый из которых называется Description , а второй столбец — values, и он должен содержать по крайней мере записи для SizeT и SizeZ для количества кадров и z-срезов соответственно. Если файл изображения не содержит z-срезов, для параметра SizeZ необходимо установить значение 1. То же самое верно и для отсутствующих цейтраферных изображений, где SizeT должен быть равен 1. Будучи файлом CSV, запись представляет собой одну строку Description,value, разделенную запятой, например, SizeZ,1. Для нескольких каналов необходимо создать один файл TIFF на канал. Затем папка «Изображения » должна быть помещена в папку с именем «Position_1». Допускается несколько позиций, и они должны быть названы последовательным номером. При загрузке данных в любой из модулей Cell-ACDC пользователь может выбрать либо конкретную папку Position, либо всю папку эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 10: 3D-количественное определение опухолевых органоидов. Скриншот репрезентативного опухолевого органоида (данные из⁹), загруженного в графический интерфейс третьего модуля Cell-ACDC (слева), пример z-срезов с красными контурами, выделяющими маски сегментации (в центре), и гистограмма распределения объема клетки, рассчитанная по 3D-маскам сегментации (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11
Рисунок 11: Количественная оценка данных покадровой микроскопии. (A) Скриншот данных покадровой микроскопии почковающихся дрожжевых клеток, загруженных в третий модуль графического интерфейса Cell-ACDC (слева), и количественного определения количества белка гистона H2B с течением времени в репрезентативном клеточном цикле (справа). На увеличенных изображениях показан пример клетки и ее почки (белые стрелки) в начале клеточного цикла (i), при появлении почки (ii) и при делении ядра (iii). Данные взяты из Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Скриншот данных покадровой микроскопии эмбриональных стволовых клеток мыши, загруженных в третий модуль графического интерфейса Cell-ACDC (слева) и площади клетки (μm²), построенных в зависимости от времени репрезентативной клетки, подвергающейся делению клетки. Увеличенные изображения показывают пример клетки и ее дочерних элементов на максимальной площади клетки до деления (i), деления на две дочерние клетки (ii) и последнего анализируемого кадра после деления (iii). Данные взяты из Zargari et ^al.22,33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ данных многомерной микроскопии часто требует использования передовых моделей на основе искусственного интеллекта. Тем не менее, эти инструменты разрабатываются быстро и имеют значительный барьер для внедрения. Кроме того, биологам часто требуется визуализация результата для эффективной коррекции ошибок. В этой статье показано, как ученые могут использовать Cell-ACDC для решения этих проблем.

Важнейшим этапом представленного протокола является выбор оптимальной модели сегментации. Cell-ACDC включает в себя графический интерфейс, позволяющий осуществлять визуальный выбор (Рисунок 1A, модуль «Визуализация и коррекция»). Также предоставляются инструменты для подготовки данных и пакетной обработки нескольких наборов данных (рис. 1A, Создание структуры данных, Предварительная обработка данных, Сегментация и отслеживание модулей и Утилиты). Пользователям рекомендуется сообщать о проблемах и оставлять отзывы на форуме image.sc (используя тег #cell-acdc) или открывая проблему на странице Cell-ACDC на GitHub.

В то время как Cell-ACDC уже использовался на относительно больших данных, таких как сфероиды на изображениях с тысячами ядер⁹ или покадровые данные почковающихся дрожжей с сотнями клеток на кадр, программа должна загрузить все одноканальные данные в оперативную память для правильной работы. Для обеспечения стабильной производительности рекомендуется примерно в три раза увеличить размер файла изображения в доступной памяти. В настоящее время наборы данных, превышающие доступную системную память, не могут быть обработаны, но планируется поддержка внеядерной (ленивой) загрузки через интеграцию OME-Zarr³⁷.

В настоящее время одним из основных ограничений Cell-ACDC является частичная поддержка наборов данных 3D+time, поскольку большинство инструментов были разработаны либо для 3D z-stack, либо для данных 2D+time. Следовательно, будущие версии Cell-ACDC расширят его возможности за счет полной поддержки данных 3D+time. Кроме того, мы работаем над расширением структуры аннотации клеточной родословной для «симметрично» делящихся клеток (например, клеток млекопитающих), которые представляют собой те клетки, в которых материнская клетка делится на две дочерние клетки (в отличие от почковающихся дрожжей, где материнская клетка один раз за клеточный цикл дает начало одной дочерней клетке путем почкования). Наконец, на данный момент Cell-ACDC ограничен данными, одноканальные данные которых полностью помещаются в оперативную память. Поэтому мы планируем реализовать отложенную загрузку, о чем говорилось выше.

С момента своего выпуска Cell-ACDC постоянно совершенствовался, например, за счет добавления новых моделей сегментации и отслеживания, новых структур аннотаций (например, для клеток млекопитающих, которые в настоящее время находятся в стадии бета-тестирования) и различных улучшений производительности. Благодаря этим разработкам ученые смогли использовать Cell-ACDC для ускорения исследований и обеспечения научных открытий 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,⁴⁹. Что делает эту программную среду уникальной по сравнению с существующими методами 14,27,50,51, так это ее способность использовать и дополнять существующие модели, тем самым извлекая выгоду из разработок сообщества. Ведется активная работа над Cell-ACDC, чтобы сделать его эталоном для анализа многомерных данных микроскопии.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Марио Витаколонну и Рудольфа Рюдигера за то, что поделились данными о сфероидах на рисунке 10, а также коллег из Института функциональной эпигенетики Паскаля Фальтер-Брауна и Карстена Марра за ценные дискуссии. Особая благодарность нескольким пользователям, которые оставили бесценные отзывы, протестировали новые функции и терпеливо сообщали о проблемах. Эта работа была профинансирована Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) через проект 416098229, Ассоциацию Гельмгольца и совместную исследовательскую школу Мюнхенской школы науки о данных.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
МЛАДЕНЕЦ	Джулиан Питч	10.7554/eLife.79812	Программное обеспечение для сегментации и отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
Байесовский трекер	Кристина Уликна	10.3389/fcomp.2021.734559	Программное обеспечение отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
Cell-ACDC	Франческо Падовани	10.1186/s12915-022-01372-6	Программное обеспечение
Ядра зародышевой линии клетки клетки	Кристина Пинтильда; eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana авка	10.17912/MICROPUB. БИОЛОГИЯ.001062	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
Cellpose версия 2	Карсен Стрингер	10.1038/s41592-020-01018-x	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
Cellpose версия 3	Карсен Стрингер	10.1038/s41592-025-02595-5	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
Cellpose версии 4 (Cellpose-SAM)	Marius Пахитариу	10.1101/2025.04.28.651001	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
Компьютер	-	-	См. рекомендуемые характеристики ниже
Компьютер — процессор	Любой	-	Рекомендуемое минимум 4 ядра, 2,5 ГГц/nbsp;
Компьютер — GPU	Nvidia (предпочтительно)	-	(По желанию) Рекомендуемый минимум 8 ГБ VRAM
Компьютер — место на жёстком диске	Любой	-	4 ГБ + 3 x размер микроскопического файла
Компьютер — операционная система	Microsoft, Apple и другие	-	Поддерживаются Windows, MacOS и Linux
Компьютер — оперативная память	Любой	-	3 x размера файла в одной позиции, минимум 16 ГБ
DeepSea	Abolfazl Заргари	10.1016/j.crmeth.2023.100500	Программное обеспечение для сегментации и отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
DeLTA	Жан-Батист Лугань / Оуэн М. О' Коннор	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	Программное обеспечение для сегментации и отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
InstanSeg	Тибо Голдсборо	10.48550/arXiv.2408.15954	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Ссылка для скачивания установщика с сайта Miniforge: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Кевин Катлер	10.1038/s41592-022-01639-4	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
pomBseen	Макото Охира	10.1371/journal.pone.0291391	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
SAM (Модель сегмента всего)	Александр Кириллов	10.48550/arXiv.2304.02643	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
StarDist	Уве Шмидт / Мартин Вайгерт	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
ТАПИР	Карл Дёрш	10.48550/arXiv.2306.08637	Программное обеспечение отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
Trackastra	Бенджамин Галлюссер	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	Программное обеспечение отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
Trackpy	Дэниел Аллан	10.5281/zenodo.1213240	Программное обеспечение отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC
YeastMate	Дэвид Банк	10.1093/биоинформатика/BTAC107	Программное обеспечение сегментации, по желанию, может устанавливаться автоматически с помощью Cell-ACDC
YeaZ	Никола Дитлер	10.1038/s41467-020-19557-4	Программное обеспечение для сегментации и отслеживания, по желанию, может быть автоматически установлено с помощью Cell-ACDC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cuny, A. P., Schlottmann, F. P., Ewald, J. C., Pelet, S., Schmoller, K. M. Live cell microscopy: from image to insight. Biophys Rev. 3, 021302(2022).
Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
Tavakoli, M. R., et al. Light-microscopy-based connectomic reconstruction of mammalian brain tissue. Nature. 642, 398-410 (2025).
Seal, S., et al. Cell painting: a decade of discovery and innovation in cellular imaging. Nat Methods. 22, 254-268 (2025).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47, 124-135 (2022).
Al-Refaie, N., et al. Fasting shapes chromatin architecture through an mTOR/RNA Pol I axis. Nat Cell Biol. 26, 1903-1917 (2024).
Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
Ko, J., Hyung, S., Cheong, S., Chung, Y., Li Jeon, N. Revealing the clinical potential of high-resolution organoids. Adv Drug Deliv Rev. 207, 115202(2024).
Vitacolonna, M., et al. A multiparametric analysis including single-cell and subcellular feature assessment reveals differential behavior of spheroid cultures on distinct ultra-low attachment plate types. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1422235(2024).
Qian, N., Weinstein, J. A. Spatial transcriptomic imaging of an intact organism using volumetric DNA microscopy. Nat Biotechnol. , (2025).
Wallace, C. T., St. Croix, C. M., Watkins, S. C. Data management and archiving in a large microscopy-and-imaging, multi-user facility: microscopy and data management. Mol Reprod Dev. 82, 630-634 (2015).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , (2025).
Padovani, F., Mairhörmann, B., Falter-Braun, P., Lengefeld, J., Schmoller, K. M. Segmentation, tracking and cell cycle analysis of live-cell imaging data with Cell-ACDC. BMC Biol. 20, 174(2022).
Piñeiro López, C., Rodrigues Neves, A. R., Čavka, I., Gros, O. J., Köhler, S. Segmentation of C. elegans germline nuclei. microPubl Biol. , (2023).
Ohira, M., Rhind, N. pomBseen: an automated pipeline for analysis of fission yeast images. PLoS One. 18, e0291391(2023).
Goldsborough, T., et al. InstanSeg: an embedding-based instance segmentation algorithm optimized for accurate, efficient and portable cell segmentation. arXiv. , (2024).
Pietsch, J. M., et al. Determining growth rates from bright-field images of budding cells through identifying overlaps. Elife. 12, e79812(2023).
Bunk, D., et al. YeastMate: neural network-assisted segmentation of mating and budding events in Saccharomyces cerevisiae. Bioinformatics. 38, 2667-2669 (2022).
Cutler, K. J., et al. Omnipose: a high-precision morphology-independent solution for bacterial cell segmentation. Nat Methods. 19, 1438-1448 (2022).
Zargari, A., et al. DeepSea is an efficient deep-learning model for single-cell segmentation and tracking in time-lapse microscopy. Cell Rep Methods. 3, 100500(2023).
Lugagne, J. B., Lin, H., Dunlop, M. J. DeLTA: automated cell segmentation, tracking, and lineage reconstruction using deep learning. PLoS Comput Biol. 16, e1007673(2020).
Kirillov, A., et al. Segment anything. arXiv. , (2023).
Weigert, M., Schmidt, U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. IEEE Int Symp Biomed Imaging Challenges (ISBIC). , (2022).
Dietler, N., et al. A convolutional neural network segments yeast microscopy images with high accuracy. Nat Commun. 11, 5723(2020).
Stringer, C., Pachitariu, M. Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation. Nat Methods. 22, 592-599 (2025).
Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nat Methods. 19, 1634-1641 (2022).
Gallusser, B., Weigert, M. Trackastra: transformer-based cell tracking for live-cell microscopy. arXiv. , (2024).
Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. soft-matter/trackpy: v0.6.4. Zenodo. , (2024).
Ulicna, K., Vallardi, G., Charras, G., Lowe, A. R. Automated deep lineage tree analysis using a Bayesian single cell tracking approach. Front Comput Sci. 3, 734559(2021).
Doersch, C., et al. TAPIR: tracking any point with per-frame initialization and temporal refinement. arXiv. , (2023).
Zargari, A., et al. DeepSea is an efficient deep-learning model for single-cell segmentation and tracking in time-lapse microscopy. Cell Rep Methods. 3, 100500(2023).
O'Connor, O. M., Alnahhas, R. N., Lugagne, J. B., Dunlop, M. J. DeLTA 2.0: a deep learning pipeline for quantifying single-cell spatial and temporal dynamics. PLoS Comput Biol. 18, e1009797(2022).
Chatzitheodoridou, D., Bureik, D., Padovani, F., Nadimpalli, K. V., Schmoller, K. M. Decoupled transcript and protein concentrations ensure histone homeostasis in different nutrients. EMBO J. 43, 5141-5168 (2024).
Schmoller, K. M., Turner, J. J., Kõivomägi, M., Skotheim, J. M. Dilution of the cell cycle inhibitor Whi5 controls budding-yeast cell size. Nature. 526, 268-272 (2015).
Moore, J., et al. OME-Zarr: a cloud-optimized bioimaging file format with international community support. Histochem Cell Biol. 160, 223-251 (2023).
Seshadri, A., Badrinarayanan, A. Exonuclease action of replicative polymerase gamma drives damage-induced mitochondrial DNA clearance. EMBO Rep. 26, 1385-1405 (2025).
Dengler, L., et al. When mitochondria fall apart: unbalanced mitochondrial segregation triggers loss of mtDNA in the absence of mitochondrial fusion. bioRxiv. , (2025).
Xiao, J., Turner, J. J., Kõivomägi, M., Skotheim, J. M. Whi5 hypo- and hyper-phosphorylation dynamics control cell-cycle entry and progression. Curr Biol. 34, 2434-2447.e5 (2024).
Roussou, R., et al. Real-time assessment of mitochondrial DNA heteroplasmy dynamics at the single-cell level. EMBO J. 43, 5340-5359 (2024).
Padovani, F., et al. SpotMAX: a generalist framework for multi-dimensional automatic spot detection and quantification. bioRxiv. , (2024).
Lanz, M. C., et al. Genome dilution by cell growth drives starvation-like proteome remodeling in mammalian and yeast cells. Nat Struct Mol Biol. 31, 1859-1871 (2024).
Kukhtevich, I., et al. The origin of septin ring size control in budding yeast. bioRxiv. , (2024).
Chadha, Y., Kukhtevich, I. V., Padovani, F., Schneider, R., Schmoller, K. M. Single-cell imaging reveals a key role of Bck2 in budding yeast cell size adaptation to nutrient challenges. bioRxiv. , (2024).
Seel, A., et al. Regulation with cell size ensures mitochondrial DNA homeostasis during cell growth. Nat Struct Mol Biol. 30, 1549-1560 (2023).
Schuh, L., et al. Altered expression response upon repeated gene repression in single yeast cells. PLoS Comput Biol. 18, e1010640(2022).
Kukhtevich, I. V., et al. Quantitative RNA imaging in single live cells reveals age-dependent asymmetric inheritance. Cell Rep. 41 (7), 111656(2022).
Freitag, M., et al. Single-molecule experiments reveal the elbow as an essential folding guide in SMC coiled-coil arms. Biophys J. 121, 4702-4713 (2022).
Sugawara, K., Çevrim, Ç, Averof, M. Tracking cell lineages in 3D by incremental deep learning. Elife. 11, e69380(2022).
Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nat Methods. 19, 829-832 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Анализ данных многомерной микроскопии с помощью Cell-ACDC

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles