Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация кальция in vivo и ex-vivo нейроном обонятельной цепи личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68956

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протоколы визуализации кальция для обонятельного нейрона личинки дрозофилы с использованием местного тканевого клея для иммобилизации. Этот метод повышает стабильность, облегчая проведение надежных экспериментов in vivo и ex-vivo . Пользовательские скрипты R анализируют сигналы кальция, обеспечивая эффективную платформу для детальных нейрофизиологических исследований.

Аннотация

Визуализация кальция имеет решающее значение для изучения нейронной динамики и функции мозга. Тем не менее, современные методы визуализации кальция у личинок дрозофилы являются сложными из-за артефактов движения и потребности в специализированном оборудовании. Здесь мы представляем практичный, недорогой метод проведения визуализации кальция in vivo и ex vivo у личинок дрозофилы третьего возраста с использованием местного тканевого клея для иммобилизации образцов. Мы также предоставляем пользовательские скрипты R и фреймворк для анализа данных, облегчая измерения изменений кальция в различных экспериментальных условиях. Используя этот подход, мы успешно зарегистрировали переходные процессы кальция в паре нейронов ЦНС личинок с минимальными артефактами движения, продемонстрировав воспроизводимость между препаратами. Метод совместим со стандартными конфокальными системами с вращающимися дисками и может быть адаптирован для самодельных или коммерческих двухфотонных установок, что делает его доступным для лабораторий с различными ресурсами. Этот подход может повысить доступность визуализационных исследований личиночного кальция и может быть адаптирован для изучения эффектов как внешних раздражителей, таких как запахи, так и внутренних стимулов, таких как нейромодуляторы.

Введение

Понимание динамики кальция в нейронах имеет решающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нейронной сигнализации и функции мозга, поскольку ионы кальция играют ключевую роль в модуляции нейронной активности и стимулировании клеточных реакций на стимулы. Динамику кальция в нейронах можно контролировать с помощью визуализации кальция, которая дает представление в режиме реального времени о кальций-опосредованной передаче сигналов у широкого спектра организмов, включая личинку дрозофилы. Личинка дрозофилы становится мощной модельной системой для изучения функции цепи, лежащей в основе поведения. Это один из трех организмов, для которых был создан полный коннектом мозга с синаптическимразрешением. Личинка поддается воздействию ряда сложных инструментов, которые позволяют визуализировать и манипулировать нейронами как на уровне всего мозга, так ина уровне одного нейрона.

Возможность измерения динамики кальция в нейронах личинок дрозофилы с помощью визуализации кальция имеет решающее значение дляпродвижения исследований в области нейробиологии. Последние достижения в области визуализации кальция позволили измерить динамику кальция на уровне от одиночных синапсов у личинки5 до многонейрональных записей у свободно движущихся личинок6. Визуализация кальция может быть выполнена in vivo, где события кальция регистрируются в естественном физиологическом контексте всей личинки 4,7,8,9, или ex vivo, где события кальция регистрируются в рассеченных личиночных тканях, сохраненных в смоделированных физиологических условиях10. В целом, исследователи использовали различные итерации метода визуализации кальция у личинок дрозофилы, чтобы раскрыть фундаментальные механизмы нейронных схем, ощущений, обучения и памяти, а также поведения 8,11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, исследования по визуализации личинок кальция ограничены из-за потребности в специализированном оборудовании и проблем с интерпретацией данных из-за артефактов движения.

В этой статье мы представляем экономически эффективную и легко реализуемую методологию визуализации кальция in vivo и ex vivo у личинок Drosophila melanogaster третьего возраста. Мы визуализировали динамику кальция в Keystone-LN, тормозящем обонятельном нейроне18,19, в цельных личиночных препаратах для демонстрации визуализации кальция in vivo и в расчлененном мозге личинок для демонстрации визуализации кальция ex vivo. Целые личинки и расчлененный мозг остаются жизнеспособными и реагирующими в течение примерно 10-15 минут в наших условиях визуализации, что позволяет получить несколько пробных стимулов для каждого образца. Чтобы решить проблему иммобилизации целых личинок или образцов тканей при сохранении жизнеспособности тканей и снижении экспериментальной изменчивости, мы оптимизировали использование GLUture, биосовместимого цианоакрилатного клея для местной ткани.

По сравнению с традиционными методами иммобилизации личинок, такими как встраивание агарозы или штифтирование, этот подход на основе клея уменьшает артефакты движения, сохраняя при этом жизнеспособность тканей20,21; По сравнению с двухфотонными системами визуализации, установка с вращающимся диском снижает затраты на оборудование и улучшает доступность для лабораторий с ограниченными ресурсами. Наконец, мы опишем простые подходы к визуализации в сочетании с специально разработанными скриптами R для анализа данных. Наш подход может повысить доступность исследований личиночного кальция и может быть адаптирован для изучения эффектов как внешних раздражителей, таких как запахи, так и внутренних стимулов, таких как нейромодуляторы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка личинок дрозофилы третьего возраста к визуализации кальция

  1. Держите мух на стандартном корме для мух (см. Таблицу материалов) при температуре 25 °C, относительной влажности (RH) 50-60% и 12-часовом цикле свет/темнота.
  2. Для экспрессии красного флуоресцентного белка (RFP) для идентификации нейронов и GCaMP6f (индикатор кальция) в интересующем нейроне ('X') скрещивались девственные самки линии X-Gal4 с самцами, несущими UAS-GCaMP6f и UAS-tdTomato22.
    Примечание: Для данного исследования линия Keystone-Gal4 использовалась для стимуляции экспрессии tdTomato и GCaMP6f в одной паре тормозных локальных нейронов (Keystone-LNs) в головном мозге личинок18,19.
  3. Дав самцам и самкам мух спариться и отложить яйца в течение 48 часов, переложите взрослых особей в свежий флакон.
  4. Извлеките личинок третьего возраста (примерно через 120 ч после откладки яиц), поместив их на 15% раствор сахарозы. Используйте микропипетку P1000 для переноса плавающих личинок в стеклянный стакан объемом 1 000 мл.
  5. Промойте личинок 3-4 раза, каждый раз заменяя воду в стакане на 800 мл свежей дистиллированной воды. Дайте личинкам отдохнуть в течение 10 минут, прежде чем приступать к остальной части протокола.

2. Протокол голодания для личинок дрозофилы третьего возраста (при тестировании голодающих и неголодных условий)

  1. Подготовьте две камеры кормления, поместив небольшой квадрат лабораторной салфетки в 6 см чашек Петри. Для тех, кто не испытывает голодания, добавьте 350 мкл 0,2 М раствора сахарозы; в условиях голодания добавьте 350 μл дистиллированной воды.
  2. Перенесите равное количество промытых личинок в каждую камеру кормления. Дайте личинкам питаться сахарозой (не голодающими) или дистиллированной водой (голодающими) в течение 2 ч при комнатной температуре.

3. Визуализация кальция in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты с тканевым клеем должны проводиться с использованием стандартных лабораторных методов безопасности. Требуются средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки или лицевой щиток; Следует избегать хлопчатобумажных перчаток из-за экзотермических реакций с цианоакрилатом. Избегайте контакта клея с кожей, глазами или слизистыми оболочками. В случае склеивания кожи смочите область в теплой мыльной воде и аккуратно отделите; В случае попадания в глаза промойте теплой водой в течение ≥5 минут и немедленно обратитесь за медицинской помощью. Клей следует хранить вдали от открытого огня и высокой температуры, так как отвержденный клей может выделять раздражающие пары при горении. Храните клей при температуре ≤30 °C, вдали от влаги и прямых солнечных лучей, в плотно закрытой упаковке, когда он не используется.

  1. Приготовьте буфер для визуализации кальция со следующим составом: NaCl 110 мМ, KCl 5,4 мМ, CaCl2 1,2 мМ, MgCl2 0,8 мМ, D-глюкоза 10 мМ и HEPES 10 мМ. Хранить при температуре 4 °C, когда не используется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированный физиологический раствор, содержащий 110 мМ NaCl, является широко признанной формулой для диссекции и визуализации ЦНС личинок и находится в типичном диапазоне, используемом в электрофизиологии и визуализационных исследованиях (≈108-128 мМ NaCl)23,24,25,26.
  2. На покровном стекле микроскопа размером 24 x 50 мм (толщина 1,5 мм) создайте лунку с помощью вазелина, дозированного из шприца.
  3. Нанесите небольшую каплю местного тканевого клея (60% 2-октил и 40% н-бутилцианоакрилата) в центр покровного стекла. Равномерно распределите клей тонким равномерным слоем с помощью стеклянного стержня.
  4. Аккуратно перенесите одну личинку на клей с помощью щетки или тонкой проволоки. Аккуратно прижмите брюшную сторону личинки к клею. Дайте клею высохнуть, убедившись, что личинка полностью обездвижена.
  5. После того, как личинка будет обездвижена, поместите покровное стекло на предметный столик инвертированного микроскопа (рис. 1A).

4. Визуализация кальция ex-vivo

  1. Приготовьте буфер для диссекции личинок со следующим составом: NaCl 110 мМ, KCl 5,4 мМ, CaCl2 0,3 мМ, MgCl2 0,8 мМ, D-глюкоза 10 мМ, HEPES 10 мМ. Хранить при температуре 4 °C, когда не используется.
  2. Препарируйте вскрытия мозга, описанные Ишимото и Сано10. Кратко, с помощью щетки или тонкой проволоки, перенесите одну личинку в чашку Петри диаметром 3,5 см со слоем силиконового эластомера, расположенного на дне.
  3. Под микроскопом для вскрытия расположите личинку вентральной стороной вверх и найдите мозг. С помощью ножниц для препарирования сделайте надрез примерно на одну треть вниз по переднему концу личинки. Сделайте еще один надрез у рта крючками. Сохраняйте мозг, удаляя тело и крючки для рта (адаптировано из Janelia Flylight Protocol27).
  4. Определите кластер нервов, содержащих двигательные нейроны, из вентрального канатного канатика. С помощью щипцов аккуратно оттяните мозг от остальной части рассеченной личинки. Удалите лишнюю ткань из мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь осторожно - чрезмерное усилие может привести к повреждению тканей, так как мозг хрупкий.
  5. Подготовьте защитное стекло микроскопа с тканевым клеем для визуализации кальция, как описано в шагах с 3.2 по 3.3.
  6. С помощью микропипетки Р10 осторожно аспирируйте рассеченный мозг 5 мкл диссекционного раствора из чашки Петри. Медленно выдавите мозг на клей. Прежде чем клей высохнет, ориентируйте мозг в положение тыльной стороной вверх (две доли мозга обращены вниз, а дорсальный вентральный канатик — вверх).
  7. С помощью микропипетки P200 перенесите 100 мкл буфера для визуализации кальция на иммобилизованный мозг личинки на покровное стекло.
  8. Поместите защитное стекло вместе с мозгом на перевернутый микроскоп, подключенный к модулю конфокального сканера с вращающимся диском и ПЗС-камере для визуализации кальция (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При приеме препаратов ex-vivo убедитесь, что мозг правильно ориентируется, пока клей еще влажный. Для достижения оптимального качества изображения расположите мозг таким образом, чтобы ROI был ближе всего к объективу микроскопа, и избегайте нанесения излишков клея рядом с ROI.

5. Протокол визуализации

  1. Откройте программное обеспечение для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа. Получение изображений с помощью объектива 10x/1.4 NA с переключением фильтра между лазером GFP (возбуждение 488 нм, интенсивность 70%, излучение 525 нм/50 мм, OD8) и RFP-лазером (возбуждение 561 нм, интенсивность 50%, излучение 610 нм/75 мм, OD8). Установите экспозицию в диапазоне от 100 мс до 1 000 мс, усиление на уровне 50% от соответствующего значения экспозиции и коэффициент биннинга 2 во время съемки.
  2. Настройте микроскоп на 10-кратное увеличение и определите местоположение мозга под светлым светом.
  3. Идентификация интересующего нейрона путем поиска сигнала tdTomato с помощью RFP-лазера (возбуждение установлено на 561 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите насыщенность и уменьшите гамму, чтобы установить правильное значение экспозиции.
  4. После того, как область интереса (ROI) определена, переключитесь на лазер GFP (возбуждение установлено на 488 нм) для захвата сигналов GCaMP6f. Убедитесь, что сигналы tdTomato и GCaMP колокализованы, прежде чем захватывать изображения стека обоих каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте параметры изображения для стековых записей tdTomato и GCaMP6f, чтобы максимизировать флуоресценцию.
  5. Захват двух отдельных временных рядов записи сигналов tdTomato и GCaMP6f одновременно со скоростью 0,5 кадра/с (всего 2 минуты).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытый мозг личинки остается жизнеспособным в течение примерно 10 минут в этих буферных условиях; По истечении этого времени сигналы будут ухудшаться.
  6. Когда образец будет готов к изображению, запишите две отдельные временные серии сигналов tdTomato и GCaMP6f одновременно со скоростью 0,5 кадра/с (всего 2 минуты).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытый мозг личинки остается жизнеспособным в течение примерно 10 минут в этих буферных условиях; По истечении этого времени сигналы будут ухудшаться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении количественного анализа мы рекомендуем увеличивать мощность лазера и регулировать усиление экспозиции детектора по мере необходимости, сохраняя при этом линейное масштабирование интенсивности.

6. Обработка и анализ данных

  1. Откройте и импортируйте стеки сигналов tdTomato и GCaMP6f в ImageJ (NIH)28.
  2. Чтобы определить правильную область интереса (ROI), объедините сигналы tdTomato и GCaMP6f для подтверждения колокализации. После проверки разделите каналы tdTomato и GCaMP6f.
  3. В верхнем меню выберите Плагины | Создать и нажмите Макросы , чтобы запустить новый макрос. Затем импортируйте пользовательские макросы на основе ROI в ImageJ. Выберите стек GCaMP6f и нажмите «Выполнить» для анализа кальция.
  4. Обрабатывайте сигналы флуоресценции с помощью пользовательского макроса ImageJ (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). Макрос сначала генерирует проекции максимальной интенсивности, выполняет коррекцию движения с помощью плагина StackReg (режим жесткой регистрации )29 и применяет коррекцию отбеливания.
  5. Появится всплывающее окно «Требуется действие» с запросом на ручной выбор ROI, что позволяет пользователям вручную нарисовать широкий ROI. Нажмите OK , чтобы продолжить анализ. Чтобы выполнить коррекцию движения, убедитесь, что прямоугольное поле покрывает всю рентабельность инвестиций во всех кадрах для точной коррекции движения, сохраняя при этом локальную пространственную форму и форму ROI во всех кадрах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Записи были зарегистрированы в ImageJ с помощью StackReg. Когда движение в плоскости было большим (кумулятивное смещение XY > 1 мкМ) или осевой Z-дрейф приводил к потере фокуса, регистрация становилась ненадежной, или образец полностью терялся из окна изображения. Таким образом, образцы, показывающие экстремальный дрейф или снижение сигналов кальция (>30%), были автоматически помечены и исключены из последующего анализа для обеспечения точных измерений активности нейронов. Эти пороговые значения согласуются с широко применяемыми методами контроля качества в исследованиях визуализации кальция 30,31,32,33. Исключение также гарантировало, что для анализа использовались только стабильные записи с надежными, связанными со стимулом кальциевыми переходными процессами.
  6. Для анализа извлеките флуоресцентные следы из заданных вручную круговых ROI, руководствуясь автокорреляцией пикселей; эти ROI будут охватывать всю область ключевых нейронов.
    1. Извлеките исходные данные об интенсивности флуоресценции для двух флуорофоров: GCaMP6f/GFP и tdTomato/RFP, используя пользовательские макросы в ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, см. Таблицу материалов).
    2. Примените скользящее окно с ROI 20 x 20 пикселей и шагом 10 пикселей по полю зрения. Для каждого ROI макрос вычисляет: (1) интенсивность на всех кадрах, (2) разницу в базовых колебаниях (т. е. разницу между максимальными и минимальными значениями интенсивности в течение первых 10 кадров) и (3) максимальное изменение интенсивности от кадра к кадру (ΔF). ROI, показывающие колебания интенсивности менее 10 единиц, будут исключены, и для дальнейшего анализа будут выбраны только самые острые значения ΔF.
    3. Нормализовать флуоресцентные следы можно с помощью следующих методов:
      1. Нормализация Fmax и Fmin: Рассчитаем нормализованное Δ по формуле:
        figure-protocol-1
        Где F — исходная флуоресценция в каждый момент времени, Fmin — минимальная флуоресценция (базовая линия), а Fmax — максимальная флуоресценция во время записи.
      2. Нормализация ΔF/F 0: Кроме того, выполните нормализацию ΔF/Fo, где Fo (базовая линия) определяется по первым 10 кадрам каждой записи, используя формулу:
        figure-protocol-2
        Где Ft — флуоресценция в момент времени t, а F0 — базовое значение, вычисленное из первых 10 кадров.
  7. После извлечения сигналов GCaMP6f щелкните левой кнопкой мыши и выберите «Все», «Вырезать» и «Вставить », чтобы перенести все значения в новую таблицу Excel. В верхней строке меню выберите Данные | Текст в столбцы. Появится всплывающее окно мастера "Text-to-Column". На шаге 1 выберите «С разделителями», затем нажмите «Далее». На шаге 2 в разделе «Разделители» выберите «Табуляция» и «Запятая», затем нажмите «Далее». На шаге 3 нажмите кнопку Готово.
    НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Чтобы построить график нормализованных сигналов кальция, выделите Fnorm_FminFmax и выберите Диаграмму рассеяния.
  8. Найдите файл .csv, который содержит: (1) исходные значения флуоресценции F, (2) ΔF/Fo и (3) Fnorm (нормализованная интенсивность флуоресценции). Организуйте окончательный набор данных в четыре столбца: (1) время (кадры), (2) состояние выборки (голодание или кормление), (3) идентификатор репликации (отдельный образец) и (4) нормализованная интенсивность (значения Fnorm масштабируются от 0 до 1).
  9. Наконец, выполните анализ и визуализацию данных в R с помощью пользовательских скриптов R (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging. см. Таблицу материалов).
    1. Импортируйте пользовательский скрипт R в новый проект R. Перед запуском анализа убедитесь, что необходимые пакеты R, включая ggplot2, dplyr и readr, установлены и обновлены.
    2. Начиная со строки 1 пользовательского скрипта R, непрерывно нажимайте кнопку Run для проведения анализа кальция. Также убедитесь, что выходные данные включают тепловые карты, иллюстрирующие нормализованную интенсивность кальция для первых 30 кадров, 60 кадров и всех кадров записи временных рядов, а также диаграммы размаха, показывающие медиану нормализованных интенсивностей.
    3. Оцените значимость нормализованной интенсивности кальция с помощью U-критерия Манна-Уитни.

7. Утилизация и обеззараживание отходов

  1. После экспериментов удалите крупный мусор с инструментов и поверхностей под проточной водой, затем продезинфицируйте 70% этанолом или 10% отбеливателем, а затем стерильной водой. Работайте на продезинфицированной поверхности, а после снятия перчаток мойте руки; Не ешьте и не пейте в лаборатории.
  2. Поместите личиночную ткань и загрязненные одноразовые материалы в пакеты для биологически опасных веществ и автоклав перед утилизацией.
  3. Полностью отвержденные клеевые отходы выбрасывать в общий мусор; Неотвержденный клей и загрязненные одноразовые материалы должны быть собраны в герметичный контейнер для опасных химических отходов с маркировкой.
  4. Поместите все острые предметы (лезвия, иглы, битое стекло) в контейнер для острых предметов, устойчивый к проколам.
  5. Собирайте легковоспламеняющиеся растворители (этанол, ацетон) в контейнеры для легковоспламеняющихся отходов с маркировкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать наш подход к визуализации личинок кальция, мы успешно применили его к препаратам личинок дрозофилы in vivo и ex-vivo (рис. 2 и рис. 3, видео 1, видео 2, видео 3 и видео 4). Мы измерили динамику кальция у личинок дрозофилы третьего возраста, экспрессирующих GCaMP6f и Td-Tomato в одной паре Keystone-LN в мозге личинки 18,19

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной статье мы описываем подход к визуализации кальция in vivo и ex-vivo у личинок Drosophila melanogaster третьего возраста. Мы визуализировали динамику кальция в Keystone-LN, ингибирующем локальном нейроне у личинки дрозофилы . Мы измеряли динамику кальция Keystone-LN в цельных личиночных препаратах (in vivo) и в препарированных препаратах головного мозга личинки (ex vivo) (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы благодарны доктору Джеффри Харперу, который предоставил нам конфокальный микроскоп с вращающимся диском своей лаборатории для этих экспериментов. Мы благодарны за подарок в виде лески: w; UAS-GCaMP6f/CyO, плач; UAS-tdTomato от доктора Чон Хван Кима. Эта работа была поддержана средствами Национального научного фонда под номерами 2341202 и 2129234. Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Флай-стоки и Содержание
Корм для мух NutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoПодарок от доктора JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Протокол реагентов для голодания
Чашка Петри диаметром 6 смGenesee Scientific32-106G
СахарозаМиллипор СигмаS0389-500G
Реагенты для визуализации и вскрытия буфера
Хлорид кальцияДж.Т. Бейкер, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500 г
D-(+)-глюкозаТермо Фишер СайентификA16828.36CAS: 50-99-7, 500 г
HEPES-2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-этансульфоновая кислотаДж.Т. Бейкер, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100 г
Хлорид магнияVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100 г
Хлорид калияТермо Фишер СайентификJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500 г
Хлорид натрияEMD Милипор СигмаEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500 г
Инструменты и реагенты для вскрытия
Буфер рассеченияКомпозиция, предоставленная в тексте
Чашки Olympus Petri, 60 x 15 мм с вентиляциейGenesee Scientific32-105
Эластомерная база Сильгард 184Науки об электронной микроскопии24236-10A
Sylgard 184 Эластомерный базовый отверждающий агентНауки об электронной микроскопии24236-10B
Пинцет Style 5, EMSНауки об электронной микроскопии78320-5
Пружинные ножницы Vannas — режущая кромка 3 ммТонкие научные инструменты15000-00
Оборудование/реагенты для визуализации и монтажа
Модуль конфокального сканераЁкогаваCSU-W1Подключён к микроскопу
Буфер визуализацииКомпозиция, предоставленная в тексте
Инвертированный микроскопLeica MicrosystemsDMi8 Подключён к вращающемуся дисковому конфокальному сканеру и CCD-камере
Стекло для крышки микроскопа, 24 мм x 50 мм, толщина # 1,5Globe Scientific Inc.1415-15
Местный клей MWI Veterinary GLUTUREFisher ScientificNC0632797
Чистый вазелинWalgreens912556
Ссылки на общедоступные ресурсы
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Видео протокола Джанелии Флайлайтhttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Ссылки

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Личинка Drosophilaвизуализация in vivoвизуализация ex vivoспиннинговая конфокальная микроскопиякоррекция движенияфлуоресценция GCaMP6fиммобилизация тканианализ ROI
Визуализация кальция in vivo и ex-vivo нейроном обонятельной цепи личинки Drosophila melanogaster третьего возраста
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.