Разработка лекарственно-устойчивых клеточных линий для экспериментальных процедур

Краткое содержание

Лекарственно-устойчивые клеточные линии позволяют понять механизмы резистентности к лечению и доклиническую оценку новых соединений, перепрофилированных препаратов и комбинированной терапии. В данной работе представлен протокол создания резистентных клеточных линий путем воздействия на родительские клеточные линии ступенчатого увеличения концентрации целевого препарата.

Аннотация

Разработка лекарственно-устойчивых клеточных линий имеет важное значение для понимания механизмов лекарственной устойчивости и определения стратегий преодоления неэффективности лечения в терапии рака. Модели резистентности позволяют проводить доклиническую оценку новых соединений, переработанных препаратов и комбинированной терапии. Для создания резистентных клеток родительские раковые клеточные линии многократно подвергаются постепенному увеличению концентрации целевого препарата в течение нескольких недель. Клетки, которые выживают и размножаются на каждой стадии, отбираются, расширяются и подвергаются воздействию более высоких доз препарата. Развитие резистентности подтверждается количественным определением и сравнением значений полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) между родительскими и резистентными клетками с использованием анализа жизнеспособности клеток и нелинейного регрессионного анализа. Значительно повышенные значения IC₅₀ свидетельствуют об успешной адаптации к лекарственному давлению и развитии резистентности. Эти лекарственно-устойчивые клеточные линии доступны для комплексного анализа, такого как микрочипы и секвенирование одиночных клеток, а также для различных экспериментов in vitro или in vivo . Эти модели предоставляют ценные инструменты для исследования потенциальных терапевтических стратегий для преодоления лекарственной устойчивости.

Введение

Химиотерапия является наиболее часто используемым вариантом лечения местных раковых опухолей, не поддающихся хирургическому вмешательству или лучевой терапии, или метастатических раковых опухолей. Молекулярно-таргетные препараты и химиотерапия используются в качестве препаратов первой линии для лечения многих злокачественных новообразований, и их эффективность широко признана. Некоторые виды рака проявляют устойчивость к определенным лекарствам с самого начала лечения, что делает лечение неэффективным. Однако в более распространенных случаях лечение, которое изначально было эффективным, становится неэффективным из-за развития лекарственной устойчивости, что приводит к прогрессированию рака.

Лекарственная устойчивость вызывается как генетическими мутациями, так и эпигенетическим ответом в раковых клетках, которые индуцируют экспрессию генных продуктов, уклоняющихся от лекарств или способствующих росту клеток ^1,2. Кроме того, во многих случаях эта устойчивость эволюционирует в множественную лекарственную устойчивость, при которой раковая клетка становится устойчивой к нескольким препаратам ^3,4. Поэтому выявление механизмов лекарственной устойчивости и разработка стратегий по ее преодолению чрезвычайно важны для продвижения лечения рака.

Лекарственно-устойчивые клеточные линии часто используются для изучения механизмов терапевтической резистентности и играют важную роль как в экспериментах in vitro^{, так} и in vivo. Эти модели являются важными инструментами для более глубокого понимания путей действия лекарств, идентификации биомаркеров, влияющих на терапевтическую эффективность, и поиска терапевтических стратегий для ингибирования формирования лекарственной устойчивости. Основным процессом создания лекарственно-устойчивой клеточной линии является индуцирование резистентности путем воздействия на клеточную линию возрастающих уровней целевого препарата ^3,6.

Используемая концентрация и продолжительность воздействия препарата являются критическими компонентами этого процесса. На каждом уровне концентрации подмножество выживших клеток амплифицируется, а затем подвергается воздействию следующей концентрации препарата в повторяющемся режиме. В конечном счете, получается лекарственно-устойчивая клеточная линия, которая имеет повышенную половину максимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀) для препарата по сравнению с исходной клеточной линией. В этом отчете подробно описана процедура создания устойчивой к паклитакселу клеточной линии (DU145-TxR) из клеточной линии рака предстательной железы человека DU145 с использованием ступенчатого метода с прерывистым воздействием лекарств.

Протокол

1. Анализ клеточных культур и жизнеспособности клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Паклитаксел является противоопухолевым препаратом и является цитотоксичным. При обращении с ним наденьте халат, очки и перчатки, а также работайте в защитном шкафу, чтобы предотвратить вдыхание в организм. ДМСО не обладает высокой цитотоксичностью, но при контакте с кожей или слизистыми оболочками проницаемость растворенных препаратов увеличивается, поэтому при работе с ним надевайте халат, защитные очки и перчатки.

1. Культивирование клеток DU-145 в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток с использованием полной среды (RPMI-1640 + 1% пенициллин-стрептомицин [pen-strep] + 10% фетальная бычья сыворотка [FBS]) в инкубаторе при температуре 37 °C при 5%_CO2 до 80% конфлюента.
2. Отсадите питательную среду, промойте DPBS, добавьте 0,05% трипсин и оставьте в инкубаторе на 5 минут.
3. После постукивания и подтверждения с помощью микроскопии, что клетки оторваны от планшета и плавают, добавьте 1 мл готовой среды, чтобы остановить действие трипсина.
4. Подсчитайте количество клеток и затравите их с плотностью 1,0 × 10⁴/99 мкл на лунку в полной среде в каждой лунке 96-луночного планшета. Инкубируйте в течение 2 часов, чтобы клетки прилипли к нижней части пластины. Клетки должны быть покрыты в тройном или четырехкратном виде для каждой тестовой группы.
5. Отрегулируйте добавление паклитаксела и ДМСО в каждую лунку. Убедитесь, что количество ДМСО, добавляемого в каждую лунку, одинаково, и что конечная концентрация ДМСО составляет не более 1%.
   1. Чтобы выполнить это и следовать нашему протоколу, начните с 10 мМ паклитаксела в ДМСО и добавьте 87,2 мкл ДМСО к 12,8 мкл этого препарата в пробирке, чтобы получить 100 мкл паклитаксела при 1280 мкМ.
   2. Перенесите 50 μL этого раствора в другую пробирку и разбавьте его до половины 50 μL DMSO (640 μM).
   3. Повторите эту процедуру для выполнения серийного разведения и получения растворов паклитаксела в концентрациях 0 (только ДМСО), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 и 1,280 мкМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Паклитаксел, разведенный ДМСО, следует хранить в замороженном виде для повторного использования в последующих экспериментах (чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания, хранить в аликвотах).
6. Разведите 1 мкл приготовленного ранее раствора паклитаксела с 9 мкл готовой среды в отдельной пробирке и добавьте по 1 мкл этого раствора в каждую лунку через 2 ч после посева клеток. Концентрации паклитаксела в каждой лунке будут составлять 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 и 1,280 нМ, при этом каждая лунка будет содержать 100 мкл среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При установке концентрации препаратов, используемых в анализах жизнеспособности клеток, проверьте значения IC₅₀ , опубликованные в предыдущих работах, и убедитесь, что концентрация находится в диапазоне³. Концентрация ДМСО в каждой скважине составляла 0,1% по всей длине (желательно менее 1%).
7. Инкубировать в течение 48 ч. Добавьте 10 мкл реагента для пролиферации клеток WST-1 в каждую лунку (100 мкл питательной среды) и инкубируйте еще от 0,5 до 4,0 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации зависит от клеточной линии и плотности клеток. В этом исследовании мы культивировали клетки в течение примерно 1,5 ч. Если время инкубации слишком короткое или слишком долгое, поглощение каждой лунки будет слишком низким или слишком высоким на следующем этапе. В результате подтвердить разницу в жизнеспособности клеток не удастся. Таким образом, для первоначального тестирования следует проверить несколько раз инкубации, чтобы подтвердить подходящее время инкубации.
8. Измерьте абсорбцию WST-1 с помощью считывателя микропланшетов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целевое поглощение составляет 450 нм (рекомендуется 420-480 нм), а фоновое поглощение - 650 нм (рекомендуется 600 нм или выше).

2. Расчет жизнеспособности клеток и значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀)

1. Рассчитайте жизнеспособность клеток по абсорбции. Абсорбционная способность составляет (A450nm-A650nm).
   Жизнеспособность клеток (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
   В качестве: абсорбция образца (клетки, обработанные лекарственными препаратами)
   Ab: поглощение бланков (только среда, без ячеек)
   Ac: контроль абсорбции (необработанные клетками)
2. Обобщите жизнеспособность клеток, рассчитанную в предыдущем разделе, в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
3. Рассчитайте и запишите IC₅₀ для родительских клеток с помощью нелинейного регрессионного анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Четырехпараметрическая логистическая модель (4PL) часто является подходящим методом расчета. Доступны онлайн-инструменты для расчета IC₅₀ ⁷. Однако модель 4PL не следует использовать, когда эффективность соединения находится за пределами диапазона концентраций, а данные не могут в полной мере представлять нижнюю и верхнюю асимптоты сигмовидной кривой.
   1. Чтобы избежать такого увеличения, измеряйте жизнеспособность клеток в как можно большем количестве точек концентрации. Если сигмовидная кривая не может быть получена, используйте двух- или трехпараметрический режим с фиксированными минимальными и максимальными значениями⁷.
   2. Если вы не используете программное обеспечение для расчетов или статистику, в том числе доступное в Интернете, используйте следующую формулу:
      IC₅₀=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
      О: Наименьшее значение среди измеренных концентраций препарата с жизнеспособностью клеток ≤50%
      B: Самое высокое значение среди измеренных концентраций препарата с жизнеспособностью клеток >50%
      C: Жизнеспособность клеток в B
      D: Жизнеспособность клеток в точке А
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта формула предполагает, что график между двумя точками, смещающими значение IC₅₀ , представляет собой прямую линию.

3. Воздействие лекарственных препаратов

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор процедур, описанных в этом разделе, показан на рисунке 1.

1. Засейте родительские клетки на клеточных культуральных планшетах (2,0 × 10⁶ клеток/чашку для чашек 100 мм).
2. Добавить паклитаксел в концентрации, ингибирующей жизнеспособность клеток, ~10-20% (IC_10-20, ~0,5 нМ в данном случае) в среду и культивировать в инкубаторе в течение 2 суток.
3. Замените на среду, не содержащую паклитаксела, и выдерживайте несколько дней.
4. Как только клетки вырастут и станут на 80% сливающимися, перенесите их на новую клеточную культуральную пластину. Криоконсервируйте оставшиеся клетки.
5. Добавляйте паклитаксел в пропущенные клетки в концентрации в ~1,5-2,0 раза выше исходной концентрации (0,75-1 нМ). Инкубировать в инкубаторе в течение 2 суток.
6. Замените на среду, не содержащую паклитаксела, и выдерживайте несколько дней.
7. Если клетки растут аналогично, повторяйте шаги 3.4-3.6, постепенно увеличивая концентрацию воздействия паклитаксела.
   Примечание: Увеличение концентрации препарата (в 1,5-2,0 раза) может быть свободно установлено экспериментатором, и эксперимент должен быть повторен при этой концентрации. Мы рекомендуем замораживать и хранить клетки каждый раз, когда концентрация препарата увеличивается. Если концентрация паклитаксела продолжает увеличиваться, пролиферация клеток может не восстановиться, и клетки могут погибнуть. В таких случаях разморозьте клетки, которые пролиферировали в концентрации до смерти, уменьшите увеличение паклитаксела до 1,1-1,5 раза (рекомендуется в 1,2 раза) и повторите посев.
8. Постепенно увеличивайте резистентность клеточной линии к лекарственному препарату, а затем рассчитайте и запишите IC₅₀ с помощью WST-1 и программного обеспечения, как описано в разделе 2.
   Примечание: Если наблюдается увеличение IC₅₀ по крайней мере в 3-5 раз, можно определить, что штамм является лекарственно-устойчивой клеточной линией.

4. Поддержание лекарственной устойчивости

1. Для поддержания резистентного фенотипа лекарственно-устойчивой клеточной линии проводят инкубацию с концентрацией препарата IC_10-20.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется периодически измерять IC₅₀ в анализе выживаемости клеток, так как лекарственная устойчивость может меняться.

Результаты

Используя этот метод, мы ранее потратили 9 месяцев на успешное создание чувствительных к паклитакселу клеток DU145 (DU145-TxR). Результаты анализа жизнеспособности клеток показали, что значение IC₅₀ паклитаксела для родительской клеточной линии DU145 составило 1,1 нМ, тогда как значение IC₅₀ для DU145-TxR было в 149,6 раза выше, чем для родительской клеточной линии (IC₅₀: 164,6 нМ) (табл. 1 и рис. 2). Этот результат указывает на то, что DU145...

Обсуждение

Разработка лекарственно-устойчивых линий раковых клеток является признанным методом исследования токсичности лекарств и механизмов резистентности, но первая проблема, с которой сталкиваются исследователи, заключается в выборе подходящей модели для выражения резистентности. Распространенным методом создания лекарственно-устойчивых клеточных линий in vitro является воздействие на клеточную линию целевого препарата, но при этом необходимо учитывать, как устанавливать концентрацию экспозиции...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,05% Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300-054
10 мл Одноразовая серологическая пипетка	Fisher scientific	13-678-11E
100 мм чашка	Corning	353003
15 мл коническая трубка	Corning	352097
2,0 мл Криогенные флаконы	Corning	431386
96 луночный планшет	для культивирования клетокCorning	353072
Камера для подсчета клеток Слайд	Invitrogen	C10228
Реагент для пролиферации клеток WST-1	Sigma	5015944001
Центрифуга 5702 R	eppendorf
бесчисленное количество II	Счетчик клеток Invitrogen
Диметилсульфоксид	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	D4W2J
DU145	ATCC	HTB-81	Клеточная линия рака предстательной железы
EVOS FLc	Thermo Fisher Scientific		Digital инвертированный микроскоп
FBS	Gibco	A5670701
паклитаксел	Selleck	S1150
Пенициллин– стрептомицин	Invitrogen	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Synergy H1	BioTek Microplate		Reader
Trypan Blue раствор 0,4%	Invitrogen	15250061