Получение высококачественного томографического сбора данных с помощью пропускающего электронного микроскопа на 200 кВ с системой двойной конденсационной линзы

Summary

Электронная томография позволяет проводить почти атомную визуализацию органелл, клеток и макромолекул внутри тканей в криобиологических образцах. Для достижения такого разрешения требуется строго контролируемые условия изображения. Здесь, используя пропускной электронный микроскоп на 200 кВ с двухступенчатой системой конденсаторных линз в качестве примера, мы описываем, как выполнять высококачественный сбор данных электронной томографии.

Abstract

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) стала мощным методом для разъяснения структуры клеточных органелл и крупных белковых комплексов в их естественных средах. В отличие от традиционной электронной микроскопии при комнатной температуре, крио-ЭТ минимизирует повреждения внутренних структур, вызванных радиацией и препаратом. Кроме того, в отличие от однокомпонентного анализа (SPA), крио-ЭТ снижает необходимость повторяющейся очистки, сохраняя наиболее достоверную структурную информацию образцов. Для достижения высококачественной визуализации крио-ЭТ также вводит строгие требования к условиям визуализации ТЭМ. Несмотря на постоянное повышение эффективности сбора данных крио-ET и появление множества программных платформ, большинство решений являются проприетарными, специфичными для поставщиков и тесно связаны с определёнными моделями электронного микроскопа, что приводит к высоким затратам на реализацию. В этом исследовании мы установили открытое программное обеспечение SerialEM на электронный микроскоп с напряжением 200 кВ (крио-TEM Glacios 2) с системой двойного конденсатора и провели комплексные калибровки для получения высококачественных томографических данных. Используя апоферритин в качестве модельного образца, мы описываем весь рабочий процесс — от подготовки криообразца до автоматизированного сбора крио-ЭТ-данных, затем реконструкции томографии и субтомографического анализа. Этот метод предлагает экономичное и доступное решение для сбора крио-инопланетных данных, особенно для лабораторий, использующих микроскопы Glacios без доступа к проприетарному программному обеспечению.

Introduction

Криоэлектронная томография (крио-ЭТ) стала мощным методом изучения естественных структур макромолекулярных комплексов и клеточных органелл in situ. Главное преимущество крио-ЭТ по сравнению с анализом на отдельных частицах (SPA) заключается в его способности избегать чрезмерных этапов очистки, тем самым сохраняя естественное состояние целевых биомолекул в их биологическом контексте. В настоящее время широкий спектр образцов — включая очищенные^{органеллы} 1,2,3,4, листы клеточных мембран,^{макромолекулярные комплексы 5}, ^{вирусы 6}, клеточные^{ламеллы 7} и срезы^{тканей 8,9,10} — могут быть исследованы с помощью криоиноэстра. Учитывая разнообразие типов образцов и целей экспериментов, стратегии сбора данных существенно различаются и должны тщательно адаптироваться как под образец, так и под конкретную конфигурацию прибора.

Сбор данных является критически важным этапом в рабочем процессе крио-ET, поскольку качество данных и эффективность их получения напрямую влияют на дальнейшую обработку и общий экспериментальный успех эксперимента. Для удовлетворения меняющихся экспериментальных требований были разработаны несколько платформ для сбора данных. Среди наиболее широко используемых — коммерческая томография и открытое программное обеспечение SerialEM^{11, 12, 13}. Томография предлагает высокоинтегрированный и удобный интерфейс с низкой кривой обучения, но менее гибкая и требует коммерческой лицензии. В отличие от этого, SerialEM — это бесплатный пакет с открытым исходным кодом, поддерживающий как графический интерфейс (GUI), так и скриптовые рабочие процессы, обеспечивая большую гибкость и расширяемость.

Сбор томографических данных из крио-ламелл представляет собой уникальные задачи. Высококачественные ламеллы трудно подготовить, а их механическая нестабильность и высокая чувствительность к электронному облучению дополнительно усложняют сбор данных. Для решения этих проблем Фабиан Эйзенштейн разработал рабочий процесс^{PACEtomo 14} — улучшение SerialEM, которое вводит сдвиг изображения луча для получения нескольких томограмм на серию наклона, тем самым снижая частоту корректировки фокуса и отслеживания. Эта стратегия максимизирует объём полезных данных из каждого участка, минимизируя ненужное воздействие электронов. Похожая функциональность также доступна в коммерческом программном обеспечении Tomography5.

В отличие от этого, сбор данных из крио-фиксированных органелл или мембранных листов обычно более простой, так как эти образцы обычно готовятся на отверстительных углеродных сетках, обеспечивая достаточную площадь для фокусировки и^{отслеживания 15,16}. В таких случаях встроенные рабочие процессы получения крио-ET в SerialEM — доступные напрямую через графический интерфейс — предлагают удобный вариант без скриптов, особенно подходящий для начинающих или небольших лабораторий. Тем не менее, с точки зрения эффективности, мы по-прежнему рекомендуем применять стратегии на основе сдвига изображения луча, когда это возможно.

Учитывая высокую стоимость криоэлектронных микроскопов, оптимизация стратегий сбора данных для максимального использования приборов крайне важна. TEM на 200 кВ с двухступенчатой системой конденсаторных линз обеспечивает немного меньшую проникновение электронов для толстых образцов, чем прибор на 300 кВ, но при правильной калибровке он полностью пригоден для крио-ET. Однако относительно узкий диапазон условий параллельного пучка и фиксированный размер пятна при увеличениях делают его менее подходящим для высокоразрешающего крио-ЭТ, если система не будет точно оптимизирована.

Наша электронная микроскопическая система оснащена камерой прямого обнаружения электронов Falcon 4i, которая обеспечивает значительные преимущества в возможности подсчёта одного электрона и высокоскоростной непрерывной съёмке. Для полного использования работы этого детектора TEM должен работать в условиях хорошо оптимизированной визуализации. Для TEM, использующих двухступенчатую конденсаторную систему, точная калибровка условий освещения для параллельного света является важным фактором для улучшения качества изображения^17,18. В современных двухступенчатых конденсаторных системах фокусная точка линзы конденсатора второй ступени должна совпадать с передней фокальной плоскостью верхней объективной линзы, чтобы обеспечить параллельность оптического пути, пересекающегося с плоскостью образца. Точно установленные параллельные условия освещения крайне важны для обеспечения стабильности значений недофокуса и увеличения на локальных позициях собранных изображений.

В этом исследовании мы сосредоточились на создании высококачественного процесса крио-ЭТ с использованием апоферритина в качестве образца модели. Поскольку система пропускающего электронного микроскопа на 200 кВ не лицензирована для коммерческого программного обеспечения томографии, мы установили и откалибровали открытую платформу SerialEM. Тщательно оптимизируя параметры параллельного пучка для двухступенчатой системы конденсаторных линз микроскопа, мы добились автоматизированного сбора томографических данных через графический интерфейс SerialEM — без необходимости в скриптах на Python или сложной конфигурации. Этот подход обеспечивает удобное и экономичное решение для эффективного сбора крио-ЭТ данных на приборах напряжением 200 кВ, таких как Glacios.

Protocol

1. Подготовка и загрузка криообразцов

1. Чтобы подготовить Vitrobot, включите его и установите температуру на 10 °C. Установить влажность на 100%. Замените фильтрующую бумагу.
2. Вставьте в систему свечения разряда R1.2/1.3 с отверстиями с углеродной пленкой с 300-сеткой. Установите условия разряда при свечении на 15 мА в течение 60 секунд при вакуумном давлении 0,39 мБар, отрицательный заряд. Проведите свеченный разряд для гидрофилизации поверхности сетки.
3. Настройте параметры Vitrobot следующим образом: время блота: 3 с, время ожидания: 0 с, сила блота: 2, температура: 8 °C, влажность: 90%.
4. Приготовьте жидкий этан в этановой чашке, завернутой в жидкий азот, охлаждённым жидким азотом.
5. Нанесите 3 мкл образца апоферритина на сетку с разрядом светящегося. Немедленно витрифицируйте образец в жидком этане
6. Перенесите образец из этана в ящик для хранения, предварительно охлаждённый жидким азотом. Подготовка криообразца завершена.
   ВНИМАНИЕ: При обращении с жидким азотом и этаном необходимо строго соблюдать следующие протоколы безопасности: Необходимо использовать средства индивидуальной защиты (например, криогенные перчатки и защитные очки) для предотвращения обморожений во время операций; Перед конденсацией этана убедитесь, что приёмная чашка свободна от жидкого азота, чтобы избежать брызг, вызванных быстрым кипячением; После использования надёжно закройте главный и регулирующий клапаны этанового газа для предотвращения утечки; Остатки этана и жидкого азота должны быть утилизированы в специальное вентиляционное оборудование в подготовительной комнате после подготовки образцов.

2. Определение параллельных световых условий для электронной микроскопии

1. Перед выполнением параллельного выравнивания луча сначала отрегулируйте следующие параметры прицела: ступень на эуцентрической высоте, объективная линза в фокусе, nP наклон луча ppX/ppY, свободная от комы точка поворота X/Y, кома и стигма.
2. С помощью сетки с перекрестной решёткой подтвердите, что образец находится на эуцентрической высоте и правильном фокусе при увеличении SA 73 000× (без энергетического фильтра) в режиме нанозонда.
3. Переключитесь в режим дифракции (длина камеры: D750 мм) и вставьте объективную диафрагму 100 мкм (рисунок 1A, 1B).
4. Нажмите на вкладку «Регулировка» для диафрагмы объектива и используйте многофункциональные ручки X и Y, чтобы сдвинуть диафрагму объектива от центра так, чтобы край диафрагмы перекрывал золотые дифракционные кольца и частично закрывал центральное пятно (рисунок 1C).
5. Выведите заднюю фокальную плоскость объектива, регулируя дифракционную фокусировку с помощью ручки фокусировки, пока край диафрагмы объектива не станет максимально резким (рисунок 1D).
6. Регулируйте интенсивность луча (силу C2), пока ширина золотых дифракционных колец не будет минимизирована.
7. Центрируйте диафрагму объектива. Увеличите длину дифракционной камеры до тех пор, пока не станет видно только центральное пятно (рисунок 1E).
8. Кликните на вкладку «Дифракция» в панели Stigmator и используйте многофункциональные ручки X и Y, чтобы отрегулировать форму центральной точки, одновременно циклируя над и ниже точки перекрёстка, чтобы сделать луч круглым (рисунок 1F).
9. Регулируйте интенсивность луча, пока центральное пятно не будет минимизировано. Это создаст условия параллельного освещения. Поскольку условия параллельного освещения могут отличаться при зависимости от размера пятен, документируйте соответствующие настройки C2 для каждого часто используемого размера пятна, чтобы обеспечить быструю конфигурацию в будущих экспериментах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный размер пятна, используемый при сборе данных, зависит от увеличения и настройки диафрагмы C2; Нужно обеспечить выполнение изображения с оптимальной дозировкой для камеры.

3. Сбор высококачественных электронных томографических данных для образцов апоферритина

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе изложена стандартизированная процедура сбора томографических данных с высокой пропускной способностью, подходящая как для опытных пользователей, так и для новых исследователей.

1. Чтобы обрезать сетку и загрузить подготовленный криообразец в электронный микроскоп, уплотнительное кольцо вставьте в инструмент выравнивания, а подготовленную сетку разместите в центре уплотнительного кольца. Используйте пружинное перо, чтобы прикрепить C-образное кольцо к уплотнителю, закрепив образец между ними.
2. Вставьте Autogrid вертикально в слот кассеты, перенесите её в наночашку через рабочую станцию, а затем загрузите в электронный микроскоп.
3. Чтобы получить полный монтаж всей сетки с помощью SerialEM, запустите программное обеспечение SerialEM. Включите режим низкой дозы. Определите режим поиска при увеличении 115×
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение поиска обычно используется для получения карт больших территорий. Это увеличение устанавливается максимально низко, чтобы ускорить процесс отображения, при этом обеспечивая точность сшивки изображения.
4. Откройте файл Navigator. Перейдите в Navigator > Montaging & Grids > Set Full Montage. В диалоговом окне установить режим поиска; Сохраняйте изображения в формате BIN4. Нажмите «Старт » в разделе Управление монтажом.
5. Для калибровки полей поиска и просмотра в режиме поиска найдите хорошо узнаваемый ориентир (рисунок 2A). Нажмите «Добавить маркер » в навигаторе. Нажмите «Перейти к маркеру », чтобы перейти к месту маркера.
6. Переключитесь в режим View (2600×) и найдите тот же ориентир. Кликните на ориентир. Перейдите в Navigator, нажмите Shift to Marker , чтобы выровнять поля (рисунок 2B). Следуя подсказкам в диалоговом окне, сдвиги луча от обоих увеличений назначаются всем маркерам на карте поиска, а значения сдвига сохраняются (рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение обзора обычно устанавливается на минимальное увеличение выбранной области (SA), чтобы обеспечить одинаковый режим обзора и записи, что облегчает процесс центрирования при переключении увеличения.
7. Для калибровки полей просмотра и записи (рисунок 3). В режиме View найдите хорошо узнаваемый ориентир. Переключитесь на режим записи (120k×). Используйте мышь, чтобы центрировать ориентир в режиме записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка увеличения записи зависит от предполагаемого разрешения цели (где разрешение цели вдвое превышает размер пикселя) и размера выборки.
8. Переключитесь обратно в режим View и сделайте снимок. Перетащите целевой объект под увеличением к перекрестку, обозначающему центр поля зрения, с помощью правой кнопки мыши.
9. Нажмите Set рядом с Shift в разделе Defocus, чтобы выровнять поля.
10. Чтобы выбрать целевой квадрат и запечатлеть карту среднего увеличения, 5.1 в полном монтаже, нажмите Add Polygon , чтобы обвести область, которую нужно запечатать. После того как вы обведете область, нажмите «Остановить добавление », чтобы окончательно определить выбор.
11. Повторите шаг 3.10 для всех желаемых областей. Для каждого полигона в Навигаторе проверьте Acquire (A) и New File в настройках Item (Items).
12. В диалоговом окне, которое появляется после отметки «Новый файл» на пункте, выберите следующее: Монтажные изображения; Монтаж с полигоном; Закройте файл, когда нужно открыть следующий новый файл. Нажмите OK.
13. В новом диалоговом окне выберите следующее: Переместить этап вместо сдвига изображения; Используйте параметры View в режиме низкой дозы. Сохраните изображение в указанном месте.
14. Чтобы запечатлеть карту среднего увеличения, в меню Навигатора нажмите «Получить предметы». Проверьте следующие опции: Получить и сохранить изображение или монтаж; Создайте карту Navigator.
15. В разделе «Основное действие» отметьте режим «Использовать просмотр» для захвата изображений. В разделе «Задачи до или после» отметьте «Грубая евцентричность». Нажмите GO, чтобы начать захват карты среднего увеличения.
16. Для выбора точек на карте среднего увеличения. Откройте карту среднего увеличения в интерфейсе Navigator. Нажмите «Добавить точку» и левой кнопкой мыши по целевым объектам на карте.
17. Повторяйте для всех желаемых очков. После выбора всех точек нажмите Stop Addition , чтобы завершить выбор.
18. Для выравнивания диафрагмы используйте прямые выравнивания в интерфейсе микроскопа для регулировки nP наклона пучка ppX/ppY и безкомовой точки поворота X/Y, минимизируя колебание пятна пучка в поле зрения.
19. Выполните tune scope, используя скрипт из библиотеки скриптов SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Для начала сбора томографических данных в интерфейсе Navigator определите ROI и проверьте Tilt Series. В диалоговом окне выберите Кадры Изображения; Выберите место хранения данных.
21. В диалоге с настройками установите диапазон градусов от -50° до 50°. Установите базовое увеличение на 2,5°, стартовый угол 0° и включите схему Дозосимметричная схема.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки дозы на наклон, диапазона угла наклона и шага наклона обычно следуют приведённым ниже принципам: общая доза поддерживается примерно на уровне 100 e⁻/Ų. Диапазон наклона выбирается так, чтобы даже при наибольшем углу наклона образец оставался практически непрепятственным и обеспечивал достаточную передачу и визуализацию электронов. Если диапазон наклона относительно велик (например, выше ±60°), шаг наклона можно установить на 3°. Для меньшего диапазона наклона (например, около ±50°) шаг наклона можно уменьшить до 2,5° или 2°, чтобы общая доза оставалась около 100 e⁻/Ų. Это особенно важно для микроскопов на 200 кВ, где радиационное повреждение более выражено по сравнению с микроскопами на 300 кВ, что делает крайне важным избегать чрезмерной общей дозы.
22. В разделе «Интенсивность луча» или «Контроль экспозиции» отметьте «Сохранить интенсивность луча». Установить цель дефокуса на -3 мкм и установить частоту автофокуса на один раз на наклон.
23. Проверьте Стоп, если Autoalign смещает размер изображения более чем на 60%, установите Track Before и after.
24. Чтобы начать сбор данных, в Навигаторе нажмите «Получить в предметах». В основном действии проверьте цикл дефокусировки цели в автофокусе, ожидании дрейфа и TS.
25. Установьте диапазон дефокуса от -3,5 до -4,5 мкм в 4 шага. В разделе «Общее» включите клапаны «Закрыть колонку» в конце. В разделе «Задачи до или после» включите «Перевыравнивание до элемента » и «Тонкая евцентричность перед «Первичным».

4. Субтомограммное усреднение апоферритина

1. Выполните коррекцию движения и оценку CTF с помощью^{Warp 19}. Проведите томографическое выравнивание по наклону с помощью AreTomo3²⁰.
2. Выполните томографическую реконструкцию и деконволюцию с помощью варпа. Выполните шаблонный выбор частиц с помощью PyTom²¹.
3. Проведите начальную доработку с помощью RELION 5²². Проводите доработку высокого разрешения с помощью^{M 23}.
4. Определить окончательную структуру путём обработки восьми серий наклона, затем выбрать 5 939 частиц и итеративно доработать, достигая конечного разрешения 2,8 Å (рисунок 4).

Results

После точного выравнивания параллельных пучков мы провели томографический сбор данных по апоферритину с использованием графической функции интерфейса SerialEM. Последующая обработка с использованием Warp, AreTomo, PyTom, RELION и другого релевантного программного обеспечения дала итоговую структуру с разрешением 2,8 Å. Это разрешение достаточно демонстрирует высокое качество наших данных, достигая уровня, который сейчас можно достичь при усреднении субтомограммы с относительно высоким разрешением. Как показано на рисунке 4, выровненные и реконструированные результаты (рисунок 4A) ясно демонстрируют общую архитектуру и пространственное распределение апоферритина. Субтомограммное усреднение проводилось на частицах, извлечённых из восьми выровненных и реконструированных рядов наклона, что дало структуру с разрешением 2,8 Å (рисунок 4B). Соответствующая кривая корреляции оболочки Фурье (FSC) представлена на рисунке 4C.

Рисунок 1: Определение условий параллельного освещения с помощью второй конденсорной линзы. (A) Дифракционная картина в дифракционном режиме без диафрагмы. (B) Дифракционная картина после установки объективной апертуры 100 мкм. (C) Смещение диафрагмы от дифракционного центра для лучшей визуализации резкости кромки. (D) Фокусировка края диафрагмы и оптимизация дифракционных колец путём регулировки токов объектива и объектива C2. (E) Эллиптическое центральное дифракционное пятно, требующее коррекции через панель стигматора. (F) Круговое и минимизированное центральное дифракционное пятно, указывающее на оптимизированное параллельное освещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Процесс выравнивания увеличения от Search (115×) до View (2600× ).(A) Изображение в режиме поиска с маркером (красной стрелкой), расположенным по краю отверстия. (B) Изображение в режиме просмотра с маркером (красной стрелкой), расположенным в том же месте объекта, что и в (A). В навигаторе нажимается опция Shift to Marker. (C) В всплывающем окне сдвиги луча из обоих увеличений назначаются всем маркерам на карте поиска, и значения сдвига сохраняются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Процесс выравнивания увеличения от View (2600×) до Record (120k×). (A) В режиме записи целевой объект располагается в центре поля зрения (красный пунктирный круг выделяет целевой объект). (B) Изображение, снятое в режиме просмотра, где целевой объект не совпадает с красным прицелом (красный пунктирный круг выделяет целевой объект и красный прицел). (C) Целевой объект перетаскивается к центру красного прицела с помощью правого клика и перемещения его, затем нажатия кнопки Set , расположенной рядом с кнопкой Shift (красная пунктирная точка выделяет эту кнопку). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Определение структуры апоферритина. (A) Структурная визуализация. Локальная карта разрешения итогового среднего субтомограммы. Текстура выглядит однородной, с плотно расположенными, повторяющимися наномасштабными элементами по всему полю зрения. (B) Пространственно разрешённое количественное отображение. Ложноцветная, круглая карта той же или родственной наноструктурированной области. Цвета варьируются от синего/зелёного до жёлтого/красного, что соответствует числовым значениям, указанным на цветовой шкале ниже (примерно от 2,5 до 3,5 в произвольных единицах). Гетерогенное цветовое распределение указывает на пространственное различие измеряемого свойства (например, высота, толщина, показатель преломления или механическое/оптическое отклик) по всей образце. (C) Глобальная спектральная или функциональная характеристика. Кривая корреляции оболочки Фурье (FSC) используется для оценки разрешения. Конечное разрешение 2,8 Å обозначается пунктирной линией при FSC = 0,143. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Процедуры подготовки криообразцов и сбора данных электронной томографии должны быть адаптированы к конкретному типу образца. Описанная здесь экспериментальная стратегия хорошо подходит для биологических макромолекул, белковых комплексов и мелких органелл. Эти образцы могут быть непосредственно витрифицированы на электромагнитные сетки, а их относительно небольшая толщина обеспечивает эффективную передачу электронов и получение изображений с высоким контрастом. В идеале толщина образца не должна превышать 200 нм.

Для образцов, замороженных при погружении, обычно предпочтительнее боковое измерение менее 10 мкм, чтобы минимизировать образование кристаллического льда, что может нарушить структурную целостность. Для больших образцов замораживание под высоким давлением или включение криопротекторов, таких как глицерин, в буфер может задержать нуклеацию^{льда 23}. Однако для удовлетворения требований по толщине TEM часто требуется дополнительное истончение. Среди доступных методов разрежения наиболее широко применяется фрезерование с фокусированным ионным пучком (^{FIB) 24}благодаря своей точности и минимальным повреждениям, что позволяет создавать ламеллы, подходящие для высокоразрешающей крио-ET.

Во время сбора данных о ламелях крайне важно максимально эффективно использовать её. Внедрение сдвига изображения луча позволяет снизить необходимость повторяющихся этапов фокусировки и отслеживания, тем самым увеличивая пропускную способность сбора данных. Хотя эта техника здесь подробно не описана, она подробно описана в методологии PACEtomo.

В настоящее время популярными программными вариантами для сбора томографических данных являются томография (Thermo Fisher Scientific) и SerialEM. Томография — это коммерческое решение с ограниченной гибкостью для настройки, тогда как SerialEM, разработанный Дэвидом Мастронардом из Университета Колорадо в Боулдере, — это программное обеспечение с открытым исходным кодом, поддерживающее автоматизацию на основе скриптов. Однако полное использование возможностей SerialEM требует значительной кривой обучения. В этом исследовании мы представляем упрощённый рабочий процесс, использующий графический интерфейс SerialEM, устраняя необходимость в скриптовом или Python-конфигурациях и позволяя самостоятельно собирать данные за одну ночь.

Частой проблемой при сборе томографических данных с использованием этого метода является неточное отслеживание, что может привести к неполным наклонным рядам с отсутствующими углами или усложнять последующее выравнивание. Для устранения этих проблем параметры отслеживания необходимо оптимизировать с учётом контраста образца и устойчивости наклонной стадии. Эффективные стратегии включают регулировку времени экспозиции в позициях отслеживания для обеспечения чёткости изображения, физическое разделение положений отслеживания и фокусировки для снижения накопленного радиационного повреждения, а также уменьшение увеличения при низкой стабильности ступени для надёжного сопоставления картины. В совокупности эти корректировки необходимы для достижения надёжной эффективности отслеживания в различных экспериментальных условиях. В этой работе мы используем апоферритин в качестве модельного образца. В рамках тестирования и коррекции параллельного света мы используем встроенные функции SerialEM для сбора высококачественных данных для крио-ET и проведения субтомограммных расчётов образцов ферритина, в итоге получая итоговую структуру на уровне 2,8 Å.

Этот метод был разработан для расширения применимости электронных микроскопов на 200 кВ для высококачественных крио-ЭТ. Достижение такого разрешения по сути зависит от получения высококачественных изображений, что, в свою очередь, требует точных условий освещения. Для этого мы выполнили точное параллельное выравнивание освещения в качестве критического подготовительного этапа. Описанная здесь процедура выравнивания специально разработана для TEM, оснащённых двухконденсаторной линзовой системой, таких как Thermo Fisher Scientific Talos Arctica и Glacios. В отличие от приборов с третьей конденсорной линзой (C3), эти системы ограничивают условие параллельного освещения одним специфическим значением возбуждения линзы C2. Это внутреннее ограничение требует исключительно точного выравнивания электронного пучка для размещения исходного изображения в передней фокальной плоскости верхней объективной линзы — необходимого условия для оптимальной характеристики изображения. Наши последующие результаты обработки данных показывают, что после такого выравнивания качество сбора данных, достигнутое с помощью этого микроскопа на 200 кВ для протестированных образцов, почти сопоставимо с тем, что обычно ожидается от прибора на 300 кВ.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM нити-сетка	Najingdingxin	M04240922A	используется для подготовки криообразца
апоферритин	Биортус	BP17854-00A	используется для подготовки криообразца
Сетка с перекрестной решёткой	Agar Scientific	AGS106	используется для определения параллельных условий освещения
Glacios2	Термо Фишер	9959084	Используется для сбора данных TOMO
Фильтровая бумага номер 2, 55 мм	Уотман	10311807	Промокательная бумага
PELCO easiGLOW	ТЕД ПЕЛЛА	91000-01020	Используется для свечения
Куантифойл-сетка Cu	Квантофольга	N1-C14nCu30-01	используется для подготовки криообразца
Vitrobot Mark IV	Термо Фишер	230101164	используется для подготовки криообразца