Гибкая процедура проведения теломер FISH и иммунофлуоресценции в клетках, экспрессирующих флуоресцентные белки

Краткое содержание

В данном протоколе описан способ комбинирования теломер FISH (нативных или денатурирующих) с иммунофлуоресценцией и/или визуализацией флуоресцентного белка.

Аннотация

Визуализация теломер с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (TelFISH) уже давно является важным инструментом в экспериментах по биологии теломер. Сочетание TelFISH с иммунофлюоресценцией (IF) также является хорошо зарекомендовавшим себя методом (IF-TelFISH), например, для выявления очагов, вызванных дисфункцией теломер, где теломеры совместно локализуются с 53BP1. В последнее время нативные теломеры FISH (nTelFISH) стали важным инструментом для определения альтернативного удлинения теломер, механизма поддержания теломер, используемого в некоторых опухолевых клетках. Экспрессия флуоресцентных белков также является важным инструментом в клеточной биологии, позволяя визуализировать белки и структуры, которые могут оставаться необнаруживаемыми другими методами. Поскольку буферы FISH денатурируют белки, проведение анализа в клетках с экспрессированным флуоресцентным белком (FP) приводит к потере сигнала FP. Здесь описан метод интеграции IF и теломер FISH в клетках с экспрессированным флуоресцентным белком, сохраняющим сигнал FP даже после FISH. Предложены альтернативы для денатурации и нативных теломер FISH в сочетании с несколькими сценариями ПЧ и ФП. В совокупности этот протокол предлагает гибкую основу для изучения биологии теломер как в нормальных, так и в опухолевых клетках.

Введение

Организмы с линейными хромосомами должны бороться с двумя проблемами. Во-первых, из-за проблемы репликации концов хромосом немного разрушаются каждый раз, когда ДНК реплицируется. Во-вторых, клетки должны быть в состоянии отличать естественные концы ДНК от разрывов ДНК. Теломеры появились как решение этих проблем. Под действием теломеразы рибонуклеопротеина хромосомы удлиняются за счет добавления коротких тандемных повторов TTAGGG у человека. Эти повторы связаны комплексом шелтерин, который скрывает конец хромосомы от механизма репарации повреждений клеточной ДНК¹. Короткие или дисфункциональные теломеры приводят к клеточному старению и фенотипу старения², в то время как бегство от кризиса теломер является важной вехой в онкогенезе³. По этим причинам биология теломер представляет особый интерес для понимания здоровья и болезней человека.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) уже давно является важным методом визуализации теломер в интерфазных клетках или метафазных спредах⁴. На протяжении десятилетий теломеры FISH сочетали с иммунофлуоресцентным окрашиванием (IF) 53BP1 для выявления очагов, вызванных дисфункцией теломер (TIFs), маркера дисфункциональных, неограниченных теломер ^5,6. Аналогичным образом, отличительной чертой опухолей, использующих альтернативное удлинение теломер (АЛТ) для поддержания теломер, является ассоциация теломер с ядерными PML-телами с образованием ALT-ассоциированных PML-телец или^APBs7. APB можно анализировать путем сопряжения теломер FISH с окрашиванием PML IF. Таким образом, IF-FISH является хорошо зарекомендовавшим себя инструментом в биологии теломер.

В данном случае использование IF-FISH было расширено по двум направлениям. Во-первых, IF-FISH проводится на клетках с экспрессией флуоресцентных белков (ФБ). Экспрессия флуоресцентно меченных белков стала повсеместным инструментом в клеточной биологии. Экспрессия меченого белка может быть единственным вариантом визуализации белка, для которого не существует хороших антител. Например, меченная GFP ядерная актиновая хромотела (nAC-GFP) показывает динамику ядерного актина⁸. Этот реагент открыл новые возможности в исследовании ядерного f-актина, что когда-то считалось спорной темой. В то время как FP, такие как GFP и mCherry, обычно сохраняют флуоресцентную активность после фиксации, формамид в буферах для гибридизации FISH делает их темными⁹. Чтобы обойти эту проблему, этот протокол предлагает инновацию в виде меченного флуорофором анти-FP «бустера» на вторичной стадии окрашивания IF. На яркость флуорофора не влияет формамид, что позволяет IF-FP-FISH.

Во-вторых, ИФ проводится в сочетании с нативной теломерной FISH (nTelFISH), важной диагностикой статуса АЛТ. При денатурации FISH необходимо использовать какой-либо способ расплавления нитей ДНК¹⁰ (например, тепло или щелочь), обеспечивая зондирующий доступ к ДНК, которая обычно является двухцепочечной. В отличие от этого, нативная FISH не включает в себя стадию денатурации, поэтому зонд может получить доступ только к ДНК, которая уже является одноцепочечной. Нативные теломеры FISH специфически обнаруживают одноцепочечные повторы С-цепи теломер, что является еще одним отличительным признаком АЛТ в опухолевых клетках^11,12. Сочетание этого анализа с окрашиванием IF-FP позволяет нам ответить на новые вопросы в понимании механизма АЛТ, который в настоящее время считается сильным кандидатом на таргетную терапию опухолей.

Описанный здесь протокол может быть использован в стиле «выбери свое собственное приключение» для окрашивания любой комбинации IF, FP и либо нативных, либо денатурирующих теломер FISH. Поскольку протокол обладает широкими возможностями настройки, временные рамки могут существенно различаться. Вообще говоря, требуется время для практических занятий в течение четырех дней, но эти дни могут быть непоследовательными. Оценка времени, необходимого для завершения типичного рабочего процесса денатурации FISH, приведена на рисунке 1. Нативные FISH не обязательно должны быть гибридизированы за одну ночь, поэтому потенциально можно исключить ночной шаг (совмещение дня 2 и дня 3), если возможен долгий день на скамейке.

Типичный конфокальный микроскоп вмещает четыре цветовых канала: грубо говоря, синий, зеленый, красный и дальний красный. Демонстрируются четыре примера потенциальных четырехцветных комбинаций, но потенциальные перестановки бесконечны. С одинаковым успехом можно использовать два антитела к ПЧ или два экспрессированных ФП. Протокол прост и надежен. Подходит любое антитело, которое само по себе дает хорошие результаты ИФ. Несмотря на то, что сюда включены только теломерные зонды для FISH, денатурация FISH с помощью центромерного зонда также дает хорошие результаты. Таким образом, этот протокол обеспечивает широкую степень гибкости для ответа на важные вопросы ядерной биологии.

Протокол

Прежде чем начать, рассмотрите микроскоп, клеточную линию, экспрессирующую FP, а также доступные зонды и антитела. Синий обычно используется для окрашивания ДНК, такого как DAPI, поскольку синие флуорофоры обычно не яркие. При необходимости можно использовать синие вторичные антитела. Если клетки экспрессируют GFP, можно использовать зонд FISH, помеченный красным флуорофором, вместе с вторичным антителом к IF, меченным AF-647. В качестве альтернативы для визуализации клеток, экспрессирующих mCherry, могут быть выбраны вторичное антитело IF, меченное AF-488, и зонд FISH, меченный AF-647. Примеры четырех возможных комбинаций IF-FP-FISH показаны на рисунке 2 и предназначены в качестве руководства для поощрения гибкости экспериментального дизайна. Важно выбирать либо нативную, либо денатурирующую FISH, так как эти методы невозможно совместить. Здесь описан надежный метод промывки покровных стекол кислотой, обеспечивающий адгезию ячеек. Это можно сделать в любое время перед использованием, а стерильные покровные талоны можно хранить неограниченное время. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Кислотная промывка покровных накладных

ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные покровные стекла должны быть очищены и промыты кислотой, чтобы обеспечить прилипание культивируемых клеток. Для роста в 12-луночных планшетах идеально подходят круглые покровные стекла 18 мм. Проконсультируйтесь с основным микроскопическим центром, чтобы определить, какие покровные стекла являются предпочтительными: #1 или #1.5. Заявленные сроки чистки покровных накладок не являются критичными, но не стоит скупиться на кислотную стирку.

1. С помощью щипцов покровного стекла (рис. 3A) поместите покровные стекла в стойки так, чтобы их поверхности не соприкасались. При необходимости разместите дополнительные покровные крышки по диагонали, чтобы увеличить вместимость (Рисунок 3B). Удобно поместите в тарелку для окрашивания несколько решеток (рис. 3C).
2. Наполните тарелку водой и небольшим количеством моющего средства. Аккуратно опустите решетки с покровными листами в блюдо.
3. Помешивайте покровные стекла в мыльной воде в течение 30 минут с помощью коромысла или нутатора.
4. Поднимите решетки с покровными стеклами из формы для окрашивания. Утилизируйте мыльную воду.
5. Промойте посуду для окрашивания и наполните ее деионизированной водой. Верните стойки с покровными стеклами в чистую воду и поставьте на качалку для осторожного взбалтывания в течение 5 минут.
6. Повторите полоскание с двумя дополнительными сменами чистой деионизированной воды, всего три полоскания.
7. Поднимите решетки с покровными стеклами из формы для окрашивания. Добавьте в блюдо 1 N HCl.
   ВНИМАНИЕ: HCl является едким. Обращайтесь в вытяжной шкаф и используйте средства индивидуальной защиты. Осторожно опустите решетчатые покровные стекла в раствор кислоты. Убедитесь, что 1 N HCl полностью покрывает покровные стекла. Накройте форму для окрашивания крышкой.
8. Поместите форму для окрашивания, содержащую покровные стекла и раствор кислоты, в бак ультразвукового аппарата для ванны. Обрабатывать ультразвуком в течение 15 минут при температуре 55 °C.
9. Оставьте покровные стекла в кислотной ванне на ночь.
10. На следующий день осторожно снимите подставки с покровного стекла с формы для окрашивания. Утилизируйте 1 N HCl в соответствии с протоколами безопасности учреждения.
11. Промойте посуду для окрашивания и наполните ее деионизированной водой. Верните стойки с покровными стеклами в чистую воду и поставьте на качалку для осторожного взбалтывания в течение 5 минут.
12. Повторите полоскание еще с двумя сменами чистой деионизированной воды, всего получится три полоскания.
13. Поднимите решетки с покровными стеклами из формы для окрашивания. Опорожните посуду и наполните ее 70% этанолом. Верните решетки с покровными листами на блюдо и осторожно помешивайте в течение 5 минут.
14. Поднимите решетки с покровными стеклами из формы для окрашивания. Опорожните посуду и наполните ее 100% этанолом. Верните решетки с покровными листами на блюдо и осторожно помешивайте в течение 5 минут.
15. Возьмите чашку со 100% этанолом и наложите на колпак для культуры тканей. В вытяжке снимите с посуды решетки с покровными стеклами и дайте им высохнуть на воздухе.
16. Опустошите тарелку и верните на нее стеллажи с покровными листами. Храните с закрытой крышкой для поддержания стерильности. Тарелка для окрашивания не является герметичной; Если покровные стекла оставить в этаноле, они со временем испарятся. Чехлы останутся пригодными для использования.

2. Гальванические ячейки на покровных стеклах

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с покровными слипами требует практики. Проще начать с 6-луночного планшета, пока он не будет уверен. При использовании планшета с 6 лунками удвойте объемы промывки, указанные для планшетов с 12 лунками.

1. Культивируйте здоровые, растущие клетки, экспрессирующие интересующий белок, помеченные GFP или mCherry (подходят несколько красных или зеленых FP; см. примечания в Таблице материалов). В приведенных примерах используются клетки остеосаркомы U2OS, которые используют АЛТ для поддержания теломер.
   1. Используйте временно трансфицированные клетки или клеточные линии со стабильной экспрессией FP. Если эксперимент требует медикаментозного лечения или трансфекции, учитывайте желаемую конфлюенцию в момент фиксации (обычно 70%-80%), продолжительность лечения и скорость роста клеток, чтобы рассчитать подходящее количество клеток для пластины на покровное стекло.
2. Подготовьте покровные стекла в капюшоне для сохранения стерильности. В каждую лунку 12-луночного планшета добавьте 1 мл стерильного PBS. С помощью щипцов покровного стекла поместите в каждую лунку по одному чистому, вымытому кислотой покровному стеколе. Осторожно помешивайте рукой в течение нескольких секунд.
3. Аспират PBS. Добавьте 1 мл свежего стерильного PBS на лунку. Отставьте тарелку в сторону.
4. (Дополнительный) Покровные покрытия покрыты фибронектином для улучшения клеточной адгезии. Многие адгезивные клеточные линии хорошо прилипают к вымытым кислотой покровным стеклам при нанесении покрытия не менее чем за 18 часов до фиксации. Если клетки плохо прилипают или требуют фиксации вскоре после нанесения, покройте покрывалом для улучшения адгезии.
   1. Приготовьте раствор фибронектина в концентрации 5 мкг/мл в стерильном PBS.
   2. Асасируйте PBS из покровных стекол. Аккуратно нанесите примерно 300 мкл раствора фибронектина на каждую покровную крышку, образуя каплю, удерживаемую поверхностным натяжением.
   3. Выдерживать в течение нескольких часов при 37 °C или в течение ночи при 4 °C.
   4. Промойте несколько раз PBS, удерживая покровные стекла в последней смене PBS. Отставьте тарелку в сторону на время подготовки ячеек.
   5. Если фибронектин не подходит, рассмотрите поли-L-лизин, коллаген или желатин в качестве альтернативы.
5. Трипсинизируйте клетки и разбавьте соответствующее количество в 12 мл питательной среды в соответствии с планом эксперимента и желаемой плотностью клеток при фиксации.
6. Отсадите PBS из покровных стекол и добавьте 1 мл клеточной суспензии на лунку.
7. Поместите клетки в инкубатор.
8. Обрабатывайте клетки по мере необходимости лекарствами, миРНК или другими реагентами в соответствии с планом эксперимента. Выращивание до нужного слияния.

3. Окрашивание IF-FP

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего протокола не допускайте высыхания покровных стекол. Желательно пипетировать одной рукой и отсасывать растворы другой, чтобы покровные стекла вышли из раствора на как можно меньшее время. Растворы пипетки аккуратно прижимайте к стенке лунки, а не непосредственно к покровному стеклу. Крепко, но аккуратно обращайтесь с покровными стеклами щипцами. Легко сломать покровный листок, схватившись за него со слишком большой силой. Для начала запланируйте дубликаты покровных бланков на случай поломки. С опытом порванные покровные слипы становятся редким явлением. Покровные стекла нельзя подбирать из сухого колодца. Покровные стекла должны быть покрыты буфером для забора.

1. Удалите носители и зафиксируйте клетки с помощью фиксатора по выбору. Промывать клетки перед фиксацией не нужно. Используйте 1 мл на лунку в 12-луночном планшете или 2 мл на лунку в 6-луночном планшете.
   1. Вариант 1: Используйте 4% формальдегида в PBS.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен. Обращайтесь в перчатках и утилизируйте надлежащим образом. Приготовьте свежий продукт, используя 16% формальдегид без метанола и 10x бульон PBS. Зафиксируйте на 15 минут при комнатной температуре.
   2. Вариант 2: Используйте 4% формальдегид в цитоскелетном буфере с сахарозой (КОС).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер предпочтителен для сохранения структуры цитоскелета¹³. КОС имеет конечную концентрацию 10 мМ MES pH 6,1, 138 мМ KCl, 3 мМ MgCl2_{, 2} мМ EGTA и 0,32 М сахарозы. Для приготовления фиксатора изготовьте 2x CBS stock с 20 мМ MES pH 6.1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Подготовьте отдельный 1,28 М бульон сахарозы. Храните оба приклада при температуре 4 °C. Для свежего рабочего фиксатора смешайте 1 объем 16% формальдегида, не содержащего метанола, 1 объем сахарозы и 2 объема 2x CBS. Зафиксируйте на 15 минут при комнатной температуре.
   3. Вариант 3: Зафиксировать метанолом при температуре -20 °C. Рекомендуется для мишеней антител к нуклеиновым кислотам (например, ssDNA, G-квадруплексы, гибриды РНК-ДНК). Зафиксируйте в течение 5 минут при температуре -20 °C.
2. Аспират фиксирует и утилизирует в соответствии с институциональной политикой.
3. Промойте покровные стекла несколько раз с помощью PBS.
   1. ТОЧКА ОСТАНОВКИ: Фиксированные покровные слипы могут храниться в PBS при температуре 4 °C в течение нескольких дней с минимальными потерями сигнала. Для более длительного хранения обезвоживайте до 100% этанола (2 минуты в 70% этаноле, 2 минуты в 90% этаноле, храните в 100% этаноле), закройте пластину лабораторной пленкой и храните при температуре -20 °C. Покровные листы могут храниться таким образом от нескольких недель до нескольких месяцев. Когда покровные стекла будут готовы к окрашиванию, увлажните покровные стекла (2 минуты в 90% этаноле, 2 минуты в 70% этаноле, 15 минут в PBS) и перейдите к следующему шагу.
4. Промойте покровные стекла в 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут при температуре 4 °C. Выполните этот шаг в тарелке.
5. Промойте покровные стекла несколько раз с помощью PBS.
6. Подготовьте увлажненную камеру (Рисунок 3D). На дно камеры положите влажные бумажные полотенца. Чтобы создать основу для окрашивания, нанесите этикетку на верхнюю часть крышки из 12-луночной пластины в соответствии с покровными стеклами.
   1. Накройте крышку лабораторной пленкой, чтобы этикетки оставались видимыми. Убедитесь, что камера герметична и закрыта плотно прилегающей крышкой. При необходимости накройте пленкой (Рисунок 3E).
7. Пипетка 75 мкл капает 100 мкг/мл РНКазы А в PBS на маркированную основу. Аккуратно возьмите каждую защитную салфетку и промокните край лабораторной салфетки, чтобы удалить излишки буфера. Инвертируйте покровные стекла на капли РНКазы А (клеточной стороной вниз). Поместите опору во увлажненную камеру и закройте крышку. Инкубировать в течение 45 минут при 37 °C.
8. Добавьте свежий PBS в 12-луночную тарелку. Верните покровные листы на пластину клеточной стороной вверх. Промойте несколько раз PBS.
9. Заблокируйте на 30 минут или дольше при комнатной температуре. Сотрите раствор РНКазы с подложки, покрытой пленкой. Пипеткой 75 мкл капли 20% сыворотки осляка из PBS на пленку. Переверните покровные стекла на блокирующий буфер (ячейкой стороной вниз).
10. Подготовьте первичное антитело.
    1. Используйте 75 μл на покровную крышку. Приготовьте дополнительно 10% на случай ошибки пипетирования.
    2. Разведите антитела в 5% сыворотке осла. Определить разведение антител опытным путем. Разведение в соотношении 1:100 является разумной отправной точкой.
    3. Во время блокировки подготовьте вторую меченую опору для первичной инкубации антител. Накройте крышку пленкой и нанесите капли 75 мкл разведенного антитела на обозначенные места.
11. В конце этапа блокировки перенесите покровные стекла на капли антител (клеточной стороной вниз). Поместите опору во увлажненную камеру, закройте крышку и выдерживайте не менее 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
12. Добавьте свежий PBS в 12-луночную тарелку. Верните покровные листы на пластину клеточной стороной вверх. Стирать в PBS три раза по 5 мин каждый при комнатной температуре с покачиванием.
13. Во время окончательной промывки подготовьте вторичные антитела.
    1. Используйте 75 μл на покровную крышку. Приготовьте дополнительно 10% на случай ошибки пипетирования.
    2. Для флуоресцентных вторичных антител и бустерных антител GFP/RFP рекомендуется разведение в соотношении 1:400. При необходимости корректируйте в зависимости от опыта работы с целью.
    3. Разведите вторичные антитела в 5% ослиной сыворотке. Нанесите капли объемом 75 мкл на соответствующие места на маркированной подложке.
14. После промывки перенесите покровные стекла на вторичные капли антител (клеточной стороной вниз). Инкубировать не менее 30 минут при комнатной температуре в герметичной увлажненной камере.
15. Добавьте свежий PBS в 12-луночную тарелку. Верните покровные листы на пластину клеточной стороной вверх. Стирать в PBS три раза по 5 мин каждый при комнатной температуре с покачиванием.

4. Повторное закрепление и обезвоживание

1. Приготовьте 4% формальдегид в PBS при комнатной температуре для повторной фиксации. Используйте формальдегид для этого этапа, даже если для первоначальной фиксации использовался метанол. Снимите последнюю промывку PBS и снова зафиксируйте ячейки на 15 минут с легким покачиванием.
2. Аспирируйте фиксатор и утилизируйте его в соответствии с институциональной политикой.
3. Промойте покровные стекла несколько раз с помощью PBS.
4. Обезвоживайте покровные листы и просушите на воздухе для подготовки к гибридизации:
   1. Инкубировать в 70% этаноле в течение 2 минут.
   2. Инкубировать в 90% этаноле в течение 2 минут.
   3. Инкубировать в 100% этаноле в течение 2 минут.
   4. После 100% этанола поместите покровные стекла ячейкой вверх на фильтровальную бумагу с этикеткой, чтобы сохранить ориентацию. Дайте им полностью высохнуть на воздухе во время подготовки зонда FISH.

5. РЫБА (ВАРИАНТ 1): Денатурирующая РЫБА

1. Подготовьте две опоры для фольги (см. рисунок 3F).
   1. Сложите кусок алюминиевой фольги на четвертинки, чтобы получилось четыре слоя. Убедитесь, что тусклая сторона обращена наружу.
   2. Обрежьте сложенную фольгу так, чтобы она поместилась внутрь крышки 12-луночной пластины. С помощью лабораторной салфетки потрите фольгу о внутреннюю часть крышки так, чтобы выступы крышки выдавили узор на фольге. Это создаст выступы, которые предотвратят скольжение покровных стекол друг в друга во время последующих этапов.
   3. Подготовьте две такие опоры. Они могут быть стерты и повторно использованы в более поздних экспериментах.
2. Разведите зонд 10 мкМ в соотношении 1:50 в гибридизационном буфере (70% деионизированный формамид, 10 мМ Трис, pH 7,4, 0,5% 10× блокирующий раствор Roche). Используйте 75 μл этого разбавленного зонда на покровное стекло и приготовьте дополнительно 10% для компенсации потерь при пипетировании. Конечная концентрация зонда должна составлять 200 нМ.
3. Разогрейте термоблок до 90 °C и термоамплификатор до 85 °C.
4. Денатурируйте покровные стекла: Положите высушенные на воздухе покровные стекла клеткой вверх на одну из подготовленных подложек из фольги. Аккуратно поместите фольгу на блок термоамплификатора и закройте крышку. Выдержать 5 минут до денатурации.
5. Одновременно нагрейте разведенный зонд в теплоблоке при температуре 90 °C в течение 5 минут.
6. Пипеткой капните 75 мкл денатурированного зонда на вторую подготовленную фольгированную подложку. Убедитесь, что тусклая сторона пленки обращена вверх, чтобы на ней могли образоваться хорошо сформированные капли. Если блестящая сторона находится вверх, зонд распространится и потеряет поверхностное натяжение.
7. Переверните денатурированные покровные стекла на капли зонда, расположив их клеткой вниз.
8. Перенесите опору из фольги с зондом и покровными стеклами в блок термоамплификатора, установленный на 85 °C, и инкубируйте в течение 5 минут. Используйте шпатель для помощи при переносе. Двигайтесь с осторожностью, чтобы не удариться или не сдвинуть покровные стекла.
9. Переместите фольгу с покровными стеклами и зондируйте во увлажненную камеру. Накрыть крышкой и выдерживать в течение ночи при комнатной температуре.

6. РЫБА (ВАРИАНТ 2): Местная РЫБА

1. Развести зонд 10 мкМ в соотношении 1:200 в буфере для гибридизации (70% деионизированный формамид, 10 мМ Трис, pH 7,4, 0,5% 10× блокирующий раствор Роша). Конечная концентрация зонда составляет 50 нМ. Используйте 75 μL на каждый покровный лист и приготовьте 10% больше, чтобы избежать ошибки пипетирования.
2. Нанесите капли разбавленного зонда объемом 75 мкл на обозначенные места на покрытой пленкой подложке.
3. Инвертируйте денатурированные покровные стекла на капли зонда объемом 75 μл, положив их клеточной стороной вниз.
4. Поместите опору во увлажненную камеру и закройте крышку. Выдерживать не менее 45 минут при комнатной температуре. При желании инкубация может быть продлена до ночи.

7. Мойка и монтаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная среда крепления зависит от числовой апертуры объектива микроскопа. Обратитесь за рекомендациями в местное центральное микроскопическое учреждение. Одним из подходящих вариантов может быть стекло ProLong с NucBlue, которое имеет показатель преломления 1,52. Тем не менее, альтернативный монтажный носитель может быть более подходящим в зависимости от имеющегося под рукой микроскопа.

1. Верните покровные стекла на 12-луночную пластину для промывки. Переверните их так, чтобы они были клеткой вверх.
2. Стирать 3× 10 мин в 70% формамид/10 мМ Трис, pH 7,5.
   ВНИМАНИЕ: Формамид токсичен; Утилизируйте его в соответствии с институциональной политикой.
3. Стирать 3× 5 минут в тротиле (0,05 М Трис/0,15 М NaCl/0,05% Твин-20, pH 7,5).
4. Промойте несколько раз в PBS. Если в монтажный материал не входит пятно DNA, рассмотрите возможность добавления DAPI в окончательную промывку. Чтобы окрашивать DAPI, добавьте 300 нМ DAPI в PBS, нанесите на покровные стекла и выдержите в течение 5 минут. Утилизируйте решение DAPI в соответствии с рекомендациями учреждения.
5. Закрепите покровные стекла на предметных стеклах с помощью капли монтажного носителя. Переверните покровные стекла на каплю: ячейкой вниз.
6. Дайте монтажному материалу застыть в течение ночи перед визуализацией.

Результаты

Типичные результаты работы с этим протоколом показаны на рисунке 4. При правильном выполнении морфология клеток будет хорошо поддерживаться, а флуоресцентные сигналы будут яркими. Денатурирующая теломера FISH должна выявлять узор из десятков точек в каждом ядре, представляющих каждую теломеру (см. рис. 4, примеры 1 и 2). Теломерные очаги должны присутствовать почти исключительно в ядре, хотя иногда происходит окрашивание цитоплазматических теломер, особенно в клеточных линиях АЛТ. Результирующие теломерные сигналы имеют тенденцию быть чрезвычайно яркими, настолько, что необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить утечку сигнала теломер в другие каналы обнаружения. В клеточных линиях АЛТ теломеры часто кластеризуются в PML-тельцах¹⁴, что приводит к меньшему количеству очагов, чем можно было бы ожидать. Эту кластеризацию можно наблюдать на рисунке 4, примере 2.

В клеточных линиях, использующих АЛТ для поддержания теломер, нативные теломеры FISH обнаруживают теломерную одноцепочечную ДНК, которая является отличительной чертой АЛТ^11,12. Не ожидается, что каждое ядро будет иметь теломерную ssDNA, или что в одном ядре будет присутствовать более небольшого количества точек (см. рис. 4, примеры 3 и 4). Сигнал нативных теломер FISH не будет таким ярким, как денатурирующие теломеры FISH. Клеточная линия остеосаркомы U2OS является хорошим положительным контролем для нативной FISH. Не ожидается, что одноцеклеточная ДНК теломер будет наблюдаться в клеточных линиях с теломерами, поддерживаемыми теломеразой.

Как для денатурирующих, так и для нативных FISH сильная ядрышковая флуоресценция является артефактной. Если наблюдается чрезмерный ядрышковый сигнал, попробуйте использовать свежий раствор РНКазы А или продлить лечение РНКазой А¹⁵ (шаг протокола 3.8). Для экспериментов с нативными теломерами FISH с использованием клеток с неизвестным статусом ALT для калибровки настроек обнаружения используется положительная клеточная линия ALT, такая как U2OS.

Наблюдения за FP в экспериментах IF-FP-FISH можно легко сравнить с экспериментами по визуализации живых клеток для валидации. Если наблюдаются расхождения, попробуйте изменить условия фиксации. Фиксация в буфере CSB (Шаг протокола 3.1.2) может быть полезна для сохранения клеточных структур, выявляя более точную локализацию FP¹³.

Иммунофлуоресцентное окрашивание широко варьируется в зависимости от интересующего белка. Результаты IF следует сравнивать с образцами, приготовленными без FISH, чтобы оценить влияние протокола FISH на локализацию и интенсивность интересующего белка. В целом, эксперименты IF-FP-FISH подходят для подсчета очагов, но интенсивности могут быть не количественными⁶.

Рисунок 1: Пример рабочего процесса с предполагаемой продолжительностью. Может потребоваться дополнительный день, если первичная инкубация антител проводится в течение ночи. В случае с нативным FISH дни 2 и 3 иногда объединяются, хотя это приводит к увеличению времени стенда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Примеры успешных экспериментальных комбинаций, используемых с четырехцветной визуализацией. Примеры 1 и 2 денатурируют теломеры FISH, в то время как в примерах 3 и 4 используются нативные FISH. Обратите внимание, что этот протокол полезен при иммуноокрашивании двух целевых белков (пример 1), сочетая одно окрашивание FP и одно окрашивание IF (примеры 2 и 4), или при двух FP (пример 3). Репрезентативные результаты этих экспериментов приведены на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Оборудование, используемое в этом протоколе. (А) Покровные щипцы. В то время как прямые щипцы можно использовать для обработки покровных щипцов, угловые щипцы значительно облегчают задачу. (B) Покровные стекла для стирки. Обратите внимание, что в дополнение к прямому расположению стеллажей, покровные стекла также расположены под углом между соседними канавками для увеличения производительности. (C) Четыре стойки покровных салфеток в посуде для окрашивания. Стеклянная тарелка для окрашивания вмещает десятки стеллажей и непроницаема для мытья кислотой HCl. (D) Подготовленная увлажненная камера. Внешняя сторона покрыта фольгой для создания темной среды, сохраняя флуорофоры. Влажные бумажные полотенца на дне обеспечивают влажность. (E) Герметичная увлажненная камера. Плотно прилегающая крышка необходима для предотвращения высыхания. (F) Изготовление опоры из алюминиевой фольги. Тиснение гребней на обрезанной фольге помогает предотвратить скольжение покровных стеблей друг в друга на этапе денатурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативные результаты экспериментов с четырехканальной визуализацией, включая IF, FISH и экспрессированные FP. На панелях изображены фактические результаты экспериментов, описанных на рисунке 2. DAPI окрашивает ДНК, nAC-GFP выделяет ядерный f-актин, TelFISH и TRF2-mCherry маркируют теломеры, иммуноокрашивание PML маркирует ядерные тела PML, а nTelFISH выявляет теломерную ssDNA. Все клетки являются клетками остеосаркомы U2OS. Изображения были получены на конфокальном микроскопе со сверхвысоким разрешением. Пример 1: изображения были получены с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии; все остальные изображения были получены с помощью микроскопии структурированного освещения. Все масштабные линейки представляют 5 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Эксперименты с использованием IF-FISH уже давно являются основой в области теломер в качестве анализа напряжения теломер или обнаружения АЛТ ^5,6,16. В этом случае протокол расширяется за счет включения флуоресцентного белка. Кроме того, предлагается вариант нативных теломер FISH в виде ортогонального анализа АЛТ¹¹. Этот протокол прост в исполнении и надежно дает удовлетворительные результаты.

Работая на покровных листах с каплями антител или зондами ПНК, этот протокол разработан таким образом, чтобы быть экономным. Использование капель позволяет сохранить ценные реагенты. Напротив, альтернативы, такие как камерные суппорты, стоят дорого и обеспечивают меньшую гибкость. В то время как работа с покровными листами требует практики для развития навыков, экономия средств делает вложение времени оправданным. Следует отметить, что капли реагента размером более 75 мкл не рекомендуются. Более крупные капли просто приводят к скольжению покровных стекол и не улучшают результаты.

Экспрессия nAC-GFP является незаменимым инструментом для визуализации ядерного f-актина⁸, как показано на рисунке 4. Существует множество других меченых реагентов, которые могут помочь ответить на важные биологические вопросы. Например, плазмидная система FUCCI может быть использована для визуализации клеточного цикла, и с помощью этого протокола может быть объединена с теломерами FISH¹⁷. Другой подход к анализу клеточного цикла может использовать хромотело PCNA для получения информации о клеточном цикле^. В зависимости от задаваемого вопроса, многие реагенты с маркировкой FP доступны в продаже.

Здесь этот протокол продемонстрирован на примере теломер FISH, но успешные результаты были достигнуты и с помощью centromere FISH с использованием зонда PNA в той же концентрации. Например, можно мультиплексировать центромерный зонд с меченым FAM зондом с теломерным зондом, меченным Cy3. Важно подчеркнуть, что протокол вряд ли будет работать с однолокусной ДНК FISH. Для зондирования одного локуса необходимо протеазное разложение образца, и это разложение явно несовместимо с обнаружением IF или FP¹⁹. Тем не менее, был достигнут успех в объединении IF и мРНК FISH с аналогичным подходом; очевидно, что этап лечения РНКазой в этом сценарии должен быть опущен.

Наконец, очевидно, что нативные теломеры FISH быстро становятся важным анализом для определения статуса АЛТ^20,21. В отличие от анализа С-круга для АЛТ, который основан на популяции²², нативные теломеры FISH обеспечивают считывание АЛТ на клеточном уровне, что позволяет чувствительно обнаруживать изменения в динамике АЛТ. Объединив нативные теломеры FISH с экспрессией IF и FP, можно получить важные сведения о механизме АЛТ. Мы надеемся, что со временем эти выводы приведут к созданию таргетной терапии опухолей, которые полагаются на АЛТ для поддержания теломер.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 % Подросток-20	Био-Рад	1610781	Выбросьте, если раствор мутный.
10x PBS	Gibco	70011044	Для приготовления фиксативных и других буферов используют постфиксацию
12-луночные планшеты для культивирования клеток	Нунк	150628
16% формальдегида, не содержащего метанола	Термо Сциентик	28908
5 М натрия хлорид	Миллипора Сигма	С6546
Адгезивные клетки, например, клетки остеосаркомы U2OS	АТКС	ХТБ-96
Герметичный бокс для увлажненной камеры	Папальщик	106415032500	Подойдет любая подходящая герметичная коробка, но остерегайтесь коробок с неровным дном.
Алконокс	Миллипора Сигма	Z742914
Алюминиевая фольга	Научный центр Фишера	01-213-100
Подходящая среда для культивирования клеток, например, McCoy's 5A	Gibco	16600082	для U2OS добавьте 15% FBS
Зонд Centromere (FAM)	Биография ПНА	Ф3001	Существует несколько флуорофоров
Плазмида ChromoTek Nuclear Actin-Chromobody (TagGFP)	Протеинтек	ACG-N
Усилители покровного стекла	Инструменты для точной науки	11251-33
Багажники Coverslip	Миллипора Сигма	Z688568
DAPI	Инвитроген	Д21490	Опционально, в случае, если монтажный материал не содержит пятен ДНК
Ослиная сыворотка	Иммуноисследования Джексона	017-000-121
ЭГТА	Био-Мир	40520008	0,5 м раствора pH 8,0
этанол	Уорнер-Грэм	200 пруф
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	A5670801
Фибронектин	Миллипора Сигма	Ф0635	Для дополнительного покрытия покровных стекол
формамид	Миллипора Сигма	47671-250МЛ-Ф
Немецкие стеклянные покровные стекла	Инфраструктура Warner	64-0714	CS-18R15 (#1.5 Толщина, подтвердите, что подходит для вашего микроскопа)
Усилитель GFP	Протеинтек	gb2AF488	признает GFP/mClover/YFP/Venus и другие.  Полный список см. в информации о продукте
Миска для окрашивания стекла с крышкой	Миллипора Сигма	900203
Ультразвуковой очиститель с подогревом и цифровым таймером	Брэнсон	КПС-952-218Р	Эта модель ультразвукового аппарата для ванны включает в себя нагрев, но не имеет настраиваемой мощности или интенсивности.
Соляная кислота	Миллипора Сигма	258148	Концентрированный HCl составляет 12 N.  Добавьте 20 мл концентрированной HCl к 220 мл деионизированной воды на 1 Н HCl
Раствор хлорида магния	Миллипора Сигма	63069	Решение 1 М
МЧС	Миллипора Сигма	475893
метанол	Миллипора Сигма	179337
Парафильм	США Сайентифик	3023-4526
Хлористый калий	Миллипора Сигма	П9541
первичное антитело  мышиный анти-PML	Санта-Крус	СК-377390
первичное антитело  кролик анти-53ВР1	Новус	НБ100-904
первичное антитело  кролик анти-PML	Абклональный	А1184
Продлить стекло с помощью NucBlue	Инвитроген	П36981
Усилитель RFP	Протеинтек	рб2АФ568	распознает mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Полный список см. в информации о продукте
РНКаза А	Миллипора Сигма	РНКЭАА-РО
Решение для блокировки Roche	Миллипора Сигма	11096176001
вторичное антитело, например, AF488 против мышей	Инвитроген	А-11001	Или что-то подобное
вторичное антитело, например, AF594 anti-rabbit	Инвитроген	А-11012	Или что-то подобное
вторичное антитело, например, AF647 против мышей	Инвитроген	А-21235	Или что-то подобное
шпатель	Научный центр Фишера	10257402
Стерильный PBS	Gibco	14190144	Для подготовки покровных накладок
сахароза	Миллипора Сигма	С0389
Зонд TelC (Cy3)	Биография ПНА	Ф1002	Существует несколько флуорофоров
Датчик TelG (AF647)	Биография ПНА	Ф1014	Существует несколько флуорофоров
База Трис	Миллипора Сигма	648311	Приготовьте 1 М раствор в воде, отрегулируйте pH с помощью HCl
Тритон Х-100	Миллипора Сигма	Х100
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный	Gibco	25200072
Микроскоп Zeiss Elyra	Цейсс		Или что-то подобное