Методическая статья

Массово-параллельный анализ сплайсинга для изучения ошибок сплайсинга, вызванных вариантами Intronic, связанными с заболеванием

DOI:

10.3791/68984

⸱

9 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Genome and Systems Biology Degree Program, Academia Sinica and National Taiwan University, 3Institute of Statistical Science, Academia Sinica

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем подробный протокол для проведения анализов массово-параллельного сплайсинга (MaPSy), в которых используются конструкции минигена для систематической оценки интронных вариантов в массовом порядке. Этот подход позволяет проводить высокопроизводительный анализ вариационно-индуцированных изменений сплайсинга в клетках с помощью ампликонного секвенирования, обеспечивая функциональную оценку их влияния на сплайсинг пре-мРНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ошибки сплайсинга составляют 10-30% патогенных мутаций, ответственных за редкие генетические нарушения. Сплайсинг РНК обеспечивает надлежащую экспрессию генов за счет избирательного присоединения экзонов и удаления интронов, при этом ключевые регуляторные последовательности расположены внутри интронов. 5'-сайт сплайсинга и сайт ветви взаимодействуют с малыми ядерными РНК, образуя комплекс распознавания сплайсосомы, в то время как такие элементы, как полипиримидиновый тракт и энхансеры/глушители сплайсинга, рекрутируют белки для регуляции сборки сплайсосом. Прогнозирование сбоев в сплайсинге от вариантов intronic является сложной задачей из-за сложности этих взаимодействий.

Варианты Intronic, составляющие 90% естественных вариаций генов человека, могут нарушить канонический сплайсинг и привести к заболеваниям. Чтобы исследовать эту возможность, мы разработали метод массивно-параллельного сплайсинга (MaPSy) для оценки интронных вариантов, идентифицированных пациентами. Синтезированные олигонуклеотиды с референтными или вариантными последовательностями лигировали в сплайсинг минигенов, содержащих промоторные и полиаденилированные сигналы. Каждая конструкция включала в себя два константных экзона, фланкирующих средний экзон, в котором находилась интересующая нас последовательность переходов интрон-экзон. Эффективность клеточного сплайсинга вариантных последовательностей сравнивалась с референсными аналогами, что позволило нам идентифицировать значительные нарушения как варианты сплайсинга.

Результаты MaPSy могут быть проверены с помощью дополнительных подходов, таких как анализ минигена или CRISPR-опосредованное редактирование генома in vivo. Кроме того, агрегированный анализ нарушенных соединений может дать более глубокое представление о механизмах сплайсинга и молекулярной основе заболеваний, связанных с ошибками сплайсинга.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сплайсинг РНК является важнейшим процессом, который соединяет экзоны для трансляции и удаляет интроны, облегчая экспорт РНК и поддерживая гомеостаз нуклеиновых кислот. Этот жестко регулируемый механизм действует во времени и пространстве, способствуя разнообразию и сложности транскриптома1. Сплайсинг управляется ключевыми сигналами, включая 5'-сайт сплайсинга (5'ss), сайт ветви и 3'-сайт сплайсинга (3'ss), а также дополнительные регуляторные элементы, такие как полипиримидиновый тракт ниже сайта ветви и зона отчуждения AG-динуклеотидов, которые способствуют распознаванию 3's2. Механически малая ядерная РНК U1 (snRNA) соединяется с 5's, в то время как сайт ветви взаимодействует с U2 snRNA3. Скоординированная активность сайта ветви, полипиримидинового тракта и 3's способствует связыванию малых нуклеопротеинов U2 (snRNP) и вспомогательных факторов U2, стабилизируя сплайсосому и позиционируя точку ветвления для нуклеофильной атаки на 5'ss, тем самым инициируя сплайсинг.

С быстрым развитием технологий секвенирования стоимость секвенирования всего генома продолжает снижаться, что приводит к постоянно расширяющемуся каталогу генетических вариантов человека. Подсчитано, что 10-30% мутаций, связанных с заболеванием при редких генетических заболеваниях, влияют на сплайсинг РНК 4,5,6, часто производя аберрантные продукты генов, которые могут служить терапевтическими мишенями. Тем не менее, оценка функционального влияния вариантов intronic остается сложной задачей из-за сложности сигналов сплайсинга, которые часто являются избыточными и вырожденными. В то время как 5'- и 3'-сайты сплайсинга относительно хорошо охарактеризованы, сайты ветвей, полипиримидиновые тракты и другие регуляторные элементы сплайсинга демонстрируют значительную вариабельность последовательности и положения у высших эукариот. Крупномасштабные исследования по картированию также продемонстрировали, что в пределах одного интрона 7,8,9,10 могут существовать несколько сайтов ветвей, что усложняет интерпретацию вариаций границ интрон-экзонов.

Глубокое обучение было использовано для оценки того, как первичные последовательности способствуют распознаванию сайтов сплайсинга 4,11,12, обнаружив, что варианты сплайсинга группируются в канонических сайтах сплайсинга, в то же время разрозненно расширяясь в экзон и 3'-область интронов. Эта закономерность согласуется с устоявшимся пониманием того, что выбор 5'-сайта сплайсинга в первую очередь продиктован консенсусными последовательностями, в то время как распознавание 3'-сайта сплайсинга зависит от дополнительных интронных элементов, таких как сайты ветвей и полипиримидиновые тракты. Тем не менее, существующие модели были обучены отличать конститутивные сайты сплайсинга от альтернативных или искусственных, а не сосредотачиваться только на вариантах интроники. В результате, эти вычислительные инструменты демонстрируют лишь умеренную прогностическую точность, в первую очередь идентифицируя сайты сплайсинга и варианты экзонного сплайсинга 13,14,15,16. В дополнение к прогностическим моделям, экспериментальная система, способная проверять варианты сплайсинга в большом объеме, значительно улучшила бы идентификацию и характеристику дефектов сплайсинга.

Всеобъемлющие данные секвенирования РНК, связывающие ассоциированные с заболеванием интронные варианты со сплайсинговыми фенотипами, остаются редкими из-за их низкой частоты и сложности прогнозирования результатов сплайсинга на основе существующих наборов данных. Чтобы восполнить этот пробел, были разработаны высокопроизводительные анализы сплайсинга и вычислительные модели для систематического анализа вариантов сплайсинга. Репортерные анализы массивно-параллельного сплайсинга (MaPSy) были разработаны для оценки влияния вариабельных последовательностей на выбор сайта сплайсинга. Включая вариации последовательностей вблизи 5' и 3'-сайтов сплайсинга или охватывая целые области интрон-экзонов в фиксированных скелетах минигенов, MaPSy позволяет проводить функциональную оценку изменений сплайсинга. Однако из-за ограничений объемного синтеза олигонуклеотидов в этом подходе не учитываются глубокие интронные варианты и активация псевдоэкзонов.

Устойчивость MaPSy была проверена с использованием 70 независимых минигенов сплайсинга, что дало корреляцию Пирсона, равную 0,8917. Примечательно, что примерно 90% вариантов донора сплайсинга (+1 и +2) имели дефекты сплайсинга, что подчеркивает точность анализа. Кроме того, MaPSy с рандомизированными последовательностями сайтов ветвей выявил вырожденную природу распознавания сайтов ветвей и его зависимость от белков ядра U218. Кроме того, дизайн MaPSy с расщеплением GFP в сочетании с флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS) был использован для исследования событий пропуска экзонов, вызванных генетическими вариациями. Этот подход показал, что 54% вариантов, разрушающих сплайсинг, находятся в интронных областях, включая канонические сайты сплайсинга13, что подчеркивает значительную роль интронных элементов в регуляции сплайсинга. В совокупности эти результаты подтверждают важность интронных последовательностей в контроле сплайсинга и демонстрируют полезность MaPSy в выявлении дефектов сплайсинга, связанных с заболеванием (рис. 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн анализа массово-параллельного сплайсинга (MaPSy) интронных мутаций, близких к экзонам. Варианты, задокументированные в базах данных о болезнях человека, были собраны и синтезированы в виде 5307 пар олигону. Каждая олигопара содержит референсный и вариантный аллель через 78-нуклеотидную (nt) интронную и 35-nt экзонные области. Олигоноса окружены общими сайтами прайминга для амплификации и лигирования в минигены сплайсинга 3-экзонов. Соответственно, синтезированный участок содержит 3's второго экзона минигена. После сборки минигенов объединенные минигены были сплайсингированы в эмбриональные клетки почки (HEK293T) человека. Полученные сплайсированные изоформы были собраны и разрешены с помощью ампликонового секвенирования. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Chiang et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез библиотеки олигонуклеотидов (олигонуклеотидов) MaPSy

  1. Базовая структура олиго: Спроектируйте каждый олиго в пуле 155-nuncleotide (nt) так, чтобы он включал 35-nt экзонную последовательность и 80-nt интронную последовательность, образуя 115-nt специфичную для гена область, окруженную 20-nt общими прайминговыми последовательностями на каждом конце (рис. 2A).
  2. Коллекция вариантов: Чтобы сохранить целостность мотива и сосредоточиться на регуляторных областях, влияющих на сплайсинг, соберите варианты intronic, которые:
    От -78 до +10 nt с 3-х
    От -3 до +30 NT с 5-х
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клинические варианты могут быть получены из ClinVar19, низкочастотных записей в dbSNP20, соответствующих публикаций и дополнительных клинических баз данных. Координаты генома могут быть использованы для пересечения вариантов с желаемыми областями генома (например, с помощью BEDTools21). Следует выбирать только однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и малые вставки/делеции (инделы) до 15 нт, чтобы свести к минимуму вариабельность размеров в пуле олиго для объемного синтеза.
  3. Базовая структура минигена: Для сохранения структуры соединения сплайсинга каждый каркас минигена содержит три экзона: два константных внешних экзона, кодирующих фрагменты EGFP (из pGint, Addgene Plasmid #24217) и средний экзон, полученный из экзона 15 CAMTA2 человека (рис. 2B). Расщепляйте фрагмент CAMTA2 и pGint с помощью ферментов рестрикции BamHI и SalI и лигируйте фрагмент CAMTA2 в pGint между экзонами EGFP, создавая трехэкзонные минигены pGint-CAMTA2 (Дополнительный файл 1).
    Примечание: Средний экзон, т.е. экзон CAMTA2 15, должен проявлять промежуточную эффективность сплайсинга при экспрессии в клетках-мишенях. Эта характеристика имеет важное значение, поскольку она обеспечивает сбалансированный исходный уровень, позволяющий обнаруживать как увеличение, так и снижение эффективности сплайсинга из-за вариативных эффектов.
  4. Проектирование сайта прайминга: Присоедините последовательность сайта вставки к обоим концам библиотеки так, чтобы каждый олиго содержал ~20-нт фланкирующие последовательности, которые перекрываются с предполагаемым сайтом вставки в пределах среднего экзона/интрона (рис. 2A).
    Примечание: Если олигопул предназначен для нескольких минигенных конструкций, то может быть включено несколько сайтов прайминга.
  5. Дизайн штрихкодов: Для вариантов intronic экзонные штрихкоды необходимы для отличия генотипов от сплайсированных продуктов, поскольку последовательности intronic теряются после сплайсинга. Чтобы избежать каких-либо изменений сплайсинга из-за последовательностей штрих-кодов (т. е. эффекта штрих-кода), расположите штрих-коды дистально внутри экзонов, вдали от сайтов сплайсинга (т. е. прямо рядом с экзонным сайтом прайминга).
    ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности рекомендуется использовать несколько штрих-кодов для каждого варианта. Необходимая длина штрих-кода зависит от сложности библиотеки. Например:
    Штрих-код 1-нт достаточен, если эталонный аллель сочетается только с одним вариантом.
    2-нт штрих-код предпочтительнее, если эталонный аллель сочетается с шестью различными вариантами.
    Библиотеки с несколькими вариантами, тесно связанными с одним референсным аллелем (например, отличающиеся только одним нуклеотидом), могут увеличить сложность анализа.
  6. Упорядочивание олиго: Упорядочивание олигон в формате FASTA, при этом каждый вариант соединения должен быть спарен рядом со своим эталонным аллелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для соединений с несколькими вариантами требуется только один референсный аллель на каждое соединение. Услуги объединенного синтеза последовательностей доступны в таких компаниях, как GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) и Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). Длина синтеза, емкость библиотеки и стоимость могут варьироваться в зависимости от поставщика и региона.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Дизайн минигена олиго и сплайсинга для MaPSy. (А) Конструкция для объединенного олигосинтеза 3'- или 5'-конца интронов. Диаграммы иллюстрируют основную структуру 155-нт олигонухов. Фактическая мощность олигосинтеза зависит от компании, выбранной для производства. (B) Дизайн минигенов MaPSy. Трехэкзонный миниген (ii) был модифицирован из плазмиды pGint (i), и сайты сплайсинга были заменены объединенными олигопластами для введения вариаций сигнала сплайсинга (iii). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Построение шаблонов ДНК MaPSy-библиотеки

  1. Первоначальное усиление при получении олигобассейна
    1. После получения пула олигон амплифицируют 10-50 нг олигобиблиотеки с сконструированными сайтами фланкирующего прайминга методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 100 мкл с использованием высокоточной ДНК-полимеразы для преобразования олигопластов в двухцепочечные (праймеры LibF и LibR в таблице 1, настройки термоамплификатора в таблице 2).
    2. Очистите продукты ПЦР с помощью очистительных колонок. В частности, свяжите продукт ПЦР с мембраной колонки, затем промойте буферами, содержащими 70% этанола, чтобы удалить остатки праймеров, солей и полимеразы. Наконец, элюируйте очищенный продукт ПЦР с помощью буфера с низким содержанием солей или воды, не содержащей нуклеаз.
    3. Проверьте размер амплигированного олиго с помощью гель-электрофореза. Загрузите 5 мкл очищенного продукта ПЦР в 1,5% агарозный гель, приготовленный в буфере 1× TAE (40 мМ трис-основание, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте циклы амплификации ПЦР до 15, чтобы предотвратить чрезмерную амплификацию и смещение ПЦР. Вторичная нечеткая полоса, обычно более крупная, чем целевой продукт, может указывать на чрезмерную амплификацию и неполный отжиг в олигопуле. Сохраните часть продуктов ПЦР и секвенируйте пул олиго, чтобы оценить качество и частоту ошибок, прежде чем продолжить (точка остановки).
  2. Построение минигенов сплайсинга MaPSy - Начальная ПЦР.
    1. Фрагменты скелета: используйте 0,5 нг плазмидного остова pGint-CAMTA2 в качестве источника для двух основных фрагментов ПЦР
      1. ПЦР Продукт 1: Амплифицируйте промотор ЦМВ, первый экзон (N-концевой EGFP) и часть первого интрона (Таблица 1 и Таблица 2).
      2. ПЦР Продукт 3: Амплифицируйте часть среднего экзона (CAMTA2 экзон 15), второй интрон, третий экзон (C-концевой EGFP) и сигнал полиаденилирования SV40 (Рисунок 3, Таблица 1 и Таблица 2).
    2. Библиотечный ампликон: ПЦР Продукт 2: Для библиотеки 3 ампликоны библиотеки ампликоны с перекрывающимися последовательностями на каждом конце, чтобы они соответствовали внутренним концам ПЦР Продукта 1 и ПЦР Продукта 3, что обеспечивает эффективную интеграцию в 3's экзона CAMTA2 15 (Рисунок 3, Таблица 1 и Таблица 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотеки 5's замените 5'-конец среднего экзонного перехода на библиотечную последовательность.
  3. После ПЦР очистите все продукты с помощью очистительных колонок как на шаге 2.1.2. Чтобы предотвратить загрязнение от вектора-шаблона, очистите нужные продукты от ПЦР1 и ПЦР3 путем экстракции агарозным гелем. В частности, после электрофореза следует удалить ~ 100 мг агарозного геля, содержащего целевой продукт ПЦР, и растворить его в связывающем буфере. Свяжите растворенный раствор геля с мембраной колонки, после чего приступайте к стандартному протоколу очистки ПЦР.
  4. Построение минигенов сплайсинга MaPSy - ПЦР с расширением перекрытия: Выполните один или последовательные раунды перекрывающейся ПЦР для лигирования трех основных фрагментов (ПЦР Продукт 1, библиотечный ампликон и ПЦР Продукт 3; используйте ~ 20 нг каждый в качестве шаблона) в полноразмерный миниген сплайсинга (используйте максимально внешние праймеры CAMGFPF и CMVGFPR в Таблице 1 и настройки термоамплификатора в Таблице 2).
    Примечание: Конечный продукт содержит промотор ЦМВ и три экзона, первые 3 из которых получены из библиотеки олигонуклеотидов, и он готов к трансфекции для экспериментов на клетках.
  5. После сборки очистите полноразмерные матрицы ДНК с помощью колонок для очистки ПЦР. Если в геле наблюдаются неспецифические полосы, выполните экстракцию геля, чтобы точно выделить желаемый полноразмерный продукт в соответствии с шагом 2.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень похожие последовательности в библиотеке могут привести к незавершенной сборке. Если полная сборка в одной ПЦР-реакции затруднена, можно попытаться провести последовательную перекрывающуюся ПЦР (начиная с двух фрагментов, а затем добавляя третий). Чтобы повысить специфичность ПЦР, рассмотрите возможность регулировки температуры отжига или внедрения ПЦР с приземлением для повышения специфичности связывания для сложных шаблонов. Подготовьте достаточное количество конструкций MaPSy для проведения как минимум четырех независимых экспериментов. Сохраните небольшую аликвоту каждой конструкции для секвенирования следующего поколения, чтобы проверить целостность последовательности, так как некоторые олигонуклеотиды могут неэффективно амплифицироваться и приводить к незавершенным сборкам (точка остановки).

figure-protocol-2
Рисунок 3: Рабочий процесс создания библиотеки. (A) Праймеры, используемые в перекрывающейся ПЦР (см. также Таблицу 1). (В) Порядок наложения ПЦР. Короче говоря, олигопулы и другие части минигенов сплайсинга были амплифицированы с помощью 25 циклов ПЦР. Фрагмент, содержащий промотор и первый экзон (продукт ПЦР 1), пришивали к пулу олигопласта (продукт ПЦР 2) путем перекрывающейся ПЦР с использованием 20 циклов амплификации. Затем сшитое изделие (ПЦР-продукт 1+2) дополнительно пришивали к фрагменту, содержащему3-й экзон и сигнал полиаденилирования (ПЦР-продукт 3), используя 20 циклов амплификации для получения конечной конструкции (ПЦР-продукт 1+2+3). Этот рисунок был адаптирован с разрешения Chiang et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Построение праймера MaPSy-библиотекизаметка
ЦМВГФПФCCGCCATGCATTAGTTATTAATAGПЦР продукт 1
Библиотека LibR2CAGGTCTTCAGGCCCCAGCCПЦР продукт 1
Библиотека LibFGGCTGGGGCCTGAAGACCTGПЦР продукт 2
БиблиотекарьAAGGCGCACATGACCCCGGGПЦР продукт 2
Библиотека LibF2CCCGGGGTCATGTGCGCCTTПЦР продукт 3
ЦМВГФПРGGACAAACCACAACTAGAATGCПЦР продукт 3
MaPSy-библиотека ПЦР-праймер для ампликонного секвенирования
P7-Lib0FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGNAAGTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3FGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
P5-Lib1RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
P5-Lib2RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTTATATAAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
P5-Lib3RITCGTCGGCAGCGTCAGATGTTATATAAGAGACAGNNNCGAAGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
Праймер для валидации
Lib0F (Проверка библиотеки)AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (Проверка библиотеки)CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Таблица 1: Праймеры, используемые в этом протоколе.

Реакционная смесь для ПЦР
КомпонентыТом
ддН2О13,4 мкл
5x ВЧ буфер4 мкл
10 мМ dNTP0,4 мкл
Прямой праймер 10 мкМ0,5 мкл
Обратный праймер 10 μМ0,5 мкл
кДНК1 μл
Высокоточная ДНК-полимераза0,2 мкл
Запустите программу ПЦР (реакция 20 мкл)
ТемператураВремяЦиклов
Первичная денатурация98°C1 мин1
Денатурация98°C30 с10–20
Отжиг65°C30 с
Расширение72°C30 сНазад к денатурации
Окончательное продление72°C5 мин1
Держать4°CДержатьДержать

Таблица 2: Настройки амплификатора.

3. Экспрессия и восстановление сплайсинговых минигенов из клеток млекопитающих

  1. Клеточная культура: Поддерживайте HEK293T клеток в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, а также 2 мМ L-глутамина в 5%CO2 при 37 °C.
  2. Трансфекция минигенов сплайсинга:
    1. Планшет 5 × 105 HEK293T клеток в 2 мл среды в 6-луночных планшетах за 24 ч до трансфекции.
    2. Трансфектируют клетки 1-2 мкг конструкций MaPSy, предварительно инкубируют в течение 5 мин с 3,75 мкл реагента для трансфекции, следуя протоколу производителя. Об успешной трансфекции свидетельствует наличие сигналов EGFP из сплайсированной библиотеки.
    3. Лизируйте клетки с помощью 250 мкл тризола (или его эквивалента) через 24 ч после трансфекции.
  3. Экстракция РНК: Извлеките общую РНК с помощью набора для мини-подготовки РНК, следуя протоколу производителя. В частности, связывать РНК в тризоле с мембранами колонок, промывать буферами, содержащими 70% этанола, для удаления солей, белков и других примесей, и элюировать очищенную РНК с помощью буфера с низким содержанием солей или воды, не содержащей нуклеаз.
    ВНИМАНИЕ: Тризол (или его аналог) обладает высокой коррозионной и токсичной способностью. Воздействие может привести к серьезным химическим ожогам, необратимым рубцам и почечной недостаточности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК можно хранить в тризоле (или эквивалентном реагенте на основе тризола, таком как экстрактор РНК TOOLSmart от TOOLS) при температуре -80 °C в течение одного года (точка остановки). Очищенная РНК может храниться при температуре -80 °C до двух лет, если свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания (точка остановки).
  4. Обратная транскрипция: Получите кДНК из 2 мкг общей РНК с использованием обратной транскриптазы со случайными гексамерами, следуя протоколу производителя. В частности, инкубируют РНК со случайными гексамерами 50 мкМ при комнатной температуре в течение 10 мин для отжига, а затем выполняют обратную транскрипцию при 55 °C в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК может храниться при температуре -20 °C до одного года (точка остановки).
  5. Амплификация сплайсированных минигенов: Проведите ПЦР с использованием специфических прайминговых последовательностей для сплайсированных минигенов (Таблица 2). Используйте минимальное количество циклов, необходимое для визуализации продукта на агарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На геле должны быть видны смешанные полосы несращенных и сращенных продуктов. Полосы могут казаться диффузными из-за смешанной популяции видов ДНК (рисунок 4A).
  6. Очистите продукт ПЦР с помощью очистительных колонок как на шаге 2.1.2.
  7. Прикрепление адаптеров для секвенирования: Проведите заключительный раунд ПЦР для прикрепления последовательностей адаптеров секвенирования к концам ампликонов. Включите 0-3 случайных нуклеотида в конце ампликонов для обеспечения сбалансированного детектирования флуоресценции на платформе NextSeq (табл. 1).
  8. Очистите продукт ПЦР с помощью очистительных колонок как на шаге 2.1.2.

4. Ампликонное секвенирование и анализ

  1. Краткосрочное секвенирование: Подвергните ампликоны ПЦР 150 парным секвенированием с использованием Illumina Miseq, Novaseq или эквивалента через основное учреждение или коммерческую службу.
  2. Выравнивание:
    1. Создание референсного генома: Создание синтетического «референсного генома», помечая каждый уникальный генотип как отдельную хромосому. Референсный геном включает синтетические экзоны и интроны, содержащиеся в ампликонах.
    2. Align the sequencing reads: Выровняйте парные концевые чтения по референсному геному с помощью HISAT222,23, регулируя параметры для контроля элементов, специфичных для сплайсинга (подробности командной строки см. в Дополнительном файле 2).
    3. Выберите высококачественные операции чтения: Преобразуйте SAM в формат BAM, отфильтруйте высококачественные операции чтения (качество сопоставления ≥60), а затем отсортируйте и проиндексируйте файлы BAM24 (см. Дополнительный файл 2 для получения подробной информации из командной строки).
    4. Идентификация стыковых соединений и расчет прочтений соединений: Количественная оценка использования сплайс-соединений путем извлечения событий пропуска экзонов из строк CIGAR в выровненном файле BAM. Определите операции чтения, охватывающие соединение, на основе "N" операций и агрегируйте количество операций чтения по координате и цепи соединения для оценки шаблонов сращивания (сведения о командной строке см. в дополнительном файле 2 ).
    5. Классификация канонических мест сращивания: Классифицируйте места сращивания как канонические, если они соответствуют аннотированным соединениям GT-AG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях референсные аллели в MaPSy могут использовать неканонические сайты сплайсинга. Чтения, у которых отсутствуют соединения, охватывающие указанное положение сайта сращивания, сохраняются как несплайсированные чтения.
  3. Статистический анализ для выявления вариантов сплайсинга: Categorize считывает чтения на три группы:
    (1) сращенные и несращенные чтения;
    (2) каноническое и неканоническое среди всех сращенных чтений;
    (3) канонические против неканонических плюс несращенные чтения.
    Проведите двусторонний точный тест Фишера с последующей коррекцией коэффициента ложных открытий (FDR) (Таблица 3), чтобы оценить влияние вариантов на эффективность и точность сплайсинга.
  4. Фильтр по вариантам сплайсинга с высокой степенью достоверности: классифицируйте обе пары референс/вариант, превышающие 100 чисел прочтений, с q-значением менее 0,05 по четырем повторениям, как значимые. Затем рассмотрим кандидатов с 2-кратным изменением отношения шансов с референсным или вариантным аллелем, имеющим >5% несплайсированных и неканонических прочтений, варианты сплайсинга с высокой степенью достоверности (рис. 4B).
ЧитаетСплайсированныеНесращенные и/или неканонические
Ссылкаab
Вариантcd

Таблица 3: Таблица два на два для точного теста Фишера.

5. Валидация

  1. Сплайсинг минигена для валидации:
    1. Синтез и амплификация олиго: Синтезируйте олигопласты ДНК выбранных последовательностей-кандидатов MaPSy по отдельности (например, с помощью Integrated DNA Technologies). Затем амплигируйте олигопласты с использованием разработанных фланкирующих последовательностей в двухцепочечные с помощью ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы (табл. 2).
    2. Клонирование минигена: Расщепляют как полученные продукты ПЦР, так и pGint-CAMTA2 с помощью BbsI и SmaI и лигируют расщепленный продукт с помощью ДНК-лигаз.
    3. Трансфекция: Трансфектируйте полученные конструкции в HEK293T клетки с использованием реагента для трансфекции в соответствии с этапом 3.2.2.
    4. Экстракция РНК: Извлеките РНК из трансфицированных клеток, как описано в шаге 3.3.
    5. Обратная транскрипция: Проведите полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием случайных гексамеров.
    6. Амплификация изоформ сплайсинга: Амплифицируйте изоформы сплайсинга праймерами, нацеленными на первые два экзона минигена (Lib0F и Lib0Rl, Таблица 1, настройки термоамплификатора в Таблице 2). Разрешите усиленные продукты с помощью электрофореза и визуализируйте с помощью системы Gel Doc.
    7. Количественная оценка: Количественно оцените интенсивность сигнала каждой изоформы сплайсинга с помощью ImageJ (Национальные институты здравоохранения, США)25,26. В качестве альтернативы можно использовать набор для скрининга ДНК с использованием высокопроизводительного анализатора нуклеиновых кислот eGENE HDA-GT12 для количественной оценки интенсивности и молекулярной массы продуктов ПЦР.
    8. Экстракция изоформы и подтверждение: Изолируйте каждую изоформу путем экстракции агарозным гелем на этапе 2.3 и подтвердите результат сплайсинга с помощью секвенирования по Сэнгеру продуктов ПЦР на основном предприятии или в коммерческой службе, оценивая нормальный сплайсинг, включение интронов и пропуск экзонов.
  2. Минигены мультиэкзонного сплайсинга:
    1. После проверки результатов MaPSy выберите интересующий вариант и клонируйте от трех до пяти экзонов из геномной ДНК (гДНК), чтобы обеспечить более геномный контекст для наблюдаемого дефекта сплайсинга.
    2. Выполнение сайт-направленного мутагенеза с использованием мутагенизирующих праймеров и перекрывающейся ПЦР для сборки минигенных конструкций, содержащих желаемое изменение последовательности в целевом сайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если фланкирующие интроны слишком длинны для клонирования, сохраняйте приблизительно 300 нт интронной последовательности для каждого сайта сплайсинга, чтобы обеспечить надлежащий контекст сплайсинга.
    3. Проведите анализ сплайсинга на основе клеток, как описано выше в 5.1.
  3. Клеточная валидация: Чтобы проверить эффект сплайсинга в клетках, используйте редактирование CRISPR на основе шаблонов, чтобы изменить последовательность выбранных вариантов в соответствующей клеточной модели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности используйте человеческие образцы, несущие конкретный вариант, для непосредственной оценки характера сплайсинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После клеточного сплайсинга конструкций MaPSy как сплайсированные, так и несплайсированные продукты присутствуют в виде смеси. Из-за разнообразия размеров библиотеки и возможности неканонического сплайсинга оба типа продуктов могут казаться несколько диффузными на геле. В конструкциях, нацеленных на 3'-конец, второй интрон, содержащий частичные аденовирусные последовательности, имеет тенденцию к очень сильному сплайсингу (рис. 4A).

В экспериментах MaPSy примерно 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Собственный сигнал EGFP в конструкции MaPSy позволяет обнаруживать пропуск экзонов с помощью флуоресценции. Если последовательность в среднем экзоне или интронах способствует пропуску экзонов, лигирование первого и третьего экзонов дает сигнал EGFP, обнаруживаемый с помощью FACS, что делает его ценным методом для идентификации вариантов, влияющих на пропуск экзонов, и облегчения визуализации вариантов сплайсингана основе микроскопии. Тем не менее, описанный здесь ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансовая поддержка этой работы была предоставлена премией за развитие карьеры, Многопрофильной исследовательской программой Health Cloud, грантом Grand Challenge Seed Grant от Academia Sinica (AS-CDA-108-M03, AS-PH-109-01-3 и AS-GCS-113-L03), премией за развитие карьеры от Национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения, Тайвань (NHRI-EX112-10908BC), а также грантами на выдающиеся исследования для молодых ученых и мемориальной премией Та-ю Ву Национального совета по науке и технике. Тайвань (MOST 112-2628-B-001-009-MY3 и 108-2118-M-001-013-MY5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор Direct-zol RNA MiniPrep PlusИсследование ZymoР2072
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965084
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
L-глютаминThermo Fisher ScientificA2916801 
Липофектамин 3000 Thermo Fisher ScientificL3000015
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140122
Плазмида pGintАдджен24217
Phusion высокоточная ДНК-полимеразаThermo Fisher ScientificФ530Л
Набор для экстракции геля QIAquickЦягэн28706
Набор для очистки ПЦР QIAquick Цягэн28106
QIAxcel Набор для скрининга ДНК (2400)Цягэн929004
Обратная транскриптаза SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baralle, F. E., Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (7), 437-451 (2017).
  2. Gooding, C., et al. A class of human exons with predicted distant branch points revealed by analysis of AG dinucleotide exclusion zones. Genome Biol. 7 (1), R1(2006).
  3. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annu Rev Biochem. 89, 359-388 (2020).
  4. Jaganathan, K., et al. Predicting splicing from primary sequence with deep learning. Cell. 176 (3), 535-548.e24 (2019).
  5. Lim, K. H., Ferraris, L., Filloux, M. E., Raphael, B. J., Fairbrother, W. G. Using positional distribution to identify splicing elements and predict pre-mRNA processing defects in human genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11093-11098 (2011).
  6. Calabrese, C., et al. Genomic basis for RNA alterations in cancer. Nature. 578 (7793), 129-136 (2020).
  7. Mercer, T. R., et al. Genome-wide discovery of human splicing branchpoints. Genome Res. 25 (2), 290-303 (2015).
  8. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Res. 27 (4), 639-649 (2017).
  9. Pineda, J. M. B., Bradley, R. K. Most human introns are recognized via multiple and tissue-specific branchpoints. Genes Dev. 32 (7-8), 577-591 (2018).
  10. Zeng, Y., et al. Profiling lariat intermediates reveals genetic determinants of early and late co-transcriptional splicing. Mol Cell. 82 (24), 4681-4699 (2022).
  11. Xiong, H. Y., et al. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347 (6218), 1254806(2015).
  12. Cheng, J., et al. MMSplice: modular modeling improves the predictions of genetic variant effects on splicing. Genome Biol. 20 (1), 48(2019).
  13. Chong, R., et al. A multiplexed assay for exon recognition reveals that an unappreciated fraction of rare genetic variants cause large-effect splicing disruptions. Mol Cell. 73 (1), 183-194.e8 (2019).
  14. Rosenberg, A. B., Patwardhan, R. P., Shendure, J., Seelig, G. Learning the sequence determinants of alternative splicing from millions of random sequences. Cell. 163 (3), 698-711 (2015).
  15. Jian, X. Q., Boerwinkle, E., Liu, X. M. In silico tools for splicing defect prediction: a survey from the viewpoint of end users. Genet Med. 16 (7), 497-503 (2014).
  16. Riepe, T. V., Khan, M., Roosing, S., Cremers, F. P. M., 't Hoen, P. A. C. Benchmarking deep learning splice prediction tools using functional splice assays. Hum Mutat. 42 (7), 799-810 (2021).
  17. Chiang, H. L., et al. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 29 (11), 1043-1055 (2022).
  18. Gupta, A. K., et al. Degenerate minigene library analysis enables identification of altered branch point utilization by mutant splicing factor 3B1 (SF3B1). Nucleic Acids Res. 47 (2), 970-980 (2019).
  19. Landrum, M. J., et al. ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D862-D868 (2016).
  20. Sherry, S. T., Ward, M. H., Sirotkin, K. dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9 (8), 677-679 (1999).
  21. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  22. Kim, D., Landmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  23. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2019).
  24. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), giab008(2021).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Lind, R. Open Source Software for Image Processing and Analysis: Picture this with ImageJ. Open Source Software in Life Science Research. , Woodhead Publishing. Cambridge. (2012).
  27. Huang, A. C., et al. SpliceAPP: an interactive web server to predict splicing errors arising from human mutations. BMC Genomics. 25 (1), 600(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Splicing ErrorsIntronic VariantsRNA SplicingMassively Parallel AssaySplicing MinigenesExon JunctionSpliceosome AssemblyGenome EditingSplicing EfficiencyDisease Mutations

Похожие статьи