Методическая статья

Рекомбинирующее производство сконструированных вирусных векторов для исследований и терапии

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинирование, метод генной инженерии, опосредованный рекомбинацией, позволяет точно модифицировать вирусный геном, не полагаясь на ферментативное расщепление. Этот подход имеет решающее значение для фундаментальных исследований, таких как таргетные делеции, и для разработки инженерных вирусов, используемых в онколитической терапии, генной терапии и генетических вакцинах, расширяя возможности как в исследованиях, так и в клиническом применении.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущий спрос на сконструированные вирусные векторы как в фундаментальных, так и в трансляционных исследованиях подчеркивает потребность в гибких, быстрых и масштабируемых методах получения рекомбинантных ДНК-вирусов. Стратегии, основанные на расщеплении и лигировании ферментов рестрикции, ограничены ограничениями, зависящими от последовательности, и трудоемкими этапами клонирования. В данной статье мы описываем метод генной инженерии, опосредованный рекомбинацией (рекомбинирование), который обходит эти ограничения, обеспечивая точные и бесшовные модификации вирусных геномов в бактериальных искусственных хромосомах (БАС). Такой подход позволяет эффективно удалять, вставлять или заменять кодирующие или некодирующие генетические элементы, обеспечивая мощную платформу для разработки вирусных векторов с высокой пропускной способностью. Рекомбинирование особенно ценно в фундаментальных исследованиях, таких как делеция или мутация вирусных генов для изучения их функции. Что еще более важно, эта методология позволяет генерировать десятки рекомбинантных вирусов, кодирующих различные иммуностимулирующие или терапевтические полезные нагрузки параллельно, что делает ее исключительно подходящей для быстрой доклинической оценки новых конструкций. Несмотря на то, что эта технология потенциально может быть реализована для любых научных целей, в данной статье основное внимание уделяется применению рекомбинации в двух конкретных областях: генерация онколитических вирусов на основе вируса простого герпеса и разработка нерепликативных аденовирусных векторов для переноса генов. В заключение следует отметить, что рекомбинирование предлагает универсальный подход к вирусной геномной инженерии, значительно ускоряя процесс от проектирования до функционального тестирования. Его актуальность простирается от фундаментальной вирусологии до трансляционной медицины для удовлетворения растущих исследовательских и клинических потребностей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирусные векторы стали мощными инструментами в генной терапии, онколитической виротерапии и разработке генетических вакцин благодаря их естественной способности доставлять генетический материал в клетки-хозяева. Они используют естественный тропизм и механизмы трансдукции вирусов, способствуя как переходной, так и долгосрочной экспрессии генов. Они способны выживать во внеклеточной среде, прикрепляться к специфическому клеточному рецептору (определяющему вирусный тропизм) и способствовать его интернализации, захватывать механизм экспрессии генов клетки-хозяина и управлять экспрессией своих собственных генов, а также ускользать от мембраносвязанных и внутриклеточных рецепторов врожденного иммунного плеча.. Таким образом, после продуктивной вирусной инфекции вирусы превращают клетки в фабрики вирусного потомства, которые распространяют новые вирусы в организме, в конечном итоге вызывая заболевание.

Вирусы дикого типа могут быть преобразованы в биотехнологический инструмент с помощью генной инженерии: их геномом можно легко манипулировать, чтобы сохранить способность к трансдукции и получить клинический результат. Основываясь на их клиническом применении, вирусные векторы могут быть сконструированы таким образом, чтобы сохранять (по крайней мере, частично) или абнулировать их репликационную компетентность для получения либо репликативно-компетентных, либо некомпетентных в репликациивекторов 3,4.

Репликационно-компетентные вирусы в основном предназначены для онколитических вирусных целей. Раковые клетки, часто испытывающие дефицит противовирусной защиты1, позволяют реплицироваться ослабленным рекомбинантным вирусам, сконструированным путем делеции генов вирулентности. Эти вирусы избирательно реплицируются в опухолях, щадя при этом нормальные ткани. По мере развития понимания вирусологии ослабленные вирусы были вытеснены более точными модификациями генома, предназначенными для повышения безопасности и терапевтической эффективности.

К числу областей, требующих хирургической молекулярной инженерии вирусных геномов, относятся: i) Репликационно-обусловленные онколитические вирусы, в которых вирусные промоторы заменяются опухолеассоциированными промоторами (клеточными промоторами, чрезмерно транскрибируемыми в опухолевых клетках), тем самым ограничивая экспрессию вирусных генов больными клетками. ii) Вирусы с измененным тропизмом 6,7, где гликопротеины оболочки, определяющие инфекцию, могут быть модифицированы или заменены фрагментами антител или лигандами, нацеленными на белки, сверхэкспрессируемые на опухолевых клетках 8,9. iii) Вооруженные онколитические вирусы. Индуцированная онколитическими вирусами гибель опухолевых клеток вызывает иммуногенную гибель клеток (ИКД), характеризующуюся высвобождением медиаторов воспаления 1,10 и опухолевых антигенов11. Эти сигналы способствуют эффективному распознаванию опухолевых антигенов иммунной системой, восстанавливая эпиднадзор12и обеспечивая возможность комбинации с ингибиторами иммунных контрольных точек 13,14,15 и другими иммунотерапевтическими средствами, такими как терапия на основе РНК и вакцины16.

В поддержку этого иммунотерапевтического эффекта представляющие интерес трансгены могут быть закодированы в вирусном геноме, тем самым используя вирус не только из-за его онколитической активности, но и для усиления его иммунотерапевтического потенциала за счет производства in situ соответствующих полезных нагрузок 3,7,17,18,19. Эти полезные нагрузки могут содержать цитокины, хемокины, антитела, гены самоубийства и антигены 3,20. Вставка требует точности, при этом предпочтение отдается межгенным областям вирусного генома, чтобы свести к минимуму нарушение вирусных генов и сохранить репликацию и потенцию. Таким образом, методы, которые позволяют проводить скрининг как оптимальных сайтов введения, так и представляющих интерес трансгенов, имеют важное значение.

С другой стороны, в контексте нерепликативных вирусов, используемых для генной терапии или в качестве носителей для генетических вакцин, важно, чтобы вирусный вектор доставлял трансген (либо временно, либо долго) без репликации в клетку-хозяина, чтобы избежатьтоксичности. Аденовирусные векторы характеризуются высокой эффективностью трансдукции, устойчивой экспрессией трансгенов и способностью инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки3. Эти свойства сделали их первыми в своем классе для разработки генетических вакцин, в том числе против новых инфекционных заболеваний, таких как COVID-19, а также для заместительной геннойтерапии22. Самым известным примером аденовирусного вектора, попавшего на рынок, является вакцина Oxford-AstraZeneca против COVID-19, известная под коммерческим названием Covishield или Vaxzevria, основанная на модифицированном аденовирусе шимпанзе ChAdOx1, кодирующем спайковый белок SARS-CoV-2. При внутримышечном введении Covishield способен проникать внутрь клеток и индуцировать экспрессию белка Spike, подготавливая иммунную систему к формированию иммунного ответапротив него.

Существует явная потребность в модификации вирусных геномов, не ограничиваясь сайтами распознавания ферментов рестрикции. Среди онколитических вирусов векторы на основе вируса простого герпеса-1 (ВПГ-1) обладают уникальными преимуществами, включая литическую способность, безопасность и большой размер генома, что позволяет встраивать значительные трансгены или множественные генетические элементы23,24. Помимо ВПГ, многие другие вирусы демонстрируют терапевтические перспективы, как недавно было рассмотрено в Sasso et al.3. Вместо универсального «лучшего в своем классе» вектора, различные вирусные платформы подходят для различных терапевтических потребностей3. В настоящее время гомологичные рекомбинационные системы в клонировании бактерий или гибридных дрожжев-бактерий остаются наиболее распространенными альтернативами ферментам рестрикции, но они трудоемки, многоступенчаты инеэффективны.

Новой альтернативой является использование CRISPR/Cas9, недавно примененного для создания геномов вирусов, включая вирус коровьей оспы (VV), вирус простого герпеса и аденовирусные векторы. Cas9 призывает к инактивации генов с помощью индель-мутаций, но становится менее практичным, когда требуются множественные разрезы для удаления сегментов генома или вставки трансгена через донорскую ДНК. Кроме того, редактирование ограничено дизайном гРНК, нецелевыми эффектами как в вирусном, так и в геноме хозяина, а также зависимостью от последовательностей PAM в областях, представляющих интерес.

Имея это в виду, а также на двух примерах, основанных на ВПГ и аденовирусе, данная статья иллюстрирует метод рекомбинации, который может быть применен широко — от вирусов до бактериофагов, сложных плазмид и различных экспериментальных систем. Рекомбинирование (гомологичное генетическое образование, опосредованное RECOMBInation) — это метод генной инженерии in vivo , используемый в основном для Escherichia coli, который использует зависящие от температуры белки рекомбинации бактериофагов для катализа гомологичной рекомбинации между элементами ДНК с гомологией всего 30.о.26. Этот подход позволяет точно вставлять, делеировать или модифицировать последовательности независимо от сайтов рестрикции или размера ДНК. В данной рукописи мы описываем версию, основанную на индуцируемом нагреванием штамме E. coli SW102, хотя доступны и альтернативные штаммы со специфическими индуцируемыми системами27.

Рекомбинация начинается с подготовки электрокомпетентных бактериальных клеток с помощью контролируемого температурного шока для активации механизма рекомбинации фагов. Молекулы ДНК, несущие соответствующие гомологические плечи, затем подвергаются электропоре. Это могут быть двухцепочечные ДНК (дцДНК), полученные путем рестрикционного расщепления или ПЦР, или одноцепочечные ДНК (одноцепочечные ДНК), такие как олигонуклеотиды. Наличие гомологичных последовательностей вместе с активными рекомбинационными белками позволяет создавать новые молекулы ДНК с желаемой модификацией.

Технология рекомбинирующего молекулярного клонирования обеспечивает точную генную инженерию и применяется в различных контекстах, включая вставку селективных или неселективных маркеров в плазмиды, бактериальную хромосомную ДНК и бактериальные искусственные хромосомы (БАС). БАС особенно ценны для клонирования больших фрагментов генома, включая аденовирусную ДНК и ДНК ВПГ, что позволяет быстро производить вирусные векторы. Помимо трансляционных приложений, рекомбинирование также поддерживает фундаментальные исследования, позволяя целенаправленно делеировать, модифицировать или заменять вирусные гены или белковые домены. Рекомбинирование имеет некоторые ограничения: короткие плечи гомологии препятствуют рекомбинации в повторяющихся областях; Субстраты, амплифицированные с помощью ПЦР, могут иногда вносить мутации; и последовательность целевой области должна быть известна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве предварительного условия для рекомбинации должен быть доступен подходящий штамм бактерий (например, SW102) с интересующим BAC-геномом. Несмотря на то, что рекомбинирование является высокоэффективным методом обогащения колоний, подвергшихся желаемой модификации, здесь мы описываем двухэтапную стратегию рекомбинации, называемую первым и вторым этапами (рис. 1). На первом этапе кассета с выражениями, содержащая как положительные, так и отрицательные маркеры выбора, вставляется в интересующий локус. На втором этапе эта кассета заменяется фактической генетической модификацией, предназначенной для окончательного генома. Маркеры отбора, использованные в этом исследовании, включают резистентность к ампициллину (AmpR), активность бета-галактозидазы (β-gal) и ген sacB ; Тем не менее, может быть использована любая комбинация маркеров положительного и отрицательного отбора, в зависимости от конкретных потребностей исследовательской группы.

1. Вставьте кассету с выделением в целевую область

  1. День 0
    1. Streak SW102 клеток, содержащих желаемый BAC, на LB Agar + антибиотик (ген резистентности которого находится в BAC (например, хлорамфеникол 12,5 мкг/мл). Выращивайте их за ночь в инкубаторе при температуре 32 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте температур > 32 °C, чтобы предотвратить индукцию рекомбинирующих генов во время этой фазы.
  2. День 1
    1. Проведите ПЦР для амплификации кассеты для отбора AmpR/LacZ/SacB. Используйте прямые и обратные праймеры, содержащие на 3'-конце последовательность для отжига и амплификации селективной кассеты, а на 5'-конце 30-80.н., которые представляют собой плечи гомологии с модифицируемой областью вирусного генома (табл. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кассету для выбора, а также вкладыш можно легко заказать в виде синтетических конструкций у специализированных поставщиков. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать присутствия дуплицированных промоторов, терминаторов или других генетических элементов как в BAC (контролирующих генах BAC), так и в вирусном геноме, чтобы предотвратить нежелательные события рекомбинации.
    2. Убедитесь в идентичности и чистоте фрагмента ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле (так как в кассете AmpR/LacZ/SacB 3400.о., используется 1% агарозный гель) и в том, что значения 260/230 и 260/280 соответствуют чистой нуклеиновой кислоте.
    3. Во второй половине дня инокулируйте одну колонию SW102 в 5 мл LB и инкубируйте в течение ночи при 32 °C.
  3. День 2
    1. Инокулируйте 1-2 мл ночной культуры в свежие 100 мл LB. Вырастите бактерии до OD600 0,55-0,7, регулярно измеряя OD600 , чтобы не пропустить экспоненциальную фазу.
    2. Приготовьте водяную баню до 42 °C для индукции и охладите до 4 °C ~250 мл стерильного ddH2O для стирки.
    3. Как только культура достигнет желаемого OD, перелейте 50 мл в чистую коническую пробирку и инкубируйте при 42 °C на водяной бане в течение 15 минут. Включите неиндуцированный негативный контроль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе будут индуцированы красные белки лямбда.
    4. Оставьте пробирки во льду на 10 минут, затем центрифугируйте в течение 5 минут при 3 200 × г при 4 °C (как при 42 °C, так и без индуцирования).
    5. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 40 мл ледяного, стерильного ddH2O и повторно суспендируйте гранулу (как при 42 °C, так и без индуцирования).
    6. Снова центрифугируйте в течение 8 минут (см. шаг 1.3.4) и повторите этап промывки (шаг 1.3.5) и центрифугирование. Повторяйте этап промывки до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной, как вода (без мути и взвесей) (2-4 стирки).
    7. После последнего центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл ледяного, стерильного ddH2O (как индуцированного при 42 °C, так и неиндуцированного).
    8. Перенесите аликвоту ресуспендированных гранул (50 мкл HSV-1 и 25 мкл Adeno) в предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл (как индуцированные при 42 °C, так и неиндуцированные). Добавьте 50-400 нг очищенного ПЦР-продукта (не более 5μл). Закрутите трубки и инкубируйте на льду в течение 5 минут.
    9. Переложите смесь с предыдущего этапа в предварительно охлаждаемую кювету и электропорируйте при напряжении 2,50 кВ (2 500 В, кювета 0,2 см) (как при 42 °C, так и без индуцирования).
    10. После электропорации дайте бактериям восстановиться в 1 мл LB в течение 1,5 ч при 32 °C. Добавьте в кювету 1 мл LB, чтобы очистить ее и все соберите.
    11. Распределите разное количество бактерий (10, 50, 200 мкл) на LB Agar + Ampicillin (100 мкг/мл), X-Gal (20 мкг/мл) и IPTG (0,5 мМ) и дайте им расти в течение ночи (ON) при 32 °C.
    12. Приготовьте планшеты с AMP/X-Gal (той же концентрацией, что и на шаге 1.3.11) и планшеты с сахарозой5.
  4. День 3
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ожидается, что колонии выросли и выглядят синими, но только на пластинах, где бактерии индуцировались при 42 °C и электропорировались с помощью вкладыша, содержащего кассету для отбора. Как только это установлено, необходимо проверить целостность селекционной кассеты в некоторых колониях.
    1. Определите пластины от ON, где колонии находятся на <50, чтобы избежать выбора двух или более колоний. Выберите несколько колоний (обычно достаточно 8-10 для определения хотя бы одной подходящей колонии) и разведите их примерно в 50 мкл H2O. Инокулируйте отдельные синие колонии в 50 мкл H2O и нанесите их на отрицательные (LB агар/сахароза/хлорамфеникол) и положительные (LB агар/ампициллин/хлорамфеникол/X-Gal/IPTG) селективные пластины (в той же концентрации, что и на этапах 1.1.2 и 1.3.11) (рис. 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что на пластине будет обнаружено 20-100 колоний, в которых было распространено 50 μL. Однако, если количество колоний меньше, это не обязательно означает, что рекомбинация нарушена.
    2. Инокулируйте воду с этапа 1.4.1 в 5 мл LB и инкубируйте планшеты и культуру LB в течение ночи при 32 °C (Рисунок 2).
  5. День 4
    1. Отбирайте только синие колонии, которые выросли на пластинах Amp/X-Gal и не росли на пластинах сахарозы (рис. 3). Для этих положительных клонов (табл. 2) перенесите 500 мкл аликвоты ночной культуры в 50 мл свежего LB.
  6. День 5
    1. Для каждого положительного клона приготовьте глицериновый укол и извлеките и выделите плазмиду BAC (мидипреп).
    2. После экстракции BAC выполните контроль качества, чтобы проверить, правильно ли произошла рекомбинация. Выполните секвенирование по Сэнгеру места введения. Если все выглядит правильно, приступайте ко второму разделу.

2. Замените кассету выбора на нужную модификацию

  1. День 0
    1. Проведите полосу положительного клона на LB агаре. Инкубировать в течение ночи при температуре 32 °C.
  2. День 1
    1. Проведите ПЦР для амплификации вставки/модификации. Используйте прямые и обратные капсюли, содержащие на 3'-конце последовательность для отжига и амплификации селекционной кассеты, а на 5'-конце те же 30-80.о. плечи гомологии, которые использовались на шаге 1.3.1 (Таблица 1).
    2. Убедитесь в идентичности и чистоте фрагмента ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле, а также в том, что значения 260/230 и 260/280 соответствуют чистой нуклеиновой кислоте.
    3. Инокулируйте одну колонию в 5 мл LB и инкубируйте в течение ночи при 32 °C.
  3. День 2
    1. Перенесите 2 мл ночной культуры в 100 мл LB и выращивайте при 32 °C до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,55-0,7 (за ~2,5-3 ч). Приготовьте водяную баню до 42 °C для индукции и охладите до 4 °C ~250 мл стерильного ddH2O для стирки.
    2. Как только желаемый OD будет достигнут, перелейте 50 мл культуры в коническую пробирку и инкубируйте в водяной бане при температуре 42 °C в течение 15 минут, чтобы индуцировать белки λ-фаговой рекомбинации. Держите еще одну пробирку объемом 50 мл при температуре 32 °C в качестве неиндуцированного контроля.
    3. После индукции тепла поместите трубки на лед на 10 минут.
    4. Центрифуга в течение 8 мин при 3 200 × g при 4 °C (как при 42 °C, так и без индуцирования).
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента работайте на льду для поддержания компетентности клеток SW102.
    5. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 40 мл предварительно охлажденной воды, осторожно взболтав.
    6. Центрифуга в течение 5 мин при 3 200 × г при 0-4 °C.
    7. Повторите этап стирки (шаг 2.3.5) один раз.
    8. Удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 100 μл воды.
    9. Переложите аликвоту ресуспендированных гранул (50 мкл HSV-1 и 25 мкл Adeno) в предварительно охлажденные пробирки объемом 1,5 мл (как индуцированные 42 °C, так и неиндуцированные). Добавьте 50-400 нг очищенного ПЦР-продукта (не более 5 мкл). Закрутите трубки и выиграйте на льду в течение 5 минут.
    10. Переложите смесь с предыдущего этапа в предварительно охлаждаемую кювету и электропорируйте при напряжении 2,50 кВ (как при 42 °C, так и при отсутствии наведения).
    11. Дайте клеткам восстановиться в 5 мл LB среды в течение 4-5 ч при 32 °C с встряхиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время восстановления больше, чем на первом этапе рекомбинации, что позволяет деструировать остаточный белок SacB после замены кассеты.
    12. Нанесите различные количества (50, 200, 500 мкл) культуры на чашки Петри для LB-агара, содержащие сахарозу, X-Gal и IPTG (в той же концентрации, что и на этапах 1.1.2 и 1.3.11). Инкубировать в течение ночи при температуре 32 °C.
  4. День 3
    1. Скрининг значительного числа колоний (20-100) для повышения вероятности выявления положительных клонов, успешно подвергшихся рекомбинации с фрагментом, несущим желаемую модификацию, и кассетой для отбора. Проведите скрининг первого уровня с помощью колонийной ПЦР. Используйте чашку Петри с сеткой; выбрать колонии из заданного квадранта и пометить их (рис. 4).
      Примечание: Особенно эффективный подход включает в себя использование пары праймеров, в которых один праймер отжигает за пределами целевой области (в вирусном геноме), а другой — внутри рекомбинированного фрагмента (рис. 5).
    2. Проверьте наличие и размер ампликона ПЦР агарозным гелем (1,5%).
    3. Выберите из нужного квадранта положительные клоны и инокулируйте в 100 мл LB. Инкубируйте в течение ночи при 32 °C.
  5. День 4:
    1. Проведите мидипреп для извлечения плазмиды из бактериальных культур.
    2. Расщепите плазмиду с помощью ферментов рестрикции и запустите агарозный гель, чтобы проанализировать характер пищеварения.
    3. Если схема пищеварения правильная, приступайте к секвенированию измененной области вирусного генома.
    4. После того, как мы убедились в молекулярной идентичности рекомбинантных клонов, приступают к трансфекции и спасению вирусных частиц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генерация онколитического вируса герпеса, кодирующего IL12
Как указано во вступительном разделе данной работы, одним из потенциальных применений рекомбинации является встраивание иммуностимулирующих трансгенов в геном онколитических вирусов с целью усиления их иммунотерапевтического потенциала. Ниже мы представим пример такого применения с использованием онколитического вектора на основе HSV-1. В частности, в этом исследовании изучается влияние вставки трансгена в межгенный локус в области Us1-Us2 ген...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол «RECOMBINEERING» (гомологичный генетический энгинеринг, опосредованный RECOMBInation) использует двухэтапную стратегию: во-первых, интеграция селекционной кассеты в интересующий геномный локус, а во-вторых, замена этой кассеты желаемой модификацией (рис. 1).

Используемые маркеры отбора включают резистентность к ампициллину (AmpR), бета-галактозидазу (β-gal) и sacB. AmpR обеспечивает селекцию на основе устойчивости к ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана: PRIN 2022-MUR Италия, грант 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Национальный центр генной терапии и лекарственных препаратов на основе технологии РНК. PNRR PE13 «Единое здоровье» Фундаментальные и трансляционные исследовательские мероприятия для удовлетворения неудовлетворенных потребностей в связи с возникающими инфекционными заболеваниями. Авторы благодарят сервис синтеза Geneart за предоставление кастомных ДНК. Авторы также выражают искреннюю благодарность Микеле Венерузо, который способствовал успешному завершению данного исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ампициллинлюбойлюбоймолекулярный уровень
For oligo to amplify Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		любойлюбойВЭЖХ очищенная
Для oligo to amplofy AmpR/LacZ/SacB  кассета: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACC
CCTATTTTTTTTTTTTC		любойлюбойВЭЖХ очищенная
ИПТГлюбойлюбоймолекулярный уровень
ЛБ агар
LB средний
Phusion Hot Start II Высокоточная ДНК-полимераза Термо СайентиалФ549С
Rev oligo to amplify Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		любойлюбойВЭЖХ очищенная
Rev oligo to amplofy AmpR/LacZ/SacB  кассета: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		любойлюбойВЭЖХ очищенная
Кассета для выбора SacB/AmpR/LacZЭта рукопись--
Сахарозалюбойлюбоймолекулярный уровень
SW102 с BAC-HSV-1 или BAC-AdvЭта рукопись--
Триптонлюбойлюбоймолекулярный уровень
Гель Wizard SVКомпания PromegaА9281
Х-галлюбойлюбоймолекулярный уровень
Дрожжевой экстрактлюбойлюбоймолекулярный уровень

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи