Оценка микробиологической безопасности молочных заводов с использованием бактериального протеомного профилирования с помощью подхода MALDI

Краткое содержание

Этот протокол позволяет быстро и экономически эффективно оценить микробный состав молочных продуктов за счет сочетания культуромики с MALDI-TOF MS. Он обеспечивает результаты таксономии, сравнимые с секвенированием 16S рРНК, с более коротким временем обработки по сравнению с традиционными методами культивирования.

Аннотация

Мы представляем протокол с использованием метода идентификации с помощью матричной лазерной десорбции/ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS, далее именуемый «MS») для мониторинга присутствия микроорганизмов в различных молочных продуктах (сливочное масло, сыр моцарелла, молоко, сливки) с использованием протеомного подхода, современной культуромики и различных процедур пробоподготовки, которые могут быть внедрены в лаборатории контроля качества пищевых продуктов в качестве быстрого, Надежный и прочный инструмент для мониторинга микробиологической безопасности. Он включает в себя этап микробной изоляции, отбор выращенных колоний, процедуры подготовки образцов (интактные клетки, экстракция на месте и в пробирке), настройку параметров анализа МС, генерацию и сбор спектров МС (отпечатков белков) и, наконец, получение таксономии с использованием платформы РС с последующей интерпретацией и визуализацией данных. Этот метод, подтвержденный многочисленными исследованиями, обеспечивает более надежную и экономичную идентификацию микроорганизмов в молоке по сравнению с коммерческими биохимическими тест-системами. Он выделяется как многообещающее достижение в пищевой микробиологии, отвечающее разнообразным требованиям лабораторий благодаря простым протоколам и значительно сокращенному времени анализа. Представленный протокол отвечает потребностям пищевой промышленности, обеспечивая надежную идентификацию микроорганизмов в надлежащее время выполнения (TAT), которое хорошо подходит для производственных процессов.

Введение

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы предоставить комплексную методологию мониторинга микробиологической безопасности различных молочных продуктов, включая масло, сыр, молоко и сливки, с использованием РС для бактериального протеомного профилирования. Этот подход, сочетающий в себе современную культурологию с оптимизированными процедурами пробоподготовки, призван стать быстрым, надежным и надежным инструментом для лабораторий безопасности пищевых продуктов и контроля качества. Обоснование создания и применения этой методологии связано с ограничениями стандартных методов идентификации микроорганизмов. В течение многих лет ветеринарные и пищевые диагностические лаборатории полагались на традиционные биохимические тесты, которые изучали рост и метаболизм бактерий на дифференциальных питательных средах с последующими различными ферментативными^{анализами.} Несмотря на то, что эти методы, часто основанные на таких стандартных рекомендациях, как Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, относительно недороги и могут давать как количественные, так и качественные данные, они являются трудоемкими и требуют длительной подготовки среды, разведения образца, осаждения, инкубации, подсчета колоний, выделения и детальных этапов определения характеристик ^2,3.

Внедрение коммерческих полуавтоматических и автоматизированных систем, таких как Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek и Biolog MicroPlates, упростило идентификацию микроорганизмов с помощью биохимических анализов, тем самым сократив затраты и время выполнения работ. Тем не менее, эти системы имеют некоторые недостатки, такие как плохая воспроизводимость, отсутствие записей в соответствующих базах данных и трудности в определении фенотипических вариаций между штаммами, особенно для неферментативных бактерий или штаммов внутри вида с незначительными биохимическими различиями, что может привести к неправильным результатам in vitro ⁴. Учитывая это, рассеянный склероз превратился в мощную альтернативу, в настоящее время распространенную в клинической микробиологии и привлекающую внимание в ветеринарной диагностике и лабораториях по контролю качества молока. Этот подход дополняется его скоростью, точностью и экономичностью в обнаружении нескольких микроорганизмов¹. Многочисленные исследования показали, что РС обеспечивает более надежную идентификацию микроорганизмов из молока, обеспечивая более быстрые и дешевые результаты, чем коммерческие биохимические тест-системы ^5,6,7. В то время как биохимическое тестирование может быть достаточным для идентификации на уровне рода или группы, диагностика на уровне вида часто требует более продвинутых методов, таких как РС или секвенирование 16S рРНК⁸. Действительно, MS считается многообещающей платформой для гибкой и надежной идентификации пищевых микробных изолятов, отвечающей разнообразным требованиям лабораторий пищевой микробиологии благодаря своим простым протоколам и значительно сокращенному времени анализа, тем самым повышая^{безопасность пищевых продуктов.} Эксплуатационные расходы минимальны благодаря низкому расходу реагентов, а работа с образцами обеспечивает большую автоматизацию и высокую производительность⁸. Однако следует отметить, что полезность этого метода по своей сути зависит от выбранных условий роста микроорганизмов (включая тип питательной среды) и охвата видов в референтной базе данных, которые признаны ключевыми факторами, ограничивающими его полезность.

РС играет важную роль в пищевой микробиологии, выявляя и дифференцируя пищевые патогенные, молочнокислые бактерии (LAB) и другие ферментативные бактерии⁹. Его полезность распространяется и на современную культуромику, позволяя идентифицировать все колонии микробов, выращенных на питательных средах, и облегчая^{получение информации о} колониеобразующих единицах (КОЕ). Этот подход уже был успешно применен для обнаружения таких сложных микробных сообществ, как те, которые представлены в кишечнике человека, участвуют в инфекциях диабетической стопы или связаны с мочевыводящими путями, ревитизируя культурозависимые методы в микробиологических практиках^10,11.

Этот протокол представлен в качестве руководства для лабораторий по эффективному внедрению МС для рутинной оценки микробиологической безопасности молочных продуктов, удовлетворяя потребности отрасли в надежной идентификации микроорганизмов в течение практического времени выполнения (TAT), подходящего для производственных процессов. В протоколе подробно описаны важнейшие этапы, в том числе (1) микробное выделение из жидких (молоко, сливки, сыворотка) и твердых (масло, сыр) молочных продуктов с использованием выбора соответствующих питательных сред (агар de Man, Rogosa and Sharpe - MRS agar, агар M-17, универсальный агар Tween 80 - APT, агар China Blue Lactose - CBL agar, агар Milk Plate Count - MPCA, триптический соевый агар - TSA) и адаптированные условия инкубации; (2) стандартизированные процедуры подготовки образцов для анализа РС, предлагающие такие варианты, как прямой перенос колоний, экстракция муравьиной кислоты на цели и экстракция белка этанола/муравьиной кислоты в пробирке для различных типов бактерий и лабораторных рабочих процессов; и (3) систематический анализ МС, включая калибровку приборов, определение оптимальных параметров получения спектров и рекомендации по интерпретации данных, включая оценку значений баллов и проверку согласованности для уверенного таксономического присвоения. Обеспечивая структурированный и валидированный подход, этот протокол направлен на повышение точности и эффективности микробиологического мониторинга в молочной промышленности, что в конечном итоге способствует улучшению качества продуктов питания и здоровья населения.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выделение молочных бактерий

1. Получение бактериальных культур из жидких или твердых молочных продуктов
   1. Выбор питательных сред
      1. Для выделения бактерий из образцов молочных продуктов отбирайте питательные среды в соответствии с ожидаемыми микробными группами, включая общие питательные среды, среды для грамотрицательных бактерий, молочнокислых бактерий (LAB), спорообразующих бактерий, а также медленнорастущие или привередливые микроорганизмы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального восстановления как доминирующих, так и редких видов, несколько сред должны быть инокулированы параллельно. Набор примеров сред для анализа микробиома из образцов молочных продуктов представлен в таблице 1.
   2. Инокуляция и нанесение покрытий
      1. Получите репрезентативный образец молочного продукта и тщательно перемешайте.
      2. Асептически перенесите 1 мл (жидкие образцы: молоко, сливки, пахта) или 1 г (твердые образцы: сыр, сливочное масло) образца в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл стерильной жидкой среды (пептонная вода / 0,85% раствор NaCl). Для твердых образцов нагрейте жидкую среду до 40-42 °C перед добавлением образца.
      3. Гомогенизируйте образец путем энергичного вортексирования в течение 30-60 с. Для жирных или твердых образцов продолжайте гомогенизацию до получения однородной суспензии.
      4. Приготовьте серию десятикратных разведений, взяв 1 мл суспензии и переложив ее в последующие пробирки, содержащие 9 мл стерильного раствора. Хорошо перемешайте каждое разбавление.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа образца и ожидаемого уровня микробного загрязнения приготовьте разведения в диапазоне от ^10-1 до ^10-6. Для большинства образцов будет достаточно разведений до ^10-3 ; Однако при анализе свежего молока или сыра с плесенью необходимо будет приготовить дополнительные разведения. Для обеспечения точной изоляции и простоты отбора колоний оптимальное разведение инокуляции должно давать от 30-300 колоний на одну пластину. Этот диапазон позволяет проводить четкую дифференциацию отдельных колоний и сводит к минимуму риск перекрывающегося роста, способствуя получению незагрязненных и однородных бактериальных культур для последующего анализа. Для некоторых обработанных молочных продуктов (например, пахты) для прямого нанесения покрытия можно использовать неразбавленный свежий образец (например, 0,1 мл).
      5. Возьмите 0,1 мл образца или его в разведении и перенесите на поверхность предварительно подготовленных чашек Петри, содержащих соответствующую агаровую среду.
      6. Равномерно распределите инокулят по поверхности агара с помощью стерильного разбрасывателя. Дайте инокулюму впитаться в среду в течение 15 минут, затем переверните пластины.
   3. Инкубация
      1. Аэробная инкубация: для всех исследуемых образцов инокулируют агаровые планшеты APT, M-17, CBL, MPCA и TSA, инкубируют в аэробных условиях при 37 °C и 30 °C в течение 24 часов. Температуры инкубации определяли на основе оптимальных потребностей в росте различных микробных групп, имеющих решающее значение для оценки как гигиенического качества (30 °C для общих мезофил), так и безопасности для здоровья населения (37 °C для ассоциированных с человеком патогенов и индикаторных организмов) молочных продуктов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если ожидается интенсивный рост спорообразующих бактерий, в случае TSA предпочтительно более короткое (~12 часов) время инкубации.
      2. Анаэробная инкубация: для всех исследованных образцов инокулируйте агаровые планшеты MRS, инкубируйте в анаэробных условиях при 37 °C и 30 °C в течение 24-72 часов, проверяя рост микроорганизмов каждый день. Температуру инкубации определяли, как указано на шаге 3.1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Условия анаэробной инкубации могут быть достигнуты путем помещения планшетов в герметичные контейнеры с анаэробными пакетиками, создающими атмосферу, которые удаляют кислород и обеспечивают подходящую атмосферу для роста анаэробных бактерий.
   4. Получение чистых культур
      1. После инкубации осмотрите планшеты и выберите выращенные одиночные колонии на основе их морфологических характеристик (например, размера, формы, цвета, текстуры).
      2. Очистите выбранные колонии путем субкультивирования (нарезания) на ту же агаровую среду с использованием микробной петли объемом 1 мкл и тех же условий инкубации.

Питательная среда	Приложение	Состояние культуры
Триптический соевый агар (TSA)	Общая среда для культивирования широкого спектра бактерий	30–37 °C, 24–48 ч, аэробный
Кровяной агар (BLA; с 5% овечьей крови)	обогащенный, дифференцировка гемолиза, полезен при стрептококках, листериях, бациллах	30–37 °C, 24–48 ч, аэробный
Агар MRS (агар де Мана, Рогозы и Шарпа)	селективный для Lactobacillus и других LAB Добавьте 1% Tween-80 для поддержки роста L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus или L. acidophilus.	30 °C, 48–72 ч, анаэробный или микроаэрофильный
Агар М17	селективный к Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 ч, анаэробный или микроаэрофильный
APT агар (универсальный твин 80 агар)	селективный к LAB и некоторым бифидобактериям	30 °C, 48–72 ч, анаэробный или микроаэрофильный
Агар Scheadler	селективное и обогащение, выделение анаэробов, в том числе Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 ч, анаэробный
CBL агар (China Blue Lactose agar)	дифференциальная среда, для колиформных бактерий и других бактерий, ферментирующих лактозу	37 °C, 24–48 ч, аэробный
Агар с подсчетом молока (MPCA)	универсальный, для общего количества аэробных мезофильных бактерий	30–37 °C, 24–48 ч, аэробный

Таблица 1: Список предлагаемых сред для анализа микробиома образцов молочных продуктов с заданными условиями культивирования.

2. Подготовка бактериальных образцов для анализа на РС

1. Перед началом работы подготовьте матричное решение MALDI
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее часто используемым матричным соединением является HCCA, α-циано-4-гидроксикоричная кислота. Это соединение является светочувствительным, поэтому подготавливайте и храните матрицу в темных емкостях или вдали от света.
   1. Приготовьте смесь растворителей, используя следующие пропорции: 50% ацетонитрила (класса ВЭЖХ), 47,5% воды (класс ВЭЖХ) и 2,5% трифторуксусной кислоты (ТЖК).
   2. Растворите матрицу в смеси растворителей до конечной концентрации примерно 10 мг/мл (или до насыщения - до тех пор, пока не останутся видимыми нерастворенные кристаллы).
   3. Если раствор непрозрачный (остаются кристаллы), центрифугируйте или отфильтруйте раствор (например, через шприцевой фильтр 0,22 мкм) для получения прозрачной жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение в холодильнике допускается в течение коротких периодов времени при условии небольшого количества циклов размораживания.
2. Чтобы выявить бактерии с помощью РС, воспользуйтесь одной из 3 процедур подготовки проб:
   1. Прямой перенос колонии - Используйте этот самый простой и быстрый метод при работе с хорошо растущими, не устойчивыми к лизису бактериями, такими как большинство грамотрицательных бактерий.
      1. С помощью стерильной петли или зубочистки перенесите небольшое количество (~1 мкл) выращенной колонии в пятно на пластине MALDI.
      2. Нанесите бактериальный материал непосредственно на указанное место на целевой пластине MALDI, чтобы создать тонкий ровный слой.
      3. После высыхания покройте пятно 1 μл матричного раствора HCCA и дайте высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
   2. On Target Thickic Acid Extraction - Используется для трудно идентифицируемых бактерий (например, грамположительных, дрожжей), клеточные стенки которых затрудняют высвобождение белков без дополнительной обработки.
      1. Соберите небольшое количество бактериальной биомассы из одной бактериальной колонии с помощью одноразовой микробной петли или стерильной зубочистки.
      2. Нанесите бактериальный материал непосредственно на указанное место на целевой пластине MALDI, чтобы создать тонкий ровный слой.
      3. Нанесите на смазанный бактериальный материал 1 мкл 70% раствора муравьиной кислоты и высушите на воздухе при комнатной температуре.
      4. После высыхания покройте пятно 1 μл матричного раствора HCCA и дайте высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
   3. Внутритрубная экстракция белка (метод этанола/муравьиной кислоты) - используйте этот метод для трудно идентифицируемых микроорганизмов, включая некоторые грамположительные бактерии, дрожжи и микобактерии.
      1. С помощью стерильной петли или тампона перенесите 1-3 полные колонии из агарового планшета в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 300 мкл стерильной воды.
      2. Добавьте 900 μл абсолютного этанола, чтобы довести конечную концентрацию этанола примерно до 75%. Перемешайте или сделайте вихрь в течение нескольких секунд.
      3. Центрифугируйте образец в течение 2 мин при температуре 15 000 x g (комнатная температура).
      4. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В случае растяжения слизистой оболочки рекомендуется дополнительное центрифугирование при 4 °C.
      5. Оставьте пробирку с гранулами открытой, пока весь остаточный этанол не испарится (5-10 минут при комнатной температуре).
      6. Добавьте 20-50 мкл 70% муравьиной кислоты (ФК) в высушенную клеточную гранулу. Перемешивайте с помощью пипетирования или вортекса до тех пор, пока гранула не будет полностью суспендирована.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Объем должен быть пропорционален количеству биологического материала.
      7. Добавьте равный объем ацетонитрила (АКН) в суспензию муравьиной кислоты. Тщательно перемешайте.
      8. Центрифугируйте при давлении 15 000 x g в течение 2 минут (комнатная температура).
      9. Перенесите 1 мкл надосадочной жидкости в указанное место на целевой пластине MALDI.
      10. Дайте пятну полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
      11. Нанесите на высушенное пятно образца 1 мкл матричного раствора α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (ГХКА).
      12. Дайте матрице полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре перед анализом МС (Рисунок 1).
          ПРИМЕЧАНИЕ: 70% муравьиной кислоты: коррозионная; вызывает ожоги. Ручка в вытяжном шкафу. Ацетонитрил: легковоспламеняющийся и токсичный. Держите подальше от огня и избегайте вдыхания/контакта. Трифторуксусная кислота (ТЖК): прочная, коррозионная и летучая; Избегайте контакта с кожей/глазами и вдыхания. Всегда надевайте лабораторный халат, химически стойкие перчатки и защитные очки. Работайте со всеми реагентами в вытяжном шкафу, чтобы избежать вдыхания. Избегайте попадания на кожу и в глаза; Работайте вдали от открытого огня. Собирайте отходы кислотных и органических растворителей в четко маркированные, совместимые контейнеры для правильной утилизации.

Рисунок 1: Дерево решений, которое визуализирует процесс выбора подходящей процедуры подготовки образцов для идентификации бактериальных изолятов с помощью метода MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Получение спектров и микробная идентификация с помощью метода МС

1. Калибровка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного определения массы в МС, перед анализом неизвестных образцов, откалибруйте прибор с использованием соответствующих стандартов. Правильная калибровка прибора имеет решающее значение для надежной идентификации.
   1. Подготовьте пятна калибратора на целевой пластине MALDI, содержащие 1 μл: (a) Bacterial Test Standard (BTS), содержащий экстракт Escherichia coli DH5 alpha, охватывающий диапазон масс 3,6-17 кДа (для MBT Biotyper); (b) Микробиологический калибратор, содержащий экстракт белка E. coli ATCC 25922, рибонуклеазу и миоглобин, охватывающий диапазон масс 3,6-17 кДа (для EXS2600 системы). Дайте высохшему воздуху высохнуть и налейте на высушенные пятна калибратора 1 мкл матричного раствора HCCA, аналогично пробоподготовке.
   2. Загрузите в прибор целевую пластину MALDI, содержащую подготовленные образцы и калибровочные пятна. Запустите анализ на наличие пятен калибра в режиме калибровки (автоматически).
   3. Проверьте калибровку, чтобы убедиться, что погрешность массы находится в допустимых пределах (100 ppm) в указанном диапазоне масс (2-20 кДа).
2. Получение спектров
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда прибор откалиброван, собираются масс-спектры из каждого подготовленного пятна образца.
   1. Общие параметры сбора данных
      1. Работа масс-спектрометра в режиме линейных положительных ионов.
      2. Установите диапазон обнаружения массы в диапазоне 2 000-20 000 м/з (2-20 кДа).
   2. Используйте следующие настройки для конкретного прибора
      1. Напряжения ионных источников: ионный источник 1 (IS1) при 20 кВ, ионный источник 2 (IS2) при 18 кВ, напряжение линзы при 9 кВ. Разгонное напряжение может составлять до 25 кВ.
      2. Напряжение детектора: установлено примерно на 2,65 кВ.
      3. Настройки импульсной экстракции ионов: 100 нс, время экстракции с задержкой зафиксировано на уровне 230 нс.
      4. Настройки мощности лазера: отрегулируйте вручную для получения наилучшего качества спектра (с учетом количества сигналов и интенсивности сигнала), обычно в диапазоне от 40% до 65% от минимальной требуемой мощности.
      5. Количество выстрелов в спектре: получение достаточного количества лазерных выстрелов из разных областей каждого пятна для создания суммарного спектра с хорошим соотношением сигнал/шум (S/N)→ (а) в среднем 200 выстрелов, сделанных с шагом 50 выстрелов из 4 различных областей каждой точки, или (б) захват с шагом 500 выстрелов - 50 выстрелов из десяти различных позиций целевой точки с использованием режима AutoXecute.
   3. Пример стратегии измерения
      1. Измерьте несколько пятен на изолят (по крайней мере, 2 пятна на изолят).
      2. Получайте спектры в репликации для каждого пятна, чтобы обеспечить согласованность и точность результатов → измеряйте в двух экземплярах, стремясь к определенному общему количеству спектров на образец (4 спектра на образец, по крайней мере, → технических повторений).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подвергайте биологические образцы (не менее 3) для получения биологических репликатов.

4. Идентификация микроорганизмов и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификация организма происходит путем сравнения полученного белкового профиля (специфического белка «отпечатка» микроорганизма) с эталонной базой данных, и результирующая корреляция как положения, так и интенсивности сигнала используется для создания соответствующего значения, которое описывает уровень достоверности, с которым исследуемый организм был сопоставлен с соответствующим эталонным микроорганизмом. Идентификация микроорганизмов путем сравнения обработанных спектров со справочными базами данных.

1. Обработка спектров
   1. Используйте соответствующее программное обеспечение для обработки спектров: (a) flexAnalysis для систем MALDI Biotyper или (b) EX-Accuspec для систем EXS2600.
   2. В качестве алгоритма сглаживания применим метод Савицкого-Голея (ширина 2 м/з, 10 циклов).
   3. Выполните коррекцию базовой линии для удаления фонового шума с помощью алгоритма TopHat (порог S/N = 2, ширина фильтра TopHat 0,2 Да).
   4. Используйте режим центроида в качестве алгоритма обнаружения пиков (порог S/N = 2).
2. Сравнение баз данных и интерпретация оценок
   1. Загрузите обработанные масс-спектры неизвестных изолятов на платформу микробной идентификации MALDI. После этого запустите идентификацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих исследованиях использовалось следующее программное обеспечение: Biotyper версии 4.1.100, Ex-Accuspec версии V1. В случае программного обеспечения MALDI Biotyper рекомендуется создание главных спектров (MSP) из необработанных спектров для обеспечения наилучшей надежности согласования.
   2. Оцените результаты идентификации в соответствии со стандартными пороговыми значениями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для MALDI Biotyper и EXS2600 значения оценки составляют:
      2.300-3.000: высоковероятная идентификация вида;
      2.000-2.299: безопасная идентификация рода, идентификация вероятного вида;
      1.700-1.999: вероятная идентификация рода;
      0,000-1,699: ненадежная идентификация.
      Во время оценки результата идентификации, полученного с помощью платформы MALDI Biotyper, подтверждаются выводы с использованием категорий согласованности: A- Вид Согласованный → наилучшим совпадением, а все остальные совпадения с аналогичным высоким значением балла (>1,999) указывают на тот же вид; B - Genus Consistent → best match и другие совпадения с аналогичными значениями баллов (1.700 - 1.999) указывают на один и тот же род, но могут отличаться на уровне вида; C- Не выполнены требования к согласованности → уровню вида или рода.

Результаты

Культуромный подход
Культуромный подход представляет собой стратегию, направленную на максимальную диверсификацию условий культивирования микроорганизмов с целью увеличения шансов выделения, в том числе, редких, трудно поддающихся культивированию или ранее не описанных видов¹². Это позволяет получить гораздо более широкую картину биоразнообразия микрофлоры, присутствующей в различных образцах, например, образцах продуктов питания. Повышенное ра...

Обсуждение

Протокол, посвященный микробной идентификации молочных продуктов, представляет собой важный шаг вперед по сравнению с традиционными методами, обеспечивая оптимальный консенсус в отношении скорости, надежности и экономической эффективности. Тем не менее, некоторые важные шаги в рамках протокола требуют пристального внимания. Во-первых, фаза изоляции и культивирования является основополагающей. Питательные среды и условия инкубации должны соответствовать ожидаемому микробному разнообразию ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
70% муравьиная кислота	Чемпур	115676307
Ацетонитрил	Merck KGaA	1.00014.1011
APT агар	Merck KGaA	1.10453.0500
Стандарт бактериального тестирования	Bruker Daltonik GmbH	8255343
CBL Агар (Китайский голубой лактозный агар)	Merck KGaA	1.02348.0500
Columbia Blood agar	Оксоид	CM0331B
Агар M17
Граф Агар Молочной Тарелки (MPCA)	Оксоид	cm0681
MRS agar (де Ман, Рогоса и Шарп Агар)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 мишень для полированной стали BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Пептонная вода	Сигма-Олдрич	70179
Шедлерский агар	Сигма-Олдрич	91019
Овечья кровь	Биомаксима	SL0160-100
Трифторуксусная кислота	Сигма-Олдрич	T6508
Триптический соевый агар (TSA)	Сигма-Олдрич	22091
Вода	Merck KGaA	1.15333.2500
&альфа;-циано-4-гидроксициннамовая кислота	Bruker Daltonik GmbH	8201344