Методическая статья

Подготовка образцов для метаболомных исследований методом масс-спектрометрии одиночных клеток: комбинированная промывка, закалка, сушка и хранение клеток

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол направлен на сохранение клеточных метаболитов для одноклеточной масс-спектрометрии (SCMS) путем комбинирования промывки раствором летучих солей, быстрого гашения жидким азотом, сублимационной сушки и хранения при температуре −8 °C. Он демонстрирует, что закалка жидким азотом имеет важное значение для поддержания профилей метаболитов, в то время как длительное хранение в холоде должно быть сведено к минимуму для предотвращения метаболических изменений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Масс-спектрометрия одиночных клеток (SCMS) стала незаменимым инструментом для изучения клеточного метаболизма. Благодаря достижениям в современных методах масс-спектрометрии (МС) и спросу на исследования клеточной гетерогенности в фундаментальных биологических науках и заболеваниях человека, было разработано множество различных методов SCMS, которые применяются в лабораторных исследованиях. Поскольку метаболиты могут точно отражать состояние клеток, метаболомический анализ живых клеток SCMS считается мощным инструментом для получения молекулярной информации о клетках. Тем не менее, основной проблемой при анализе SCMS живых клеток является сохранение профилей эндогенных метаболитов во время подготовки образцов, транспортировки и измерения. Клеточные метаболиты претерпевают быстрый оборот и обладают высокой чувствительностью к изменениям окружающей среды, что делает их восприимчивыми к деградации или трансформации перед анализом. Чтобы устранить это ограничение, мы представляем надежный и воспроизводимый протокол подготовки клеток, предназначенный для сохранения целостности клеточных метаболитов для SCMS. Протокол включает в себя промывку ячеек раствором летучего формиата аммония (AF), быструю закалку жидким азотом (LN2), вакуумную сублимационную сушку и хранение при температуре -80 °C. Такой подход сводит к минимуму повреждение клеточных мембран, эффективно останавливая метаболическую активность. Результаты показывают, что быстрое закаливание клеток имеет жизненно важное значение; однако ограничение времени хранения при -80 °C необходимо для сохранения метаболитов клеток. Предложенный протокол потенциально может быть использован для других существующих методов SCMS для широкого спектра применений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Межклеточная гетерогенность стала фундаментальным принципом биологических систем, особенно в контексте прогрессирования заболевания, лекарственной устойчивости и клеточной дифференцировки 1,2. У многоклеточных организмов даже генетически идентичные клетки в одном и том же микроокружении могут проявлять различные фенотипы, возникающие из-за различий на транскриптомном3, протеомном4 и, что особенно важно, метаболомномуровнях5. В то время как геномика и транскриптомика одноклеточных клеток за последнее десятилетие получили значительное развитие, метаболомика одиночных клеток остается сравнительно слабо развитой из-за присущейметаболитам сложности и быстрой динамики. Метаболиты очень чувствительны к сигналам окружающей среды, имеют разнообразную химическую структуру и полярность7 и существуют в низких концентрациях в малых объемах клеток8. Эти свойства делают их надежное измерение по отдельным ячейкам аналитической задачей. Поскольку метаболомика обеспечивает наиболее точное представление о функциональном состоянии клетки в режиме реального времени, совершенствование методов надежного изучения метаболома с разрешением одной клетки имеет важное значение для более глубокого понимания клеточной физиологии и патологии.

Традиционные методы объемной метаболомики усредняют сигналы по большим клеточным популяциям, маскируя клеточную гетерогенность и потенциально скрывая редкие, но значимые метаболические сигнатуры. В отличие от этого, метаболомика одиночных клеток выявляет уникальные биохимические профили на уровне отдельных клеток, что делает ее бесценной для изучения таких процессов, как дифференцировка стволовых клеток, реакция на лекарства и механизмы заболевания 6,9,10,11,12,13. Методы, основанные на масс-спектрометрии (МС), такие как матричная лазерная десорбция-ионизация (MALDI) МС и вторичные ионы (СИ) МС, продвинулись в этой области, но сталкиваются с такими проблемами, как сложная подготовка, требования к вакууму и деструктивная ионизация, которые ограничивают анализ живых клеток 9,14. В частности, последние разработки в области приборостроения привели к появлению передовых методов, в том числе MALDI в режиме передачи в сочетании с лазерно-индуцированной постионизацией (t-MALDI-215) и масс-спектрометрией вторичных ионов Orbitrap (OrbiSIMS)16,17, что позволило получить безметочную 3D-метаболическую визуализацию с высоким разрешением на уровне отдельных клеток и субклеток, обеспечивая исключительную точность массы и пространственное разрешение.

Система ионизации окружающей среды MS решает эти проблемы. К репрезентативным методам SCMS относятся видеомасс-спектрометрия с одиночными клетками (Video-MS)18, DESI19 и nano-DESI20. Среди них однозондовый SCMS является одним из методов, который выделяется своей способностью напрямую отбирать образцы и ионизировать живые клетки в режиме реального времени с помощью двухкапиллярной системы 21,22,23,24. Этот метод сводит к минимуму возмущение образца, обеспечивая при этом метаболическое профилирование in situ с высоким разрешением, и был успешно применен для исследований поглощения лекарственного средства и его влияния на клеточный метаболизм 22,25,26,27,28,29,30, реакцию окружающей среды31,32 и метаболическую гетерогенность33. 34,35,36 среди отдельных клеток.

В то время как многие методы SCMS при окружающей среде позволяют анализировать живые клетки, они, как правило, страдают от низкой производительности из-за ручной обработки, необходимой для выбора отдельных клеток 23,37,38. Поскольку клеточный метаболизм очень динамичен, длительная подготовка образцов может изменить профили метаболитов. Чтобы решить эту проблему, исследователи применяют методы гашения сразу после выделения клеток 39,40. Гашение останавливает метаболическую активность либо путем быстрого охлаждения 41,42,43,44, либо путем денатурации фермента 43,45,46,47, сохраняя биохимическое состояние клеток в определенный момент. Этот шаг жизненно важен для получения точных и актуальных во времени метаболомных данных. Эффективный протокол гашения должен быстро и полностью прекратить внутриклеточную метаболическую активность. Были оценены различные методы, включая холодный изотонический раствор48, охлажденный ацетонитрил46, холодный метанол 44,47,48,49, ледяной фосфатный буферный раствор (PBS)43,50, LN2 43,44,51 и даже обработку горячим воздухом 52. В то время как многие из них были первоначально разработаны для объемной клеточной метаболомики, некоторые, такие как холодный метанол и ацетонитрил, были адаптированы для одноклеточных методов, таких как Pico-ESI-MS39 и MALDI-MS46. Несмотря на свою эффективность, каждый метод имеет недостатки: органические растворители могут вызывать утечку метаболитов и повреждение клеточных мембран 48,53, а растворы нелетучих солей могут влиять на РС, вызывая подавление ионов54, снижая чувствительность и снижая точность данных47,55.

Мгновенная заморозка LN2 обычно используется вбиологических исследованиях, поскольку она быстро останавливает клеточный метаболизм, не оставляя после себя нелетучих солей, что делает ее хорошо подходящей для SCMS. Однако он может повреждать клеточные мембраны, что проблематично для SCMS57,58. Чтобы уменьшить это повреждение, в некоторых исследованиях использовался метод, включающий быструю фильтрацию, холодную промывку NaCl и замораживание LN2, который помогает удерживать метаболиты с быстрым оборотом53,59. Тем не менее, этот метод не идеален для SCMS из-за сложностей в выделении отдельных клеток и потенциальных матричных эффектов из остатков солей. Хранение при температуре -80 °C является еще одним распространенным методом консервирования, но его влияние на профили метаболитов отдельных клеток остается неясным. Ранее мы сообщали об исследованиях, направленных на устранение этих ограничений путем комбинации нескольких ключевых этапов: клетки сначала промываются летучим, MS-совместимым раствором AF, затем гасятся с помощью LN2, подвергаются вакуумной сублимационной сушке и хранятся при низкой температуре (-80 °C)60. Современный подход сводит к минимуму повреждение клеток и деградацию метаболитов, что позволяет проводить более точные измерения SCMS. Эта работа сосредоточена на экспериментальных деталях с целью содействия внедрению этого метода клеточной подготовки для надежных методов SCMS.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выполняйте каждый шаг в сертифицированной лаборатории биобезопасности класса II и в стерильных условиях. В данном исследовании в качестве модельной системы использовалась клеточная линия HCT-116, а клетки культивировались в полной культуральной среде. Регенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культура клеток

  1. Подготовьте готовую среду. Дополните среду McCoy's 5A 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином. Нагрейте его до 37 °C.
  2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2. Ежедневно контролируйте слияние и пассаж, когда культуры достигают ~80% конфлюенции.
  3. Проходите по клеткам (каждые ~2 дня).
    1. Отсадите среду и промойте один раз 5 мл 1x PBS.
    2. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в чашку для культивирования и инкубируйте при 37 °C в течение 3 минут для облегчения отслоения клеток.
    3. Нейтрализуйте трипсин, добавив 8 мл предварительно подогретой полной среды и аккуратно пипетируя для диспергирования клеток.
    4. Перелейте 1 мл суспензии в 9 мл свежей готовой среды.
    5. Посчитайте клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Элементы подсчитывались с помощью автоматического счетчика клеток TC20 в соответствии с инструкциями производителя. Трипановый синий или другие красители не использовались.
  4. Семенные ячейки на покровных листах.
    1. Разбавьте клетки до конечной концентрации ~1 ×10 6 клеток/мл.
    2. Поместите отдельные стеклянные покровные стекла 18 мм в лунки 12-луночной пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные покровные стекла должны быть автоклавированы перед использованием для культивирования клеток.
    3. Добавьте 2 мл готовой среды и 200 мкл клеточной суспензии (~2 × 105 клеток/лунку).
    4. Инкубируйте клетки на ночь, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться в том, что клетки находятся в нормальном состоянии роста, регулярно проверяйте морфологию клеток и их статус роста (с помощью микроскопа), а также исследуйте потенциальное загрязнение микоплазмой (с помощью набора для обнаружения микоплазм).

2. Промывка ячеек раствором формиата аммония (AF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз готовьте свежий раствор для автофокусировки.

  1. Подготовьте буфер для промывки автофокусировки. Взвесьте 0,45 г формиата аммония и растворите в 50 мл воды класса LC/MS. Конечная концентрация формиата аммония составляет 0,14 М (0,9% по массе).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите раствор ледяным (0-4 °C) до использования.
  2. Добавьте по 2 мл холодного раствора ФП в каждую лунку 12-луночного планшета.
  3. Промойте покровные стекла. С помощью пары стерильных щипцов аккуратно поднять каждую покровную стебель, содержащую адгезивные клетки, из ее лунки, а затем ненадолго (на 2-3 с) поместить ее в отдельную лунку, предварительно заполненную 2 мл холодного 0,9% раствора формиата аммония (АФ). Повторите процесс полоскания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не потревожить клетки во время промывки, выполняйте промывку ячеек очень осторожно.

3. Закалка ячеек жидким азотом (LN2)

  1. Поместите все промытые AF покровные стекла (ячейки вверх) в чашку Петри внутри контейнера из алюминиевой фольги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наденьте криогенные перчатки, защитные очки и лабораторный халат. Выполняйте все операции с LN2 в хорошо проветриваемом помещении. Алюминиевая фольга может быть использована для складывания емкости для тушения LN2 .
  2. Медленно налейте 10-20 мл жидкого азота на покровные стекла, обеспечивая полное покрытие.
  3. Немедленно наклоните чашку Петри пинцетом, чтобы сцедить оставшийся жидкий азот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Завершите это действие в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить образование крупных кристаллов льда из-за остаточной промывочной влаги.

4. Камерная сублимационная сушка в вакууме

  1. Сублимационная сушка сразу после закалки LN2 для предотвращения оттаивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите ротор SpeedVac, чтобы создать плоскую платформу, на которой может разместиться чашка Петри диаметром 100 мм.
  2. Используя криогенные перчатки и изолированный пинцет, поместите чашку Петри, содержащую охлажденные покровные стекла LN2 , на камеру вакуумного концентратора.
  3. Обработайте с использованием стандартных настроек вакуума и продолжайте в течение 5-7 минут, пока видимый LN2 не испарится, а покровные стекла не станут сухими. Высохшие покровные стекла не должны содержать остатков LN2 и кристаллов льда.

5. Хранение клеток в морозильной камере при температуре -80 °C

  1. Оберните контейнер бумажным полотенцем и перенесите в морозильную камеру при температуре −80 °C на 48 часов.
  2. После хранения немедленно перенесите покровные стекла, содержащие чашку Петри, в эксикатор комнатной температуры на ~10 минут. Убедитесь, что конденсированный иней или вода на покровных стеклах полностью исчезли, прежде чем вынимать их из эксикатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрая передача покровных стекол в эксикатор сводит к минимуму конденсацию; Даже незначительное смачивание поверхности может растворить высушенные метаболиты.
  3. После промывки ФП разделите образцы на две группы (Группа 1 и Группа 2). Примените следующие протоколы обработки.
    Группа 1: закалка LN2 → сублимационной сушки → анализа SCMS (без хранения).
    Группа 2: Закалка LN2 → сублимационной → хранение при температуре −80 °C 48 ч → анализа SCMS.
  4. Проведите анализ SCMS, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С использованием различных условий можно подготовить больше групп клеток. Группы 1 и 2 используются для иллюстрации общих протоколов.

6. Изготовление одного датчика и настройка SCMS

ПРИМЕЧАНИЕ: Однозонд изготовлен в соответствии с установленными процедурами 21,24,60,61, и здесь представлены только краткие протоколы.

  1. Потяните за двухканальную кварцевую иглу с помощью лазерного съемника и сгенерируйте наконечник ~10 мкм. Соберите однозондовый зонд, вставив капилляр из плавленого кремнезема и излучатель nano-ESI в кварцевую иглу с двойным отверстием. Закрепите все компоненты на предметном стекле с помощью быстросхватывающейся эпоксидной смолы.
  2. Установите однозонд на столик XYZ. Прикрепите однозонд к моторизованному манипулятору XYZ, расположенному под цифровым микроскопом.
  3. Подключите установку к масс-спектрометру для анализа SCMS.
  4. В качестве растворителя экстракции используют ацетонитрил (≥99,9%), содержащий 0,1 % муравьиной кислоты, со скоростью потока 150 нл/мин, подаваемого шприцевым насосом.
  5. Задайте параметры MS.
    Режим положительных ионов: м/з 200-1500, +2,9 кВ, массовое разрешение 120 К (при м/з 200).
    Режим отрицательных ионов: м/з 70-900, −2,1 кВ, массовое разрешение 120 К (при м/з 200).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку отрицательные ионы обычно обнаруживаются в диапазоне m/z ниже, чем у положительных ионов, для этих двух режимов ионов можно использовать различные диапазоны m/z. Дополнительные настройки МС включают максимальное время инжекции 100 мс, одно микросканирование, стандартную автоматическую регулировку усиления (AGC), режим полного сканирования (для анализа MS), столкновительную диссоциацию более высоких энергий (HCD) (для анализа MS/MS) с нормированной энергией столкновения 10-35 (NCE) и 320 °C для температуры ионообменной трубки. Общая ионная хроматограмма (TIC) была сгенерирована в каждой точке сканирования / времени для мониторинга стабильности сигнала и обнаружения одиночных клеток.

7. Эксперименты с одним зондом SCMS

  1. Поместите два защитных стекла (группа 1 и группа 2) вместе на моторизованный столик XYZ однозондовой установки SCMS 21,24,61.
  2. Чтобы свести к минимуму пакетные эффекты, выберите ячейки случайным образом под микроскопом.
  3. Получение масс-спектров положительных и отрицательных ионных мод. Анализируйте несколько (например, ~30) ячеек в группе с одним и тем же одним зондом, скоростью потока растворителя и напряжением ионизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте один и тот же зонд, скорость потока растворителя и напряжение ионизации для каждого эксперимента, чтобы обеспечить сопоставимость данных. Ежедневно калибруйте Orbitrap перед получением. Анализы как МС, так и МС/МС могут быть выполнены на уровне отдельных клеток. Сбор данных MS для получения точных значений m/z для исследований профилей метаболитов и предварительных меток в нецелевом анализе. Проведение МС/МС анализа выбранных ионов для молекулярной идентификации в таргетном анализе. Данные были получены с помощью совместимого программного обеспечения для сбора и интерпретации данных.

8. Анализ данных

  1. Предварительная обработка необработанных данных SCMS с помощью пользовательского скрипта R. Этапы предварительной обработки включают удаление фона и шума, а также нормализацию интенсивности ионов до TIC 11,12,23.
  2. Деизотопизируйте данные SCMS с помощью пакета Python ms_deisotope.
  3. Выполните выравнивание пиков с помощью собственного скрипта Python60. Для группирования используйте ширину бункера 0,01 м/z. Используйте допуск по массе 0,01 м/з или 5 ppm для выравнивания пиков.
  4. Выполнение статистического анализа данных с помощью MetaboAnalyst 6.062. Проведите t-критерий и сгенерируйте тепловую карту (для относительных уровней метаболитов). Выберите Использовать топ-100 в T-критерии/ANOVA для генерации топ-100 метаболитов, ранжированных по p-значениям от низких до высоких, со значительной разницей (p < 0,05) от сравнения. Постройте тепловую карту, используя эти 100 основных метаболитов.
  5. Поиск точных значений m/z и спектров MS/MS по базе данных метаболомов человека (HMDB63). Используйте допуск по массе 10 ppm при поиске в базе данных MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поиска баз данных можно использовать другие базы данных, такие как LipidMaps64.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом отчете описывается методология, которая объединяет промывку клеток, быструю закалку клеток, вакуумную сушку и хранение при -80 °C (Рисунок 1). В частности, этот подход предназначен для сохранения метаболомного состояния клеток до проведения анализа SCMS. Эффективность этого протокола была проверена путем подготовки клеток в двух различных условиях: свежезакаленных и высушенных клетках (группа 1, выступающая в качестве контроля) и закаленных, высушенных и хранящихся при температуре -80 °C клетках (группа 2). Каждая группа была проанализирована с помощью метода Single-probe SCMS как в положительном, так и в отрицательном ионном режимах. Анализ главных компонент (PCA) и визуализация тепловой карты были использованы для оценки различий в метаболомных профилях между группами.

Результаты PCA в режиме положительных ионов (рис. 2A) показали, что группы 1 и 2 имеют схожие общие профили метаболитов. Почти идентичные профили групп 1 и 2 показывают, что хранение при температуре -80 °C в течение 48 ч существенно не изменяет метаболом, если клетки правильно гасятся перед сушкой. В режиме отрицательных ионов (рис. 2В) наблюдается аналогичная картина, хотя группа 2 выглядит несколько более отчетливой – возможно, из-за различий в ионизации между конкретными классами метаболитов, например, фосфатидилхолины лучше обнаруживаются в положительном режиме, в то время как жирные кислоты ионизируются более эффективно в отрицательном режиме60. Несмотря на эти различия, последовательная кластеризация между группами 1 и 2 в обоих режимах подтверждает вывод о том, что интегрированный протокол гашения-сушки-хранения поддерживает метаболическую целостность.

Анализ тепловой карты дополнительно подтвердил выводы PCA, изобразив относительное содержание 100 основных метаболитов в двух группах. Как показано на рисунке 3, топ-100 метаболитов демонстрируют весьма устойчивые паттерны распространенности между группами 1 и 2 в обоих ионных режимах. Не наблюдается каких-либо значительных сдвигов или группоспецифичной кластеризации, хотя незначительные вариации в нескольких кластерах метаболитов могут отражать различия в эффективности ионизации или стабильности метаболитов. Эти результаты в совокупности демонстрируют, что рабочий процесс закалки-сушки-хранения сохраняет клеточные метаболомные профили с высокой точностью, что делает его хорошо подходящим для применения в условиях окружающей среды SCMS.

figure-results-1
Рисунок 1: Общий рабочий процесс для анализа масс-спектрометрии одиночных клеток (SCMS) и изучение того, как гашение LN2 и 48-часовое хранение при -80 °C влияют на профили метаболитов в одиночных клетках. (A) Клетки засевали, инкубировали и промывали с использованием раствора аммониевой формы (AF). (B) Были подготовлены две группы клеток - группа 1: клетки были промыты, закалены и сублимационной сушки для непосредственных экспериментов SCMS без хранения; Группа 2: клетки промывались, закалялись, лиофилизировались и хранились при температуре -80 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Анализ главных компонент (PCA) данных SCMS из клеток HCT-116 в экспериментальных группах в режиме (A) положительных ионов и (B) в режиме отрицательных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Тепловые карты, показывающие относительные уровни 100 основных метаболитов, обнаруженных в одиночных клетках HCT-116, приготовленных в различных условиях, представленные для (А) режима положительных ионов и (В) режима отрицательных ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важнейшим этапом в этом протоколе является немедленное гашение живых клеток с помощью LN2 после промывки ФП, что существенно снижает ферментативную активность и останавливает текущие метаболические процессы. Кроме того, промывка клеток с помощью ФП перед гашением, повышает интенсивность ионов и снижает матричные эффекты, поддерживая ее включение в качестве подготовительного этапа для улучшения чувствительности SCMS. В текущих исследованиях клетки в разных группах (т.е. в группе 1 и группе 2) культивировались с использованием одной и той же исходной партии, чтобы свести к минимуму их биологическую вариативность. Время хранения в 48 часов было выбрано потому, что клетки с дополнительным временем роста (группа 1) все еще могут поддерживать подходящую плотность клеток (например, чтобы избежать клеточных агрегатов) для сравнительного анализа SCMS с хранящимися клетками (группа 2). Тем не менее, следует проявлять осторожность при хранении в холодильнике, даже в течение 48 часов, поскольку значительные метаболические изменения все еще наблюдались при сравнении между свежевысушенными и хранившимися образцами (Группа 1 и Группа 1. Группа 2). Хотя в реальных исследованиях образцы клеток и тканей обычно хранятся в течение более длительных периодов времени (например, в течение недель и месяцев) в морозильной камере при температуре -80 °C, рекомендуется сократить время хранения, чтобы свести к минимуму изменения метаболитов.

Поэтому поиск и устранение неисправностей должно быть сосредоточено на минимизации времени между сушкой и анализом SCMS, чтобы гарантировать, что условия размораживания не будут конденсироваться или частично регидратироваться. Остаточное содержание воды и конденсация воды во время переходов между образцами могут частично регидратировать клетки и способствовать ферментативным и химическим реакциям, таким как гидролиз, окисление и протеолиз, которые разрушают метаболиты65, что приводит к искусственным изменениям метаболитного состава. Тщательно высушенные образцы эффективно останавливают эти процессы и сохраняют молекулярную целостность66. Обеспечение среды без высыхания влаги и быстрый переход на SCMS является ключом к предотвращению этих ловушек.

Несмотря на успех этого метода в сохранении профилей метаболитов, ограничения остаются. Метод требует доступа к вакуумной системе сушки и морозильной камере при температуре -80 °C, и он не полностью эффективен для длительного хранения. Кроме того, в то время как быстрая сушка при комнатной температуре временно сохраняет метаболиты, она не является заменой закалки LN2 . Изменения, связанные с хранением, все еще могут возникать из-за неполного удаления воды и риска регидратации во время работы с пробами. Эти ограничения подчеркивают необходимость уточнения метода, если требуется более длительное хранение или более высокая пропускная способность.

Протоколы, представленные в данной работе, предлагают упрощенный и эффективный подход к сохранению метаболома одной клетки для СКМС окружающей среды. В отличие от методов, требующих сложных криопротекторов или замораживания in situ, наш рабочий процесс легко совместим с существующими методами ионизации окружающей среды и обеспечивает гибкие сроки отбора проб и анализа. Интеграция функций промывки, гашения, сушки и кратковременного хранения клеток без существенной потери метаболомной точности является практичным решением для лабораторий, не имеющих доступа к масс-спектрометрам по требованию. Этот подход обладает большим потенциалом для продвижения исследований в области биологии одноклеточных систем, метаболизма рака, гетерогенности лекарственного ответа и метаболического фенотипирования популяций редких клеток. Широкая применимость этих протоколов, особенно для платформ SCMS на основе ионизации окружающей среды, делает их важным вкладом в область аналитических методов для отдельных клеток. В будущих исследованиях эти протоколы могут быть адаптированы и уточнены для учета более широкого спектра типов клеток. С помощью дополнительных этапов пробоподготовки (например, нанесения матрицы) обработанные клетки потенциально могут быть проанализированы с помощью других методов SCMS (например, MALDI и SIMS), что обеспечивает более высокое пространственное разрешение и пропускную способность для анализа большего числа клеток (например, клеток с высокой степенью слияния). Результаты также свидетельствуют о том, что эти протоколы закалки-сушки-хранения потенциально могут быть использованы для подготовки клеток к транспортировке (например, в контейнерах с сухим льдом), что позволяет проводить совместные исследования SCMS в разных местах.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным научным фондом (2305182), Национальными институтами здравоохранения (1R01AI177469) и Инициативой Чан Цукерберга. Рисунок 1 был создан в BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
-80 °°°; C морозильной камерыЭппендорф, Нью-БрансуикУ700Подготовка образцов
АцетонтрилThermoFisher Scientific240744Настройка эксперимента SCMS
Формиат аммония ThermoFisher Scientific401152500Подготовка образцов
Покровное стекло 18 ммМикрозащитное стекло VMR48380046Культура клеток
Цифровой стереомикроскопШэньчжэнь D& Ф. Ко.Суперглаза T004Анализ
Кварцевая трубка с двойным отверстием, 1,120"x0.005"x12"Friedrich & Диммок, Инк.МБТ-005-020-2QИзготовление с одним преобразователем
Эпоксидная смолаДевконНомер для заказа: 20945Изготовление с одним преобразователем
Муравьиная кислотаНаука Уорда 470301-120 500млНастройка эксперимента SCMS
Капилляр из плавленого диоксида кремния, ID: 40 & микро; м, OD: 100 & микро; mПолимикро ТехнологииTSP040105Изготовление с одним преобразователем
капилляр из плавленого диоксида кремния, ID: 50 &микро; м, OD: 150 & микро; mПолимикро Технологии1068150015Настройка эксперимента SCMS
Покровные стекла, 18 ммВВР 48380046Культура клеток
Синтетическая сыворотка HyClone (FBS)ГиклонSH3006603Культура клеток
Инкубатор HeraCell (Heraeus)Культура клеток
Лазерный съемникСаттер Инструмент Ко.Модель P-2000Изготовление с одним преобразователем
Светодиодная УФ-лампаСтоматологическое оборудование Foshan Liang YaLY-C240Изготовление с одним преобразователем
McCoy's 5A Gibco 2537128Культура клеток
МикросоюзIDEX Health & ООО «Наука»М-539Настройка эксперимента SCMS
Модифицированный интерфейс FAIMS pro Термо Фишер 98100-20046Анализ
MycoAlert PLUS Набор для обнаружения микоплазмыЛонзаЛТ07-703Культура клеток
Оптический щит Thorlabs Inc., НьютонАнализ
Вода класса Optima LC/MS (Fisher Chemical, США)ThermoFisher ScientificШ6500Подготовка образцов
Масс-спектрометр Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher ScientificНастройка эксперимента SCMS
Пенициллин/стрептомицинGibco15140-122Культура клеток
Фосфатно-солевой буфер (PBS)ВВР0780-50ЛКультура клеток
Концентратор SpeedVac (Savant)ThermoFisher Scientific СПД111 ВПодготовка образцов
Шприцевой насос (SKE10)Chemyx Inc.80561Настройка эксперимента SCMS
Шприц, 250 & микро; LГамильтон1725ЛТН250УЛНастройка эксперимента SCMS
TC20 Автоматический счетчик ячеекЛаборатории Bio-Rad 1450102EDUКоличество ячеек
Чашка для культивирования тканей, 100 ммНаучный Фишер FB012924Культура клеток
Трипсин-ЭДТАThermoFisher Scientific25200-072Культура клеток
USB цифровой микроскоп ("Скорпион" 500 Zoom)Чайнавасион, Оптовая Компания Лтд.Анализ
УФ-отверждаемая смолаПрайм ДенталКод: 006.030Изготовление с одним преобразователем
Программное обеспечение XcaliburThermoFisher Scientific
XYZ-столик (CONEX-MFACC)Корпорация НьюпортАнализ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology (Basel). 12 (3), 393(2023).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat Methods. 8 (4 Suppl), S20-S29 (2011).
  3. Kanter, I., Kalisky, T. Single cell transcriptomics: Methods and applications. Front Oncol. 5, 53(2015).
  4. Newman, J. R., et al. Single-cell proteomic analysis of s. Cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  5. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
  6. Yang, Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  7. Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. Challenges and opportunities of metabolomics. J Cell Physiol. 227 (8), 2975-2981 (2012).
  8. By B Alberts, D. B., Lewis, J., Raft, M., Roberts, K., Watson, J. D. Molecular biology of cell. 1361, Garland Publishing. (1994).
  9. Zhang, L., Vertes, A. Single-cell mass spectrometry approaches to explore cellular heterogeneity. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  10. Duncan, K. D., Fyrestam, J., Lanekoff, I. Advances in mass spectrometry-based single-cell metabolomics. Analyst. 144 (3), 782-793 (2019).
  11. Lan, Y., Zou, Z., Yang, Z. Single cell mass spectrometry: Towards quantification of small molecules in individual cells. TrAC Trends Anal Chem. 174, 117657(2024).
  12. Renmeng Liu, Z. Y. Single cell metabolomics using mass spectrometry- techniques and data analysis. Analytica Chimica Acta. 1143, 11(2021).
  13. Chen, Z. Y., et al. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single-cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13, 6687-6695 (2022).
  14. Ibanez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  15. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  16. Passarelli, M. K., et al. The 3D orbisims-label-free metabolic imaging with subcellular lateral resolution and high mass-resolving power. Nat Methods. 14 (12), 1175-1183 (2017).
  17. Suvannapruk, W., et al. Single-cell metabolic profiling of macrophages using 3D orbisims: Correlations with phenotype. Anal Chem. 94 (26), 9389-9398 (2022).
  18. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live single-cell molecular analysis by video-mass spectrometry. Anal Sci. 24 (5), 559-561 (2008).
  19. Zhang, H., Shi, X., Lu, H., Li, L. Delineation of subcellular molecular heterogeneity in single cells via ultralow-flow-rate desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 97 (18), 9985-9991 (2025).
  20. Bergman, H. -M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  21. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: Single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chem Commun (Camb). 55 (5), 616-619 (2019).
  23. Bhusal, D., Wije Munige, S., Peng, Z., Yang, Z. Exploring single-probe single-cell mass spectrometry: Current trends and future directions. Anal Chem. 97 (9), 4750-4762 (2025).
  24. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the single-probe: Mass spectrometry imaging and single cell analysis under ambient conditions. J Vis Exp. (112), e53911(2016).
  25. Pan, N., et al. Quantification of drug molecules in live single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 91 (14), 9018-9024 (2019).
  26. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic studies of live single cancer stem cells using mass spectrometry. Anal Chem. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  27. Lan, Y., Chen, X., Yang, Z. Quantification of nitric oxide in single cells using the single-probe mass spectrometry technique. Anal Chem. 95 (51), 18871-18879 (2023).
  28. Chen, X., Sun, M., Yang, Z. Single cell mass spectrometry analysis of drug-resistant cancer cells: Metabolomics studies of synergetic effect of combinational treatment. Anal Chim Acta. 1201, 339621(2022).
  29. Sun, M., Chen, X., Yang, Z. Single cell mass spectrometry studies reveal metabolomic features and potential mechanisms of drug-resistant cancer cell lines. Anal Chim Acta. 1206, 339761(2022).
  30. Bensen, R. C., et al. Single-cell mass spectrometry quantification of anticancer drugs: Proof of concept in cancer patients. ACS Pharmacol Transl Sci. 4 (1), 96-100 (2021).
  31. Liu, R., Zhang, G., Sun, M., Pan, X., Yang, Z. Integrating a generalized data analysis workflow with the single-probe mass spectrometry experiment for single cell metabolomics. Anal Chim Acta. 1064, 71-79 (2019).
  32. Nguyen, T. D., et al. Single-cell mass spectrometry enables insight into heterogeneity in infectious disease. Anal Chem. 94 (30), 10567-10572 (2022).
  33. Liu, R., et al. Quantifying cell heterogeneity and subpopulations using single cell metabolomics. Anal Chem. 95 (18), 7127-7133 (2023).
  34. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using dicationic ion-pairing compounds to enhance the single cell mass spectrometry analysis using the single-probe: A microscale sampling and ionization device. Anal Chem. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  35. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass spectrometry measurement of single suspended cells using a combined cell manipulation system and a single-probe device. Anal Chem. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  36. Chen, X., Peng, Z., Yang, Z. Metabolomics studies of cell-cell interactions using single cell mass spectrometry combined with fluorescence microscopy. Chem Sci. 13 (22), 6687-6695 (2022).
  37. Bergman, H. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-desi ms. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  38. Portero, E. P., Nemes, P. Dual cationic-anionic profiling of metabolites in a single identified cell in a live Xenopus laevis embryo by microprobe CE-ESI-MS. Analyst. 144 (3), 892-900 (2019).
  39. Zhang, X. C., et al. Combination of droplet extraction and pico-ESI-MS allows the identification of metabolites from single cancer cells. Anal Chem. 90 (16), 9897-9903 (2018).
  40. Guo, S., Zhang, C., Le, A. The limitless applications of single-cell metabolomics. Curr Opin Biotechnol. 71, 115-122 (2021).
  41. Buziol, S., et al. New bioreactor-coupled rapid stopped-flow sampling technique for measurements of metabolite dynamics on a subsecond time scale. Biotechnol Bioeng. 80 (6), 632-636 (2002).
  42. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic Synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  43. Wang, T. X. Y. G., Zhuang, Y., Wang, G. A systematic evaluation of quenching and extraction procedures for quantitative metabolome profiling of HeLa carcinoma cell under 2D and 3D cell culture conditions. Biotechnol J. 18 (5), e2200444(2023).
  44. Hernandez Bort, J. A., et al. Reduced quenching and extraction time for mammalian cells using filtration and syringe extraction. J Biotechnol. 182 - 183 (100), 97-103 (2014).
  45. House, R. R. J., et al. A diverse proteome is present and enzymatically active in metabolite extracts. Nat Commun. 15 (1), 5796(2024).
  46. Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms. Anal. Chem. 82, 6(2010).
  47. Sellick, C. A., et al. Effective quenching processes for physiologically valid metabolite profiling of suspension cultured mammalian cells. Anal Chem. 81 (1), 174-183 (2008).
  48. Dietmair, S., Timmins, N. E., Gray, P. P., Nielsen, L. K., Kromer, J. O. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem. 404 (2), 155-164 (2010).
  49. Faijes, M., Mars, A. E., Smid, E. J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum. Microb Cell Fact. 6, 27(2007).
  50. Pabst, M. G. J., et al. Nucleotide and nucleotide sugar analysis by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry on surface-conditioned porous graphitic carbon. Anal. Chem. 82 (23), 6(2010).
  51. Lorenz, M. A., Burant, C. F., Kennedy, R. T. Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics. Anal Chem. 83 (9), 3406-3414 (2011).
  52. Wahrheit, J., Heinzle, E. Quenching methods for the analysis of intracellular metabolites. Methods Mol Biol. 1104, 211-221 (2014).
  53. Volmer, M., Gettmann, J., Scholz, S., Buntemeyer, H., Noll, T. A method for metabolomic sampling of suspended animal cells using fast filtration. BMC Proc. 5 (Suppl 8), P93(2011).
  54. Richard King, R. B., Fernandez-Metzler, C., Cynthia Miller-Stein, A. T. O. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization. J Am Soc Mass Spectrom. 11, 8(2000).
  55. Dunn, W. B. Current trends and future requirements for the mass spectrometric investigation of microbial, mammalian and plant metabolomes. Phys Biol. 5 (1), 011001(2008).
  56. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: Quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), 53(2017).
  57. Krismer, J., et al. Screening of Chlamydomonas reinhardtii populations with single-cell resolution by using a high-throughput microscale sample preparation for matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Appl Environ Microbiol. 81 (16), 5546-5551 (2015).
  58. Ye, D., et al. Improved sample preparation for untargeted metabolomics profiling of Escherichia coli. Microbiol Spectr. 9 (2), e0062521(2021).
  59. Volmer, M., et al. Fast filtration for metabolome sampling of suspended animal cells. Biotechnol Lett. 33 (3), 495-502 (2011).
  60. Wije Munige, S., Bhusal, D., Peng, Z., Chen, D., Yang, Z. Developing a cell quenching method to facilitate single cell mass spectrometry metabolomics studies. JACS Au. 5 (5), 2379-2387 (2025).
  61. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated cell manipulation platform coupled with the single-probe for mass spectrometry analysis of drugs and metabolites in single suspension cells. J Vis Exp. (148), e59875(2019).
  62. Pang, Z., et al. Metaboanalyst 6.0: Towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  63. Wishart, D. S., et al. Hmdb 5.0: The human metabolome database for 2022. Nucleic Acids Research. 50 (D1), D622-D631 (2022).
  64. Conroy, M. J., et al. Lipid maps: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
  65. Pinu, F., Villas-Boas, S. Extracellular microbial metabolomics: The state of the art. Metabolites. 7 (3), 43(2017).
  66. Rockinger, U., Funk, M., Winter, G. Current approaches of preservation of cells during (freeze-) drying. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (8), 2873-2893 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи