Прецизионная индукция и различие рефлексов кашля и чихания у мышей

Краткое содержание

В этом исследовании были установлены модели кашля и чихания у мышей путем применения специфических стимулов к трахее и носовой полости, а также разработан основанный на звуке метод для различения мышиного кашля и чихания путем анализа различий в их акустических сигналах.

Аннотация

Кашель и чихание, как жизненно важные дыхательные защитные рефлексы, были исследованы в отношении механизмов, ограниченных неспецифической стимуляцией, присущей традиционным моделям. Существующие методы, такие как распыление капсаицином или лимонной кислотой, могут одновременно активировать кашель (опосредованный волокнами трахеи С) и чихание (опосредованный носовыми тройничными нервами), что приводит к искаженным поведенческим наблюдениям. Несмотря на то, что в предыдущих исследованиях предпринимались попытки различить кашель и чихание путем анализа дыхательных паттернов или акустических сигнатур, в этих исследованиях отсутствуют модели, которые могли бы специфически стимулировать трахею и носовую полость. Здесь мы разработали мышиную модель, использующую сайт-специфичную стимуляцию трахеи (для индуцирования кашля) и носовой полости (для вызова чихания). Используя синхронизированную мультимодальную запись, плетизмографию всего тела (WBP), широкополосные ультразвуковые микрофоны (0-250 кГц) и высокоскоростную видеосъемку (160 кадров в секунду), мы количественно определили различные физиологические признаки кашля и чихания. Наши результаты показали, что как кашель, так и чихание демонстрируют одно- и двухпиковые дыхательные паттерны со значительными различиями в спектре звуковых частот. Построив систему координат на основе звуковых особенностей, мы смогли эффективно различать кашель и чихание, сопоставляя их с разными квадрантами оси координат. Это исследование, с помощью анатомически специфической стимуляции и анализа акустических особенностей, позволило создать модель мыши, способную количественно различать кашель и чихание, обеспечив высокоточный экспериментальный метод для исследования защитных рефлексов дыхательных путей и целенаправленной терапевтической разработки.

Введение

Кашель и чихание являются важнейшими защитными рефлексами организма для выведения инородных веществ из дыхательных путей, а аномалии в связанных с ним нервных путях часто провоцируют хронические заболевания, такие как хронический кашель и ринит. Оба рефлекса включают фазу вдоха, фазу сжатия и фазу выдоха ^1,2. Кашлевой рефлекс в первую очередь опосредован сенсорными нейронами дыхательных путей, иннервируемыми блуждающим нервом ^3,4,5. Блуждающие нейроны получают механические, химические или электрические стимулы из дыхательных путей и передают сигналы в ядро tritarius solitarius (NTS) в продолговатом мозге⁶. NTS интегрирует эту информацию и впоследствии проецирует ее в дыхательные центры в продолговатом мозге и мосте⁷. Эти центры в конечном итоге координируют соответствующие группы дыхательных мышц (такие как диафрагма, межреберные мышцы и гортанные мышцы) для выполнения кашлевого действия, выталкивая потенциально вредные раздражители и слизь из дыхательных путей через ротовую полость ^8,9,10. Чихательный рефлекс в первую очередь опосредован носовыми сенсорными нейронами в тройничном ганглии^11,12. Их механические или химические стимулы передаются в спинномозговое ядро тройничного нерва (SP5), которое затем передает информацию в дыхательные центры 13,14,15,16. Эти центры регулируют соответствующие мышцы (такие как дыхательные мышцы, небные мышцы и лицевые мышцы) для инициирования чихания^. Мощный выдох при чихании выталкивает большую часть воздуха через нос, чтобы вытеснить раздражители ^9,18. Исследования кашля и чихания не только помогают выяснить нейронные механизмы защиты дыхания, но и обеспечивают терапевтические мишени для лечения хронического кашля и ринита. В связи с этим создание прочной и надежной модели животного имеет первостепенное значение.

В последние годы мыши стали ключевым модельным организмом для изучения нейронных путей кашля и чихания 19,20,21. Преобладающая в настоящее время методология по-прежнему включает в себя индуцирование этих рефлекторных действий путем вдыхания аэрозольных стимулирующих соединений ^8,20,22. Существенным ограничением этого ингаляционного подхода является то, что стимулы одновременно воздействуют как на носовую полость, так и на трахею, неспецифически активируя различные сенсорные афферентные системы, опосредующие чихание (через тройничный путь) и кашель (через блуждающий путь). Это создает существенную проблему для точной дифференциации выявленного типа поведения в экспериментах. Это расхождение очевидно в литературе: некоторые исследования определяют индуцированные капсаицином дыхательные рефлексы у мышей как чихание²¹, в то время как другие сообщают, что эти рефлексы включают в себя компоненты как кашля, так и чихания ^8,22.

Для решения этой проблемы были разработаны передовые методологии, включая анализ дыхательных паттернов и траекторий для классификации различных рефлекторных моделей поведения⁸. Другое исследование показывает, что при кашле и чихании наблюдаются заметные различия во временных и спектральных характеристиках, таких как продолжительность,^{частотная} модуляция. Их работа показала, что кашель демонстрирует концентрацию энергии в более низких диапазонах пиковых частот (20-80 кГц), в то время как при чихании компоненты простираются за пределы 90 кГц²². Эти акустические дивергенции предлагают новую, неинвазивную основу для поведенческой дискриминации, дополняя традиционный анализ дыхательных волн. Несмотря на эти инновации, критический разрыв сохраняется: существующим моделям не хватает анатомической специфичности в доставке стимулов, что часто путает трахейные и носовые рефлекторные пути. Это ограничение показывает, что нам нужны более эффективные способы нацеливания и изучения дыхательных рефлексов.

Исследования механизмов, лежащих в основе кашля и чихания, вызванных механической и химической стимуляцией дыхательных путей, широко проводились на крупных животных моделях (например, на кошках)¹⁷. Однако в моделях мелких животных (например, морских свинок, крыс и мышей) технические ограничения, как правило, обуславливают необходимость использования аэрозольных соединений (таких как капсаицин или лимонная кислота) для достижения химической стимуляции.

Этот протокол предлагает новый метод индуцирования кашляющего и чихающего поведения у мышей и устанавливает новый набор методов для количественной оценки и характеристики этих дыхательных рефлексов. Этот подход устанавливает стратегию дифференциации кашлевого и чихающего поведения у мышей путем идентификации характерных вокализаций и анализа их спектральных особенностей и акустической интенсивности. Эта новая методология обладает потенциалом для стандартизации количественной оценки респираторных рефлексов мышей, повышения экспериментальной воспроизводимости и углубления механистического понимания нейрофизиологии кашля и чихания.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Протокола использования и ухода за животными лаборатории Гуанчжоу (GZLAB-AUCP-2024-04-A10). В этом исследовании использовались самки и самцы мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, не содержащие специфических патогенов.

1. Подготовка к эксперименту

1. Подготовка подопытных животных
   1. Содержать мышей в клетках со свободным доступом к пище и воде и поддерживать при температуре 22 ± 1 °C при стандартном 12-часовом цикле свет/темнота.
2. Приготовление раствора капсаицина
   1. Растворите 30,5 мг порошка капсаицина в PBS, содержащем 10% этанола и 10% Tween-80, чтобы получить 10 мМ исходный раствор.
   2. Развести стоковый раствор 1:100 в физиологическом растворе для получения рабочего раствора 100 мкм.
3. Приготовление трибромэтанола (Авертина)
   1. Смассируйте 0,5 г трибромэтанола в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл 2-метил-2-бутанола.
   2. Инкубировать при температуре 55 °C с перемешиванием (400-600 об/мин) в темноте до полного растворения (~20 мин).
   3. Поместите в стакан 40 мл физиологического раствора. Помешивая, добавьте растворенный раствор трибромэтанола по каплям. Продолжайте помешивать до полного рассеивания растворенных кристаллов (~40 мин).
   4. Отрегулируйте pH до 7,0-7,3 с помощью NaOH.

2. Установление и регистрация кашель-подобной модели поведения

1. Подготовка канюли для имплантации
   1. Разрежьте иглу 28 G (внутренний диаметр: 0,19 мм, внешний диаметр: 0,35 мм) в канюлю ~5 мм. Сгладьте оба конца наждачной бумагой с помощью щипцов. Прикрепите один конец к силиконовой трубке (внутренний диаметр: 0,3 мм, внешний диаметр: 0,8 мм). Подсоедините к шприцу объемом 1 мл и промойте канюлю водой, чтобы проверить проходимость.
   2. Согните канюлю под углом 90° с соотношением плеч 2:3. Вставьте более длинный кронштейн в силиконовую трубку (внутренний диаметр: 0,3 мм, внешний диаметр: 0,8 мм, длина 5 см; Рисунок 1А). Обозначьте загнутый конец для имплантации трахеи. Протяните силиконовую трубку от трахеи к черепу для фиксации (рисунок 1B).
2. Подготовка к настройке звукозаписывающего оборудования
   1. Подготовьте систему плетизмографии всего тела (WBP), ультразвуковой регистратор, высокоскоростную камеру, насос для микроинъекций.
3. Назначение группы мыши
   1. Случайным образом распределите мышей по трем группам (n = 6/группа): i) Контрольная группа: Поддерживайте нормальное состояние без лечения. ii) Фиктивная группа: Имплантация трахеальной канюли без стимуляции. iii) Группа стимуляции: Имплантируйте трахеальную канюлю и введите капсаицин, чтобы вызвать кашель.
4. Хирургическое вмешательство
   1. Обезболивают мышей путем внутрибрюшинного введения трибромэтанола (125-250 мг/кг), а полную анестезию подтверждают отсутствием реакции на защемление пальца ноги.
   2. Закрепите мышь под наркозом на спине. Сбрейте волосы на черепе и шейке матки. Продезинфицируйте йодофором. С помощью хирургических ножниц обрежьте круглый участок кожи головы диаметром примерно 5 мм, чтобы обнажить череп.
   3. Под микроскопом: Надрезать кожу шейки матки примерно на 1 см. Тупо рассеките ткани и мышцы, чтобы обнажить трахею. Проколите мягкие ткани между перстневидным и трахеальным хрящами с помощью иглы 32 G. С помощью офтальмологических ножниц создайте минимальное отверстие в трахее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер отверстия должен быть достаточным для диаметра канюли, чтобы предотвратить повреждение тканей.
   4. Вставьте металлическую канюлю (в силиконовой оболочке) ~1 мм в просвет трахеи. Надежное соединение канюли и трахеи с помощью шва 7-0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте глубину введения до 1 мм, чтобы избежать нарушения дыхания.
   5. Тупой туннель подкожно от шеи к черепу. Проложите силиконовую трубку к черепной коробке и зафиксируйте ее стоматологическим цементом.
   6. Шов на шейный разрез. Поместите мышь на грелку до тех пор, пока она не придет в сознание. Птичник в клетке на 5 дней.
   7. Ежедневно промывайте канюлю/трубку трахеи с помощью воздушного шприца объемом 1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исключите приливание крови в течение 24 часов до индукции кашля.
5. Запись кашля
   1. Установите ультразвуковой датчик с уплотнительным кольцом, совместимым с портами. Вставьте щуп в порт камеры WBP, чтобы обеспечить герметичный контакт.
   2. Подключите камеру WBP, датчик расхода и смещение потока. Калибровка с помощью программного обеспечения.
   3. Прикрепите силиконовую трубку с фиксированным черепом к удлинительной трубке длиной 30 см. Поместите мышь в камеру WBP. Протяните трубку через верхний порт. Запечатайте порт пластилином для лепки. Проверьте герметичность камеры, убедившись, что пики формы дыхательной волны находятся в пределах 4 ± 2.
   4. Загрузите в 1 мл шприца 5 мл раствора капсаицина. Устраните пузырьки воздуха. Подсоедините к удлинительной трубке. Установите шприц на микроинжекционный насос и установите расход на 10 мкл ^мин-1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное выделение жидкости может привести к попаданию капсаицина в носовую полость.
   5. Расположите высокоскоростную камеру лицом к камере. Отрегулируйте расстояние и фокусировку. Установите частоту дискретизации на 160 кадров в секунду (максимум).
   6. Одновременно запустите программное обеспечение WBP, УЗИ и камеры; Запустите помпу, чтобы ввести капсаицин. Рекордные показатели кашля в течение 10 мин.

3. Установление и регистрация модели чихающего поведения

1. Подготовка экспериментального оборудования
   1. Подготовьте одну стерильную полиэтиленовую трубку (внутренний диаметр: 0,5 мм, внешний диаметр: 1 мм) для фиксации в качестве канюли для стимуляции на носовой кости мыши.
   2. Подготовьте одну стерилизованную нейлоновую нить диаметром 0,25 мм для трансканюльной стимуляции носа. Используйте метод калибровки Вонфри, когда нить длиной 5 см вертикально прижимается к весам до тех пор, пока она не согнутся примерно на 45°, измеренное усилие составляет 0,6 g.
2. Настройка записывающего оборудования
   1. Готовы одна система плетизмографии всего тела (WBP), один ультразвуковой регистратор и одна высокоскоростная камера.
3. Назначение группы мыши
   1. Случайным образом распределите мышей по трем группам (n = 6/группа): i) Контрольная группа: Поддерживайте исходный статус без лечения. ii) Фиктивная группа: Фиксация носовой канюли без стимуляции. iii) Группа стимуляции: фиксация носовой канюли + вызов чихания с помощью стимуляции нитями.
4. Хирургическое вмешательство
   1. Обезболивают мышей путем внутрибрюшинного введения трибромэтанола (125-250 мг/кг), а полную анестезию подтверждают отсутствием реакции на защемление пальца ноги.
   2. Сбрейте волосы на черепе черепа и переносице.
   3. Закрепите мышь в стереотаксической рамке. Продезинфицируйте йодофором. Надрежьте кожу над черепом и носовой костью. Обнажите носовую кость.
   4. С помощью микросверла создайте отверстие 0,5 мм в месте соединения между носовой костью и боковым отростком хряща носовой перегородки. Обнажите слизистую оболочку носа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте размер отверстия до 0,5 мм, чтобы предотвратить повреждение тканей.
   5. Аккуратно приподнимите слизистую оболочку носа с помощью иглы 32 G. Обнажите носовую полость.
   6. Установите полиэтиленовую трубку в стереотаксический кронштейн. Расположите кончик трубки заподлицо с отверстием для заусенцев. Закрепите трубку на носовой кости с помощью стоматологического цемента.
   7. Поместите мышь на грелку до тех пор, пока сознание не вернется.
5. Запись чихания
   1. Подключите камеру WBP, датчик расхода и смещение потока в соответствии с инструкцией. Выполните калибровку с помощью программного обеспечения.
   2. Установите ультразвуковой щуп с прокладкой, приспособленной к порту. Вставьте щуп в камеру. Проверьте герметичность уплотнения.
   3. Перенесите мышь в камеру WBP. Протяните полиэтиленовую трубку через верхний порт. Заклейте порт пластилином вокруг трубки. Проверьте герметичность камеры, убедившись, что пики формы дыхательной волны находятся в пределах 4 ± 2.
   4. Расположите высокоскоростную камеру лицом к камере. Отрегулируйте расстояние и фокусировку. Установите частоту дискретизации на 160 кадров в секунду (максимум).
   5. Протолкните нейлоновую нить диаметром 0,25 мм через мягкую трубку в носовую полость на глубину 0-3 мм. Часть нити, выступающая из ручной трубки, имеет длину 5 см. Во время стимуляции надавливайте на этот свободный конец до тех пор, пока он не согнется на 45°, доставляя ~0,6 g силы на слизистую оболочку носа в течение 1 с, повторяйте один раз в 30 с. Записывайте реакцию на чихание в течение 10 минут.

4. Кашель и чихание, вызванные капсаицином, у мышей

1. Групповое назначение
   1. Разделите мышей на группы фиктивной хирургии и хирургии (n = 5/группа). Группа Шама: Обнажают двусторонние передние решетчатые и подглазничные нервы. Группа хирургии: Пересечение двусторонних передних решетчатых и подглазничных нервов.
2. Ультразвуковое распыление
   1. Подготовьте поведенческую камеру (20 см × 14 см × 17 см).
   2. Расположите ультразвуковой регистратор и камеру для оптимального мониторинга.
   3. Загрузите в небулайзер 100 μМ раствора капсаицина. Подавайте 30 с аэрозольных импульсов каждые 2 минуты в течение 10 минут.
   4. Непрерывная запись поведения с помощью ультразвукового рекордера и камеры.

5. Процесс анализа данных

1. Плетизмография всего тела (WBP) с отслеживанием дыхания
   1. Импортируйте записанные WBP текстовые файлы в программное обеспечение Spike2 и синхронизируйте их со звуковыми сигналами.
   2. Анализируйте звуковые сигналы, соответствующие однопиковым и двухпиковым паттернам дыхания, и записывайте продолжительность фазы компрессии для каждого паттерна.
   3. Выберите самую низкую точку фазы выдоха в качестве средней точки и возьмите данные за полсекунды до и после для вычисления среднего значения.
2. Анализ звуковых сигналов
   1. Импортируйте аудиофайлы в программное обеспечение Spike2, выберите отдельные звуки кашля или чихания и экспортируйте их в формате TXT (с частотой дискретизации 100 кГц и продолжительностью 0,1 с).
   2. Импортируйте файлы TXT в Excel и преобразуйте их в абсолютные значения аудиосигналов.
   3. Используйте программное обеспечение GraphPad Prism для сглаживания абсолютных значений звуковых волн с помощью сглаживающего сплайна с 50 точками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы гарантировать, что кривая точно аппроксимируется исходными данными, избегая при этом чрезмерных точек перегиба, оптимальным является выбор сглаживающего сплайна из 50 пунктов; Кривые, созданные со значениями более 50 пунктов, показывают незначительное отклонение от кривой с 50 параметрами.
   4. На основе сглаженных звуковых волн рассчитайте наклон k от начальной точки до самой высокой точки.
3. Спектральный анализ звука
   1. Импортируйте аудиофайлы в программное обеспечение Spike2.
   2. Выберите начальную и конечную временные точки отдельного звука кашля или чихания для спектрального анализа и экспортируйте результаты спектрального анализа.
   3. Используйте GraphPad Prism для создания кривых спектрального анализа и вычисления площади под кривыми.
   4. Рассчитайте соотношение площади под кривой между полосами частот 30-60 кГц и 0-30 кГц, чтобы различать кашель и чихание.
4. Расчет составного индекса
   1. Выполните преобразование натурального логарифма (ln) по наклону k и отношению площади под кривой спектрального анализа для повышения различимости данных.

6. Статистический анализ

1. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистические сравнения между двумя группами проводились с использованием t-критерия и двустороннего ANOVA, при этом P < 0,05 считался статистически значимым. Все анализы проводились с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.

Результаты

В этом исследовании мы провели подробный анализ дыхательных паттернов при кашле и чихании у мышей с использованием плетизмографии всего тела (WBP) и методов ультразвуковой регистрации. Результаты показали, что мыши, подвергшиеся операции на трахее или носу, демонстрируют сопоставимую реакцию на кашель и чихание на наивные контрольные группы. Тем не менее, капсаицин (химический) и механическая стимуляция эффективно вызывают рефлексы кашля и чихания у этих хирургически подготовленных животных (рис. 2A, B). Результаты WBP показали, что оба поведения демонстрируют одно- и двухпиковые паттерны, при этом их звуковые сигналы появляются во время выталкивающей стадии дыхательного паттерна (рис. 3A, C, E, G). Дальнейший ультразвуковой анализ выявил отчетливые акустические профили: звуки кашля резко возникали с пиковой интенсивностью, возникающей мгновенно, преимущественно в диапазоне частот 0-30 кГц, и более короткой продолжительностью (рис. 3B, D; Вспомогательное видео S1). Звуки чихания продемонстрировали постепенное нарастание интенсивности до максимальной амплитуды, широкополосное распределение частот (0-80 кГц) и увеличенную продолжительность (рис. 3F,H; Вспомогательное видео S2). Статистический анализ показал, что средняя фаза компрессии при однопиковом кашле составляла 32,39 ± 0,73 мс, что значительно короче, чем при двойном пике кашля при 53,17 ± 2,29 мс (рис. 4A, B, C). Средняя фаза компрессии при однопиковом чихании составила 44,03 ± 1,84 мс, что ниже, чем среднее значение двухпикового чихающего поведения, в то время как средняя фаза компрессии при двойном пике чихания составила 74,24 ± 1,29 мс, что значительно дольше, чем у однопикового чихания (рис. 4E, F, G). Кроме того, коэффициент встречаемости однопикового паттерна при кашле составил 77,55 ± 2,10% (рис. 4D), в то время как при чихании паттерн с одним пиком составил всего 32,42 ± 5,88%, а паттерн с двойным пиком составил 67,58 ± 5,88% (рис. 4H). Статистический анализ длительности звука показал значительные различия между временем звука кашля и чихания, но между ними было значительное перекрытие (рис. 5A). С помощью спектрального анализа ультразвукового звука кашля и чихания мы обнаружили, что частотный спектр звука кашля в основном сосредоточен в диапазоне 0-30 кГц, в то время как звук чихания имеет более высокую долю в диапазоне 0-60 кГц (рис. 5B). Хотя кашляющий звук также имел частоты в диапазоне 30-120 кГц, доля низких частот всегда была выше, чем высоких частот. Поэтому мы использовали наклон интенсивности звука от начальной точки до максимального значения (рис. 5C) в качестве вертикальной координаты и отношение энергий от 30-60 кГц до 0-30 кГц (рис. 5D) в качестве горизонтальной координаты для создания системы координат, которая могла бы эффективно различать звук кашля и чихания. Кроме того, не было выявлено существенных различий между одно- и двухпиковым кашлем, а также одно- и двухпиковым чиханием в этой системе координат (рис. 5E).

Затем мы использовали вышеупомянутые методы классификации для качеля и чихания, вызванного распылением капсаицина у мышей. Мы обнаружили, что поведение при кашле и чихании, вызванное распылением капсаицина, перекрывается с поведением, вызванным специфической стимуляцией в тех же координатных положениях (рис. 5F, G). После пересечения сенсорных афферентных нервов носа (передних решетчатых и подглазничных нервов) небулайзеризация капсаицина значительно снижала акустические сигналы, связанные с чиханием, в то время как звуковые профили, связанные с кашлем, оставались неизменными (рис. 5H, I).

Рисунок 1: Принципиальная схема операции в модели стимулированной трахеи и полости носа. (А) Схематическое изображение катетера, имплантированного в трахею. (B) Фронтальная (слева) и корональная (правая) плоскости показывают положение катетера, имплантированного в трахею мыши. (C) Сагиттальная плоскость показывает положение катетерной имплантации в носовую полость и положение стимуляции волокна нити. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Количественная оценка поведения, похожего на кашель и чихание, вызванного сайт-специфической стимуляцией. (А) Количественная оценка чихания в нормальной контрольной группе, фиктивной группе и группе механической стимуляции носа. Фиктивная группа демонстрировала частоту чихания, сравнимую с контрольной группой. Механическая стимуляция носа вызывала значительное увеличение случаев чихания. (B) Количественная оценка кашля в нормальной контрольной группе, фиктивной группе и группе провокационной терапии капсаицином трахеей. В фиктивной группе не было выявлено существенной разницы в частоте кашля по сравнению с контрольной группой. Стимуляция трахеи капсаицином значительно увеличивала количество кашлевых. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Следы дыхания и звуковая осциллограмма кашля и чихания. (A) Репрезентативные изображения, показывающие один пик респираторного следа и аудиозапись во время кашля, вызванного капсаицином. (В) Звуковая осциллограмма (вверху) и спектрограмма (внизу) аудиозаписи кашля в А. (C) Репрезентативные изображения, показывающие двойные пики, след дыхания и аудиозапись во время кашля, вызванного капсаицином. (D) Звуковая осциллограмма (вверху) и спектрограмма (внизу) аудиозаписи кашля в С. (E) Репрезентативные изображения, показывающие один пик дыхательных путей и аудиозапись во время чихания, вызванного механической стимуляцией. (F) Звуковая осциллограмма (вверху) и спектрограмма (внизу) аудиозаписи чихания в Е. (G) Репрезентативные изображения, показывающие двойные пики, следы дыхания и аудиозапись во время чихания, вызванного механической стимуляцией. (H) Звуковая осциллограмма (вверху) и спектрограмма (внизу) аудиозаписи чихания в G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Одинарный и двойной пики респираторных следов кашлевого и чихающего поведения. (A) Средние (красные) и индивидуальные (серые) и средние (красные) дыхательные следы кашлевого поведения с одним респираторным пиком (n = 52). (B) Средние (красный) и отдельные (серый) и средние (красный) респираторные следы кашлевого поведения с двойными дыхательными пиками (n = 29). (C) Продолжительность одиночных и двойных дыхательных пиков компрессионных фаз при кашле, вызванном капсаицином (одинарный пик n = 52, двойной пик n = 29). (D) Среднее соотношение следов одиночного и двойного респираторного пика при кашле (n = 6 мышей). (E) Средние (красные) и отдельные (серые) и средние (красные) следы дыхания при чихании с единичными дыхательными пиками (n = 40). (F) Средние (красные) и индивидуальные (серые) и средние (красные) следы дыхания при чихании с двойными дыхательными пиками (n = 74). (G) Продолжительность компрессионных фаз одиночного и двойного дыхания при чихании, вызванном механической стимуляцией (одинарный пик n = 40, двойной пик n = 74). (H) Среднее соотношение одиночных и двойных дыхательных пиковых следов при чихании (n = 6 мышей). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, ****P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Классификация частоты и формы волны осциллограммы звуков кашля и чихания. (A) Количественная оценка продолжительности кашля и чихания на сонограмме. (B) Анализ средней спектрограммы чиханий, вызванных механической стимуляцией (n = 69, черный) и кашель, вызванный капсаицином (n = 140, красный). (C) Репрезентативная принципиальная схема для расчета наклона звуковой осциллограммы. Сравнительный анализ сплайна сглаживания показывает, что при 25 точках чрезмерное сглаживание затемняет исходные признаки данных, в то время как значения, превышающие 50 точек (например, 75 точек), показывают существенное перекрытие с 50-сплайновой кривой, но вводят дополнительные точки перегиба. (D) Репрезентативная принципиальная диаграмма расчета отношения площадей с использованием результатов спектрального анализа для вычисления площади под различными частотными кривыми в GraphPad Prism. Отношение площадей равно площади под кривой 30-60 кГц и площади под кривой 0-30 кГц. (E) Классификация частот и формы волны чихания, вызванного механической стимуляцией, и звуковой осциллограммы кашля, вызванной капсаицином, где ось y представляет собой экспоненту наклона звуковой волны от базовой линии к пику, а ось x представляет экспоненту отношения звуковых волн между 30-60 кГц и 0-30 кГц. (F) Анализ усредненной спектрограммы чихания, вызванного небулизацией капсаицина (n = 36, черный) и кашля, вызванного небулизацией капсаицина (n = 42, красный). (G) Классификация частот и формы волны чиханий, вызванных распылением капсаицина (n = 36, черный) и кашель, вызванный распылением капсаицина (n = 42, красный) звуковой осциллограммы, где ось y представляет собой экспоненту наклона звуковой волны от базовой линии к пику, а ось x представляет экспоненту отношения звуковых волн между 30-60 кГц и 0-30 кГц. (H) Статистические данные о рефлексе чихания, индуцированном капсаицином, в группах с пересечением передних решетчатых и подглазничных нервов по сравнению с группой фиктивной хирургии. (I) Статистические данные о кашель-индуцированном капсаицином кашлевом рефлексе в группах с пересечением передних решетчатых и подглазничных нервов по сравнению с группой симуляции хирургического вмешательства. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительное видео 1: Видео кашлевого поведения, синхронизированное с его звуковой спектрограммой, отображается с нормальной скоростью и скоростью 0,1x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 2: Видео чихания, синхронизированное с его звуковой спектрограммой, отображается с нормальной скоростью и скоростью 0,1x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом исследовании мы успешно индуцировали кашель и чихание у мышей, специфически стимулируя трахею капсаицином и механически стимулируя носовую полость ^8,17. Мы синхронно собрали данные плетизмографии всего тела (WBP), аудио- и видеозаписей и обнаружили, что соотношения звуковых частот и наклоны интенсивности звука могут эффективно дифференцировать поведение при кашле и чихании у мышей ^8,23.

Учитывая деликатный характер хирургических процедур, особое внимание следует уделить нескольким критически важным этапам. Во-первых, во время операции на трахее имплантированная внутритрахеальная канюля должна быть как можно тоньше и вставляться на небольшую глубину, чтобы избежать обструкции дыхательных путей, которая может привести к респираторному дистрессу или даже смерти. Кроме того, поскольку выделения внутри трахеи могут легко блокировать катетер, ежедневный клиренс катетера имеет решающее значение. При введении капсаицина скорость инъекции необходимо тщательно контролировать, чтобы предотвратить ретроградный поток в носовую полость, который может вызвать рефлексы чихания. Во-вторых, во время операции по имплантации кости носа размер просверленного отверстия имеет решающее значение для предотвращения чрезмерного повреждения мыши. Катетер должен быть размещен на уровне носовой кости, не вводясь слишком глубоко, чтобы предотвратить чрезмерное раздражение носовой полости или нарушение нормального дыхания. В конечном счете, проведение точных хирургических процедур имеет важное значение для эксперимента. Сведя к минимуму травмы мыши, можно не только ускорить восстановление, но и записать более точные экспериментальные поведенческие реакции. Такие хирургические методы помогают повысить надежность модели и обеспечить высокое качество данных, тем самым обеспечивая прочную экспериментальную основу для изучения поведения дыхательных рефлексов, таких как кашель и чихание.

Традиционно, моделирование кашлевого поведения основывалось на распылении таких соединений, как капсаицин и лимонная кислота, чтобы вызвать кашель^24,25. Однако этот подход имеет заметные ограничения: он не только вызывает кашель, но и может одновременно запускать чихательные рефлексы ^8,22. Кроме того, наблюдалась значительная межиндивидуальная вариабельность чувствительности к аэрозольным стимулам²⁶, а у подгруппы мышей вообще не наблюдалась реакция на кашель. Напротив, новая парадигма механической стимуляции, разработанная в этом исследовании, позволяет достичь стабильного поведения, похожего на кашель, обеспечивая при этом гибкую настройку стимулов с помощью взаимозаменяемых актуаторов. Аналогичным образом, обычные модели чихания, использующие аэрозольные агенты, страдают от низкой поведенческой специфичности, поскольку они часто вызывают коллатеральный кашель²², тем самым усложняя дифференциацию между этими различными дыхательными рефлексами.

В предыдущих исследованиях были созданы модели кашля и чихания у мышей с использованием капсаицина и дифференцированы на основе характеристик дыхательных паттернов (одиночных или двойных пиков), зарегистрированных при плетизмографии всего тела (WBP)⁸. Данные наших исследований показывают, что при индуцированном кашле паттерн дыхания с одним пиком составлял 77,55 ± 2,10% случаев, в то время как при чихающем поведении паттерн с одним пиком составлял 32,42 ± 5,88%. Эти результаты подтверждают, что метод классификации, основанный на паттернах дыхания WBP, эффективен в большинстве случаев, но имеет ограничения и не позволяет идеально дифференцировать эти два поведения. Кроме того, в некоторых исследованиях была предпринята попытка отличить кашель от чихания, используя продолжительность и частотные характеристики звуковых^{сигналов22}. Несмотря на то, что средняя продолжительность звуковых сигналов при чихании, как правило, больше, чем при кашле, между продолжительностями отдельных событий существует существенное перекрытие. Таким образом, использование длительности звука в качестве отличительного показателя может быть недостаточным для различения. Кроме того, спектральный анализ кашля и чихания не выявил четкой границы: легкий кашель может проявляться только в виде низкочастотных сигналов, в то время как энергичный кашель может производить звуки, включающие в себя значительные высокочастотные компоненты, со спектральными характеристиками, аналогичными характеристикам чихания. Примечательно, что кашлевые явления неизменно демонстрируют более высокую долю низкочастотной энергии. Напротив, соотношение высокочастотной и низкочастотной энергии (отношение энергии от высокой к низкой частоте) может обеспечить более различительную акустическую характеристику для различения поведения при кашле и чихании.

Наша инновация устраняет эти ограничения за счет пространственно ограниченной механической стимуляции. Усовершенствованная поведенческая модель демонстрирует двойные преимущества: (1) миллиметровая точность в стабилизированных зондах с применением стимула и (2) повышенная поведенческая специфичность. Кроме того, наш обширный анализ акустики кашля и чихания показывает, что эти модели поведения демонстрируют различные профили интенсивности звука со статистически значимыми различиями в соотношении энергии высоких и низких частот. Кроме того, наш всесторонний акустический анализ кашля и чихания выявляет отличительные профили интенсивности звука между этими моделями поведения, сопровождающиеся статистически значимыми различиями в их соотношении энергии высоких и низких частот. Кроме того, этот метод классификации также применим в акустических записях кашля и чихания, вызванных распылением капсаицина. В совокупности эти акустические параметры позволили разработать многомерное пространство признаков, которое устанавливает объективный, поддающийся количественной оценке стандарт для дифференциации кашля и чихания. Результат устанавливает хороший стандарт для исследования механизмов защиты воздушных путей с уменьшением искажающих факторов и улучшенной воспроизводимостью. Это не только решает давние проблемы в исследованиях дыхательных рефлексов, но и открывает возможности для точных исследований нейромодуляции нейронных цепей кашля и чихания.

Хотя этот метод эффективно вызывает кашель и чихание у мышей, он все же имеет некоторые ограничения. По сравнению с индукцией небулайзера, хирургическое вмешательство может нанести некоторую травму мышам, хотя мы стремимся свести к минимуму ущерб во время процедуры. Тем не менее, операция все еще может стабильно вызывать кашель и чихание, что указывает на то, что сама операция не снижает чувствительность мышей к этим раздражителям. Технические проблемы также возникли при поведенческом фенотипировании. Точность акустического сигнала требовала точной калибровки расположения микрофона от объекта съемки, чтобы сбалансировать соотношение сигнал/шум, избегая при этом амплитудного насыщения. Кроме того, интеграция катетеров для доставки стимулов с камерами плетизмографии всего тела (WBP) потребовала специализированных конструкций: катетер должен выходить из верхней части камеры, не препятствуя естественным движениям мыши или доставке стимула. Таким образом, несмотря на ограничения хирургического метода, он обеспечивает эффективное средство стабильного индуцирования кашля и чихания у мышей, а с помощью тщательно разработанного экспериментального процесса травмирование мыши может быть сведено к минимуму, чтобы обеспечить точный сбор поведенческих данных.

В заключение, благодаря этим тонким хирургическим манипуляциям и тщательному экспериментальному планированию, мы создали модель, которая стабильно вызывает кашель и чихание у мышей, обеспечивая надежную экспериментальную основу для дальнейшего изучения этих двух респираторных рефлекторных рефлекторов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нейлоновая нить 0,25 мм			https://item.taobao.com/item.htm?app =weixin& bc_fl_src=share-1041234389 826863-2-1& bxsign=scdVy4Xlh07ZND yojKnPqZ8vQnR_0pjarQFoQH9h636l au-W1sONf-RPbGobT6VinB8J0CrFC xRXoB-tghl13JMFQh3DrBLpqflgMRg DY2repq1fcQGIoPm4AuDfQSUQXE p& cpp=1& h5_spm=a-tb-item.b-tb-ite m& id=595514372480& share_crt_ v=1& shareurl=true& short_name=h .hIi5xvPc8rHTjez& sp_tk=eDdVczR SSG1vODU%3D& spm=A2159R.13 376460.0.0& tbSocialPopKey=shar eItem& tk=x7Us4RHmo85& un=B3 859EAB62ef44248BD7BAB98FFEB2 63& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9EYy wWWkDAI%2FaThaoYLYt_2164 6297_1755074424775.TaoPassw ord-WeiXin.1& wxsign=tbwr_qqSc esj7OBC_MTN-urBRm3r6GFm9t SERXxmOXNfgDGI3usP8mgVRu QmtuQ3LRrt9OkMGFP3XV55Hpp DzZZUQ4jUaki80cL79BKkrc85YE 5VYZfdiqppGkhao6kzkKF& x-ssr=истинно
Игла 28G			https://item.taobao.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-1041 234389566731-2-1& bxsign=scdfvM o7l21o6H5xXAgtKjf4TGT54QtHpk ED6yQRvvPvkGUKWiNyteUooM8e 6wcMmSKQpRsUCHjVo1q6Cliyp61 S3Nr1VadjTYKEJ1_SxSFZln_zI-0U omdKkkegvM6O5Rr& cpp=1& h5_sp m=a-tb-предмет.b-tb-предмет& id=670272 286239& share_crt _v=1& shareurl=true& short_name= h.hIiUFWFOj35n1LJ& sp_tk=eHFJ QTRSSE9xZDc%3D& SPM=A2159 R.13376460.0.0& tbSocialPopKey= shareItem& tk=xqIA4RHOqd7& UN =B3859EAB62ef44248BD7BAB98FF EB263& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt_2 1646297_1755074424775.TaoPa ssword-WeiXin.1& wxsign=tbwwJc wF20yLPkLax6kR7BPCJ3uPXx_ KPLTBjHUIph1nmN96mu0vYRC 0-DQxpG6mWPKWPZwSElseb HTR6nMzL7zthSG_67CIodTi_3i bFk7SKNFmbLeg1MVSDl9YzKs axPI& x-ssr=истинно
2-метил-2-бутанол	Сигма-Олдрич	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Для ультразвуковой записи
Стереотаксический инжектор мозга	Задний привод	68801
Капсаицин	MCE	HY-10448
Электронный баланс	Шанхай Чжоцзин	BSM-220.4
GraphPad Prism	GraphPadSoftware		Используется для графов и анализа данных
Система высокоскоростной камеры	Filr	20102748
Йодофор	ЛИРКОН		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Микроинжекторный насос	XIMAINANOTECH	XMSP-C
Моделирование глины			https://detail.tmall.com/item.htm? app=weixin& bc_fl_src=share-10 4123498598066-2-1& bxsign=s cdTRuE_YDJUf3ImFGBBqpft8S OgQqVocuYNmXEUcLyxiJX85R eVH8uZxdnVBKeXGONiCQ_Fc UDXoNcDga8mP3sClXi1CKRn R6SHFSitGVUGOFOA7eGoZT 38cLXHb8wUW-S& cpp=1& h5_ spm=a-tb-item.b-tb-item& id=61 1429671875& Share _crt_v=1& shareurl=true& short _name=h.hs0LTq88ockDBN6& sp_tk=cldZNjRSREhKUDU%3 D& spm=A2159R.13376460.0.0 & tbSocialPopKey=shareItem& tk=rWY64RDHJP5& un=B385 9EAB62ef44248BD7BAB98FfeB 263& un_site=0& ut_sk=1.ZZv9 EYywWWkDAI%2FaThaoYLYt _21646297_1755091386528.T aoPassword-WeiXin.1& wxsign =tbwPFmvLRyYmleaKSyVP7W t1XJnfAXUas_u1d5JJPUA91z9 4BTPKze3BbE2bNJHvC4-agGF ARD4JFW0c8hjdn7Z1Mfk1qgIZ VJ2SaGNFy8b809h3okigHQkp8 LhDopd5-VF& x-ssr=true
Небулайзер	ЮВЕЛЛ	M105	Для атомизации капсаицина
PE Tubing	Задний привод	62323
Силиконовая трубка			https://item.taobao.com/item.htm? id=618505617112& pisk=gFrice1c WPu1u5K6Stm15sEF8l7d5cijiSK xMmhV8XlBXSntDD-EBYH2ux8Z Ty27ifBf5cUniWPn_S2fCxl4gScY WwI8CRij0_Uc2ge6-dJRw5xZ3p Wqex8NpV5Fxrz-0_CR2epE51n 4Mg0bwy8EFXkZ3m8NK2krnm k Z7jWnTxDWuCPq09XnnYxw_xu qLMksIm8q7n-ULYH-QCuZ72W nhX8Z0mPqY9DjTjoq0b1J0bq4A k5cCgtoXJh0xA0iaJbW0nvrQQhu QN-D0k4n8bR-tn-4xA2cQfKHqZ hzPf3-MWSpjm2En5hLag-nY44 7HxVGjhoT8yZsXkCkMVmK_4z q-OSaKccirl3lD1igu5Zm5PvfFJo aOzGS7w1IKlE-obgHT1yLKfuuo5 CB0fUuLW08vBK-cWa4gxVesglW 8U8O0ngpWb8XlVkIKbKQBDHRe 4RzM9XHPNgZdACRK9YXlVkIKb BhKUOj7vMOw& SPM=A21XTW.291 78619.0.0
Программное обеспечение Spike2	Spike2		Используется для анализа дыхательных следов и аудио
SpinView	Filr		Используется для высокоскоростной видеозаписи
Триброметанол	Сигма-Олдрич	T48402-100G
UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Программное обеспечение WBP admiad	TOW-INT-TECH		Используется для записи WBP
Система плетизмографии тела WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204