Быстрое обнаружение золотистого стафилококка и метициллин-резистентного золотистого стафилококка с помощью мультиплексной флуоресцентной ПЦР в реальном времени

Краткое содержание

В этом протоколе используется мультиплексная ПЦР в реальном времени с праймерами/зондами, нацеленными на SA-специфичные гены nuc и MRSA mecA. Это позволяет быстро (<1 ч) качественно обнаруживать нуклеиновые кислоты SA/MRSA в образцах мокроты человека, преодолевая ограничения методов, основанных на культивировании.

Аннотация

Золотистый стафилококк (S.aureus) является распространенным грамположительным патогеном человека, вызывающим внебольничные и внутрибольничные инфекции с различными клиническими проявлениями, начиная от местных поверхностных поражений и пищевых отравлений до смертельных системных инфекций. Открытие антибиотиков значительно снизило уровень смертности, но с тех пор проблема лекарственной устойчивости становится все более заметной. С момента первого выявления MRSA в 1960 году этот штамм стал глобальной угрозой общественному здравоохранению. MRSA является основным возбудителем внутрибольничных инфекций, способным вызывать различные тяжелые заболевания, такие как эндокардит, хронический остеомиелит, пневмония, гнойный артрит и бактериемия. Таким образом, быстрое и точное обнаружение S. aureus и его лекарственной устойчивости имеет решающее значение для руководства клиническим лечением.

Современные методы рутинного обнаружения S.aureus и MRSA имеют существенные ограничения. Традиционный метод бактериального культивирования, служащий «золотым стандартом» на протяжении десятилетий, может обеспечить окончательную идентификацию видов и результаты чувствительности к лекарствам, но этот процесс занимает от 48 до 72 часов. Кроме того, этот метод подвержен загрязнению и требует специализированного лабораторного оборудования и квалифицированных техников. Серологическое тестирование позволяет достичь неинвазивной диагностики путем обнаружения антител к S.aureus в сыворотке крови пациента, но оно не может отличить активные инфекции от перенесенных инфекций, а также не может идентифицировать лекарственно-устойчивые штаммы (такие как MRSA).

Данное исследование направлено на разработку нового мультиплексного метода обнаружения флуоресцентной ПЦР в реальном времени для преодоления вышеупомянутых ограничений. Этот метод позволяет разрабатывать специфические праймеры и флуоресцентные зонды TaqMan, нацеленные на видоспецифичный ген nuc S.aureus и ген mecA, опосредующий резистентность к метициллину, что позволяет одновременно амплифицировать и обнаруживать S.aureus и MRSA в одной реакционной системе. Эта технология значительно сокращает время обнаружения, обеспечивая быстрое, точное и экономичное решение для обнаружения S.aureus и MRSA. Этот инновационный подход значительно повышает эффективность клинической диагностики и способствует раннему внедрению таргетной антибиотикотерапии, внося важный вклад в борьбу с лекарственно-устойчивыми бактериальными инфекциями.

Введение

S. aureus является широко распространенным грамположительным условным возбудителем, колонизирующим слизистую оболочку носа здоровых лиц ^1,2. Когда иммунитет хозяина нарушен, это может вызвать местные кожные инфекции, инвазию глубоких тканей или системные заболевания (например, пневмонию, эндокардит, остеомиелит и бактериемию)³. Метициллин, полусинтетический пенициллин, был клинически применен для лечения инфекций, вызванных S. aureus, в 1959 году, а два года спустя MRSA появился в Великобритании, быстро распространившись в европейских странах, включая Данию, Францию и Швейцарию^. Устойчивость MRSA к β-лактамным антибиотикам не только усложняет клиническое лечение, но и значительно повышает риск инфекции⁵. Многочисленные факторы, включая неконтролируемую колонизацию/распространение, высокие затраты на профилактику и чрезмерное использование антибиотиков, в совокупности привели к повышению уровня инфицирования MRSA⁶. Благодаря быстрой передаче и сложным механизмам резистентности, инфекции MRSA связаны с высокими показателями летальности: в странах ЕС ежегодно регистрируется почти 150 000 случаев заболевания и >7 000 случаев смерти⁷. Согласно данным эпиднадзора CHINET, уровень инфицирования MRSA в Китае остается выше 30% в течение последних пяти^лет8. Высокий риск внутрибольничной перекрестной инфекции еще больше усиливает нагрузку на общественное здравоохранение и создает нагрузку на системы здравоохранения ^9,10. Таким образом, разработка эффективных и точных технологий быстрого обнаружения MRSA является клинически актуальной для достижения ранней диагностики, персонализированной терапии, снижения смертности и прерывания цепочек передачи.

Современные технологии детектирования S.aureus и MRSA охватывают множество областей, включая фенотипическое детектирование, геномное детектирование, транскриптомное детектирование, протеомное детектирование, технологию масс-спектрометрии и биоинформатический^{анализ.}

Фенотипические методы обнаружения, такие как метод дисковой диффузии (метод KB) и метод минимальной ингибирующей концентрации (метод MIC), рекомендуются в качестве «золотых стандартов» Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) и Европейским комитетом по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (EUCAST). Эти методы имеют преимущества в том, что они не нуждаются в специализированных приборах, широко используются для надзора за спектром резистентности и эпидемиологических исследований. Однако очевидны и их недостатки: длительные периоды культивирования (более 24 ч) и результаты метода KB для некоторых новых антибиотиков требуют валидации по значениям MIC, при этом результаты для штаммов breakpoint чувствительны к человеческому фактору^12,13.

Среди методов обнаружения на геномном уровне обычная ПЦР обладает характеристиками высокой чувствительности и высокой специфичности, что позволяет предварительно судить о резистентности и сокращать время эксперимента, с низкой стоимостью и высокой эффективностью. Но его ограничения заключаются в том, что он может обнаруживать только известные гены устойчивости и полагаться на специализированные^{инструменты.} Механизм микробной резистентности очень сложен, что делает крайне важным разработку технических методов, которые могут охватить неизвестные фенотипы устойчивости и обеспечить быструю идентификацию. Новая технология GoPhAST-R (Combined genotypic and phenotypic AST through RNA detection) определяет фенотипы резистентности, детектируя уровни экспрессии мРНК, что позволяет одновременно обнаруживать различные гены, связанные с резистентностью, у нескольких патогенов, сокращать время эксперимента и достигать точности 94-99% в сочетании с машинным^{обучением}.

Среди методов детекции на протеомного уровне метод латексной агглютинации PBP2a основан на связывании антиген-антитело, с простотой операции и быстрыми результатами, обладающим высокой специфичностью и чувствительностью к MRSA. Тем не менее, он не может дифференцировать различные виды стафилококков, а чувствительность обнаружения коммерческих наборов несколько снижается, что требует повторного тестирования после индукции оксациллином⁸.

Методы детектирования на основе MALDI-TOF MS, такие как метод DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), достигают оптимальных аналитических характеристик при 6-8 часах инкубации с коэффициентом обнаружения до 96,4%, а чувствительность и специфичность составляют 100%. Но стоимость высока, а ограниченное положение на целевой пластине затрудняет одновременное обнаружение сотен образцов^16,17.

Среди технологий биоинформатического анализа в сочетании с омиксными данными для прогнозирования резистентности технология полногеномного секвенирования выделяется своим высоким разрешением и всесторонними возможностями анализа информации. В сочетании с базами данных анализа генов резистентности, такими как Resfinder, он может анализировать, несут ли штаммы специфические гены резистентности, прогнозировать потенциал резистентности, обнаруживать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и ассоциированные с резистентностью генные мутанты, поддерживая при этом хранение и повторный^{анализ данных всего} генома. Тем не менее, этот метод требует работы специалистов с образованием в области биоинформатики, редко используется в ежедневном тестировании и обычно используется для эпидемиологического анализа или молекулярного надзора за патогенами^.

Вышеупомянутые методологии либо отличаются высокой стоимостью, либо отнимают много времени, либо все еще находятся на стадии исследований и разработок. С клинической точки зрения, существует острая потребность в решении, сочетающем «непосредственность» и «точность» - новая технология мультиплексной флуоресцентной ПЦР заполняет этот пробел путем одновременной амплификации генов nuc/mecA в одной пробирке, сокращая цикл обнаружения до 1 часа. Он точно устраняет разрыв во временном окне в традиционном процессе «экстренный скрининг - типирование резистентности», предоставляя более эффективный по времени инструмент молекулярной диагностики для профилактики и контроля внутрибольничных инфекций. Этот специфический ПЦР-анализ в основном используется для обнаружения образцов из дыхательных путей, типичным примером которых являются образцы мокроты. Он проявляет чувствительность 500 копий/мл и высокую специфичность, при этом не подвержен влиянию антибактериальных агентов. Благодаря этим благоприятным эксплуатационным характеристикам этот ПЦР-анализ имеет существенное прикладное значение для диагностики инфекций дыхательных путей и надзора за внутрибольничными инфекциями, вызванными MRSA.

Протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Народной больницы провинции Гуандун (Номер по этике: KY2025-510-01). Подробную информацию о материалах, использованных в этом исследовании (реактивы, химикаты, оборудование и программное обеспечение), можно найти в Таблице материалов.

1. Протокол сбора и хранения образцов

1. Критерии включения: За исключением материалов контроля качества, идентифицировать все собранные образцы как положительные образцы с использованием метода золотого стандарта (культурального анализа).
2. Сбор мокроты человека
   1. Соберите 1-3 мл глубоко кашляющей мокроты из нижних дыхательных путей пациентов с помощью стерильных пробирок для забора проб. Немедленно запечатайте пробирки и транспортируйте их для анализа. Немедленно обработайте образцы для тестирования.
3. Хранение образцов:
   1. Оперативно проанализируйте образцы, собранные с помощью вышеуказанного метода. Кратковременное хранение допустимо при соблюдении следующих условий:
      2-8 °C: ≤7 дня
      -20 °C ± 5 °C: ≤6 месяцев
      -70 °C ± 5 °C: ≤24 месяца
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании образцы мокроты не обрабатывались консервантами (такими как бульон BHI + глицерин и т.д.). После сбора их хранили в описанных выше условиях, при этом многократной заморозки и размораживания строго избегали. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания. Максимально допустимые циклы замерзания-оттаивания: ≤3.

2. Экстракция нуклеиновых кислот

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения.

1. Для предварительной обработки образца мокроты образец смешивают с 4% раствором NaOH в соотношении 1:4 (образец мокроты: 4% раствор NaOH) для разжижения вязких образцов мокроты и устранения мешающих примесей, затем тщательно проводят вихревую обработку (30 с) и инкубируют при комнатной температуре (22-25 °C) в течение 30 мин для достижения разжижения.
2. Приготовление реагентов для экстракции нуклеиновых кислот
   1. Достаньте из комплекта расфасованную 96-луночную пластину. Слегка поверните 96-луночную пластину, чтобы сконцентрировать реагенты и магнитные шарики на дне 96-луночной пластины.
   2. Осторожно сорвите уплотнительную пленку из алюминиевой фольги, избегая вибрации 96-луночной пластины, чтобы предотвратить выплескивание жидкости.
   3. В растворы столбца 1 и столбца 7 96-луночного планшета: Сначала добавьте 20 μL Proteinase K, затем добавьте 200-300 μL образца для экстракции.
3. Автоматизированная экстракция нуклеиновых кислот (метод на основе магнитных шариков)
   1. Поместите предварительно упакованный 96-луночный планшет с добавленными образцами в соответствующий слот автоматизированного прибора для экстракции нуклеиновых кислот.
   2. Следуйте процессу экстракции нуклеиновых кислот, как описано ниже.
      1. С помощью магнитной палочки на лабораторной камере перенесите магнитные шарики, адсорбированные нуклеиновой кислотой, в различные отверстия для реагентов.
      2. Используйте набор для перемешивания для быстрого и многократного перемешивания жидкости, чтобы жидкость и магнитные шарики смешивались равномерно.
      3. По мере того, как жидкие и магнитные шарики гармонично сочетаются, автоматизированная машина для экстракции нуклеиновых кислот проходит через последовательные стадии: лизис клеток, адсорбция нуклеиновых кислот (70 °C, 15 мин, 3 раза магнитная адсорбция), промывка (3 раза, каждый раз перемешивание в течение 2 мин, затем дважды проведение магнитной адсорбции (по 15 с) и элюирование (2 раза, каждый раз перемешивание в течение 5 мин). 3 раза магнитной адсорбции), в конечном итоге получает нуклеиновую кислоту высокой чистоты.
      4. Проверьте концентрацию и чистоту нуклеиновых кислот с помощью спектрофотометра. Объем образца нуклеиновой кислоты составлял 50 мкл, концентрация колебалась от 50 до 100 нг/мкл, а соотношение А260/А280 составляло 1,8 ± 0,2.
   3. После завершения программы непосредственно отсосите раствор элюирования, содержащий нуклеиновую кислоту, из столбцов 6 и 12 для последующего тестирования. При необходимости храните оставшиеся извлеченные образцы нуклеиновых кислот при температуре -20 °C для долгосрочного хранения и использования в будущем.

3. Количественное ПЦР Обнаружение нуклеиновых кислот S. aureus и нуклеиновых кислот MRSA

1. Приготовление реактивов для амплификации
   1. Извлеките из набора раствор для реакции амплификации нуклеиновых кислот и раствор для реакции nuc/mecA (ген-специфичные праймеры/зонд nuc для S. aureus и mecA для MRSA). После размораживания при 22-25 °C полностью осциллировать и равномерно перемешать, затем выполнить мгновенное центрифугирование (~6000 г, 15 с, 22-25 °C).
   2. В зависимости от количества образцов, подлежащих испытанию, N, готовят реагенты на основе общего количества N+2 (N – количество образцов, 2 – отрицательный и положительный контроль качества). Конкретные шаги заключаются в следующем:
      1. Приготовьте смесь реакционной системы (16 мкл раствора для реакции амплификации нуклеиновых кислот (буфер, dNTPs, ДНК-полимераза, фермент UDG) + 4 мкл nuc/mecA реакционный раствор (праймеры и зонды для детекции генов-мишеней nuc, mecA и внутреннего эталона GAPDH).
      2. Добавьте его в центрифужную пробирку соответствующего размера, полностью осциллируйте и равномерно перемешайте, а затем выполните мгновенное центрифугирование (~6000 г, 15 с, 22 °C-25 °C). Затем распределите по 20 мкл на пробирку в реакционные пробирки для ПЦР.
2. Добавьте нуклеиновую кислоту и контрольные образцы:
   1. В подготовленные выше реакционные пробирки ПЦР (20 мкл) соответственно добавляют 5 мкл нуклеиновой кислоты из испытуемых образцов, положительного контроля и отрицательного контроля, достигая конечного объема 25 мкл на пробирку.
   2. Плотно закупорьте пробирки и выполните мгновенное центрифугирование (~6000 × г, 15 с, 22-25 °C), а затем поместите пробирки в ПЦР-инструмент.
3. ПЦР-амплификация:
   1. Установите программу цикла следующим образом: Предварительная денатурация: 97 °C, 90 с, 1 цикл; следующие 2 этапа в течение 42 циклов: денатурация при 97 °C в течение 2 с и отжиг при 55 °C в течение 15 с.
   2. Установите следующие параметры детектирования флуоресцентного сигнала: используйте флуоресцентную маркировку генов nuc с помощью FAM; ВИК флуоресцентное мечение генов mecA ; и флуоресцентное мечение гена GAPDH методом CY5 в качестве внутреннего контроля набора. Собирайте данные при температуре 55 °C. По завершении реакции убедитесь, что данные сохранены для будущего анализа.
   3. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, специфичного для количественной ПЦР (SLAN 96P):
      1. Информация об образце: На схеме расположения луночных планшетов программного обеспечения пометьте типы образцов (например, положительный контроль, отрицательный контроль, неизвестный образец, внутренний эталонный ген и т. д.), соответствующие позициям загрузки образца.
      2. Размещение реакционных пробирок: Откройте крышку нагревательного модуля прибора, поместите внутрь герметичную ПЦР-пластину/пробирки, убедитесь, что они плотно прилегают к нагревательному модулю, и плотно закройте крышку модуля (во избежание температурной неравномерности)
      3. Запуск реакции: Убедившись в правильности настроек программы в программном обеспечении, нажмите кнопку «Запустить запуск » и запишите идентификатор эксперимента для дальнейшего использования.
      4. Остановка прогона и извлечение пробирок: После завершения работы программы подождите, пока температура нагревательного модуля упадет ниже 50 °C, затем откройте крышку, чтобы снять ПЦР-планшет/пробирки, и обращайтесь с образцами должным образом.
4. Анализ данных
   1. Перед анализом данных подтвердите три визуальных результата: 1) Кривые усиления всех образцов (включая внутренний контроль) показывают типичную S-образную форму, без плоских или аномально запаздывающих восходящих кривых; 2) Пороговая линия флуоресценции пересекает экспоненциальную фазу кривых, а значения Ct внутреннего контроля (например, GAPDH) находятся в пределах ≤ 38 циклов (коэффициент вариации < 5%); 3) Отрицательный/положительный контроль включается на протяжении всего эксперимента для мониторинга возможности загрязнения.
      1. Если эксперимент вышел из-под контроля, перепроверьте всю партию. Если образец демонстрирует аномальное усиление (например, нетипичную S-кривую или значение Ct в пределах критического диапазона), повторно проверьте этот конкретный образец.
   2. Вызовите экспериментальные данные в программном обеспечении, установите пороговое и базовое значение и рассчитайте значения Ct автоматически или вручную, поскольку прибор автоматически выбирает базовый порог. Установите окончательное положительное значение определения на уровне Ct ≤ 36; референсный диапазон для внутреннего референсного гена требует Ct ≤ 38. Подтвердите, что их кривые усиления демонстрируют характерные S-образные профили.

Результаты

Обнаружение S. aureus и MRSA с помощью количественной ПЦР
Основываясь на видоспецифичном гене nuc S. aureus и гене лекарственной устойчивости mecA MRSA, мы разработали праймеры и зонды, помеченные различными флуорофорами для обнаружения количественной ПЦР. Все результаты контроля качества в экспериментах с количественной ПЦР неизменно находились в пределах рекомендуемых пороговых значений, что подтверждает надежность результатов обнаружения (

Обсуждение

Точное и раннее выявление резистентности к метициллину имеет решающее значение для прогноза инфекций, вызванных S. aureus. Ранняя идентификация S. aureus и MRSA может уменьшить злоупотребление антибиотиками широкого спектра действия и снизить селективное давление, приводящее к возникновению и распространению бактериальной резистентности.

Традиционные фенотипические методы обнаружения, такие как дисковая диффузия цефокситина, требуют 18-24-час...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматизированный экстрактор нуклеиновых кислот	ДААН	Смарт 32	Для экстракции ДНК
BSC-1500IIA2-X	БИОБАЗА	СЕДА 20143222263	Шкаф биобезопасности
Электронная центрифуга	ВЕАЛТЕК		Центрифугируйте остатки жидкости со стенки пробирки
Набор для обнаружения генов лекарственной устойчивости Staphylococcus aureus к метициллину	БОЦЗЕ	ЗК-ХХ-38-2	Обнаружение генов резистентности к метициллину Staphylococcus aureus
Набор для экстракции нуклеиновых кислот	БОЦЗЕ	TQ-BG-001-96B	Экстракт нуклеиновой кислоты
SLAN Полностью автоматическая система медицинского ПЦР-анализа	ХУНШИ		Анализ данных
SLAN-96S Машина для ПЦР в реальном времени	ХУНШИ	СЛАН-96С	Флуоресцентная количественная ПЦР-амплификация
Thermo Scientific NanoDrop	Термо Сайентиал	НаноДроп Уан	Количественный анализ ДНК, РНК и белков
Сверхнизкотемпературные морозильники (DW-YL450)	МЕЛИНГ	СЕДА 20172220091	-20 °°; С для хранения реагентов
Вихрь-5	Килин-колокольчик		Для смешивания реагентов