Быстрое обнаружение золотистого стафилококка и метициллин-резистентного золотистого стафилококка с помощью мультиплексной флуоресцентной ПЦР в реальном времени

Краткое содержание

В этом протоколе используется мультиплексная ПЦР в реальном времени с праймерами/зондами, нацеленными на SA-специфичные гены nuc и MRSA mecA. Это позволяет быстро (<1 ч) качественно обнаруживать нуклеиновые кислоты SA/MRSA в образцах мокроты человека, преодолевая ограничения методов, основанных на культивировании.

Аннотация

Золотистый стафилококк (S.aureus) является распространенным грамположительным патогеном человека, вызывающим внебольничные и внутрибольничные инфекции с различными клиническими проявлениями, начиная от местных поверхностных поражений и пищевых отравлений до смертельных системных инфекций. Открытие антибиотиков значительно снизило уровень смертности, но с тех пор проблема лекарственной устойчивости становится все более заметной. С момента первого выявления MRSA в 1960 году этот штамм стал глобальной угрозой общественному здравоохранению. MRSA является основным возбудителем внутрибольничных инфекций, способным вызывать различные тяжелые заболевания, такие как эндокардит, хронический остеомиелит, пневмония, гнойный артрит и бактериемия. Таким образом, быстрое и точное обнаружение S. aureus и его лекарственной устойчивости имеет решающее значение для руководства клиническим лечением.

Современные методы рутинного обнаружения S.aureus и MRSA имеют существенные ограничения. Традиционный метод бактериального культивирования, служащий «золотым стандартом» на протяжении десятилетий, может обеспечить окончательную идентификацию видов и результаты чувствительности к лекарствам, но этот процесс занимает от 48 до 72 часов. Кроме того, этот метод подвержен загрязнению и требует специализированного лабораторного оборудования и квалифицированных техников. Серологическое тестирование позволяет достичь неинвазивной диагностики путем обнаружения антител к S.aureus в сыворотке крови пациента, но оно не может отличить активные инфекции от перенесенных инфекций, а также не может идентифицировать лекарственно-устойчивые штаммы (такие как MRSA).

Данное исследование направлено на разработку нового мультиплексного метода обнаружения флуоресцентной ПЦР в реальном времени для преодоления вышеупомянутых ограничений. Этот метод позволяет разрабатывать специфические праймеры и флуоресцентные зонды TaqMan, нацеленные на видоспецифичный ген nuc S.aureus и ген mecA, опосредующий резистентность к метициллину, что позволяет одновременно амплифицировать и обнаруживать S.aureus и MRSA в одной реакционной системе. Эта технология значительно сокращает время обнаружения, обеспечивая быстрое, точное и экономичное решение для обнаружения S.aureus и MRSA. Этот инновационный подход значительно повышает эффективность клинической диагностики и способствует раннему внедрению таргетной антибиотикотерапии, внося важный вклад в борьбу с лекарственно-устойчивыми бактериальными инфекциями.

Введение

S. aureus является широко распространенным грамположительным условным возбудителем, колонизирующим слизистую оболочку носа здоровых лиц ^1,2. Когда иммунитет хозяина нарушен, это может вызвать местные кожные инфекции, инвазию глубоких тканей или системные заболевания (например, пневмонию, эндокардит, остеомиелит и бактериемию)³. Метициллин, полусинтетический пенициллин, был клинически применен для лечения инфекций, вызванных S. aureus, в 1959 году, а два года спустя MRSA появился в Великобритании, быстро распространившись в европейских странах, ....

Протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Народной больницы провинции Гуандун (Номер по этике: KY2025-510-01). Подробную информацию о материалах, использованных в этом исследовании (реактивы, химикаты, оборудование и программное обеспечение), можно найти в Таблице материалов.

1. Протокол сбора и хранения образцов

1. Критерии включения: За исключением материалов контроля качества, идентифицировать все собранные образцы как положительные образцы с использованием метода золотого стандарта (культурального анализа).
2. Сбор мокроты человека
   1. С....

Результаты

Обнаружение S. aureus и MRSA с помощью количественной ПЦР
Основываясь на видоспецифичном гене nuc S. aureus и гене лекарственной устойчивости mecA MRSA, мы разработали праймеры и зонды, помеченные различными флуорофорами для обнаружения количественной ПЦР. Все результаты контроля качества в экспериментах с количественной ПЦР неизменно находились в пределах рекомендуемых пороговых значений, что подтверждает надежность результатов обнаружения (

Обсуждение

Точное и раннее выявление резистентности к метициллину имеет решающее значение для прогноза инфекций, вызванных S. aureus. Ранняя идентификация S. aureus и MRSA может уменьшить злоупотребление антибиотиками широкого спектра действия и снизить селективное давление, приводящее к возникновению и распространению бактериальной резистентности.

Традиционные фенотипические методы обнаружения, такие как дисковая диффузия цефокситина, требуют 18-24-час.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматизированный экстрактор нуклеиновых кислот	ДААН	Смарт 32	Для экстракции ДНК
BSC-1500IIA2-X	БИОБАЗА	СЕДА 20143222263	Шкаф биобезопасности
Электронная центрифуга	ВЕАЛТЕК		Центрифугируйте остатки жидкости со стенки пробирки
Набор для обнаружения генов лекарственной устойчивости Staphylococcus aureus к метициллину	БОЦЗЕ	ЗК-ХХ-38-2	Обнаружение генов резистентности к метициллину Staphylococcus aureus
Набор для экстракции нуклеиновых кислот	БОЦЗЕ	TQ-BG-001-96B	Экстракт нуклеиновой кислоты
SLAN Полностью автоматическая система медицинского ПЦР-анализа	ХУНШИ		Анализ данных
SLAN-96S Машина для ПЦР в реальном времени	ХУНШИ	СЛАН-96С	Флуоресцентная количественная ПЦР-амплификация
Thermo Scientific NanoDrop	Термо Сайентиал	НаноДроп Уан	Количественный анализ ДНК, РНК и белков
Сверхнизкотемпературные морозильники (DW-YL450)	МЕЛИНГ	СЕДА 20172220091	-20 °°; С для хранения реагентов
Вихрь-5	Килин-колокольчик		Для смешивания реагентов