Методическая статья

Оптимизированный анализ LIVE/DEAD в сочетании с проточной цитометрией для количественной оценки постстрессовой выживаемости в дрожжевых клетках

DOI:

10.3791/69005

⸱

29 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для количественной оценки постстрессовой выживаемости в образцах дрожжей. В анализе используются два флуоресцентных красителя, SYTO 9 и йодид пропидия (PI), для количественной оценки целостности плазматической мембраны. Он использует проточную цитометрию для получения количественных и воспроизводимых оценок живых, мертвых и поврежденных клеточных фракций для образцов после окислительного стресса.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка выживаемости является общей и важной задачей в исследованиях дрожжей. Окрашивание LIVE/DEAD на основе целостности плазматической мембраны обеспечивает быстрый и высокопроизводительный анализ выживаемости дрожжей в сочетании с проточной цитометрией. Тем не менее, изменения в буфере для окрашивания, концентрации красителя, времени инкубации и настройках проточной цитометрии могут повлиять на качество и воспроизводимость данных. Этот протокол представляет собой стандартизированный анализ LIVE/DEAD для количественной оценки постстрессовой выживаемости дрожжей с использованием проточной цитометрии. После обработки Candida glabrata, условно-патогенного дрожжевого патогена, различными дозами перекиси водорода, образцы после стресса окрашивали двухкомпонентным красителем LIVE/DEAD, состоящим из SYTO 9 и йодида пропидия (PI). Проточная цитометрия использовалась для различения популяций живых, поврежденных и мертвых клеток и количественной оценки их процентного содержания в каждом образце. Оценки выживаемости, основанные на проценте живой статистики, сравнивались с результатами измерения колониеобразующей единицы (КОЕ) на той же выборке. Эти два метода дали согласованные результаты для образцов, обработанных фиктивной и летальной дозой (1 М Н2О2). При сублетальной дозе 100 мМН2О2 SYTO 9/PI оценивал более высокую выживаемость, чем КОЕ, что отражает ключевое различие между ними, где представленный здесь протокол оценивает выживаемость клеток сразу после стресса, в то время как КОЕ количественно оценивает процент клеток, способных восстанавливаться и размножаться. Следовательно, этот протокол измеряет жизнеспособность на более ранней стадии процесса клеточной смерти. Таким образом, описанный здесь протокол представляет собой быструю и масштабируемую альтернативу КОЕ для количественной оценки постстрессовой выживаемости дрожжей. Его результаты предоставляют дополнительную информацию для КОЕ, оценивая выживаемость на более ранней стадии и различая мертвые и поврежденные клетки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подтип почковающихся дрожжей содержит множество важных биологических и биотехнологических моделей. Общей и важной задачей в исследованиях дрожжей является количественная оценка влияния генетических или экологических возмущений, включая стресс или медикаментозное лечение. Например, при промышленной ферментации производители должны следить за жизнеспособностью дрожжевых культур, чтобы обеспечить эффективность и качество процесса брожения 1,2. При изучении патогенных видов дрожжей измерение их выживаемости после стресса или противогрибкового лечения имеет решающее значение для понимания генетической и механистической основы признаков, связанных с инфекцией, таких как устойчивость к противогрибковым препаратам. Измерение выживаемости на катетерах и поверхностях также является важной задачей в клинических условиях3. Все эти разнообразные сценарии требуют количественных подходов, которые могут быстро и точно измерить результаты медикаментозного лечения и лечения стресса.

Существующие методы достижения вышеуказанной цели делятся на три основные категории в зависимости от того, что они измеряют. Первая категория измеряет клоногенность, или способность отдельных дрожжевых клеток образовывать одну колонию после стресса. Репрезентативным методом в этой категории является анализ колониеобразующей единицы (КОЕ). Вторая категория измеряет жизнеспособность, которая основана на обнаружении ферментативной активности в живых клетках. В качестве примера можно привести химические зонды, такие как красительFUN-1 4. Третья категория методов измерения целостности плазматической мембраны – необратимая потеря целостности плазматической мембраны считается «точкой невозврата» для клеточной гибели5. Примерами этой категории являются флуоресцентные красители, такие как йодид пропидия (PI).

В данной работе представлен оптимизированный анализ LIVE/DEAD в сочетании с проточной цитометрией для достижения быстрой и масштабируемой количественной оценки выживаемости дрожжей после стрессовой обработки. Этот анализ, основанный на мембранной проницаемости, быстрее, чем КОЕ, занимая 15-30 минут окрашивания по сравнению с 24-48 часами инкубации для формирования колоний. Кроме того, образцы, окрашенные ЖИВЫМ/МЕРТВЫМ красителем, могут быть легко проанализированы с помощью проточной цитометрии в дополнение к микроскопии, которая измеряет десятки тысяч клеток за несколько секунд и может легко обрабатывать 96-луночные образцы для высокопроизводительных анализов. В результате этот анализ является быстрым, количественным и масштабируемым. В этом протоколе двухкомпонентное окрашивание LIVE/DEAD, состоящее из SYTO 9 и PI, используется для достижения повышенной разрешающей способности. SYTO 9 маркирует все клетки, живые или мертвые, в то время как PI проникает только в клетки с поврежденными плазматическими мембранами 6,7. Таким образом, живые клетки накапливают только SYTO 9, в то время как мертвые клетки накапливают как SYTO 9, так и PI. Поскольку PI имеет более высокое сродство к нуклеиновой кислоте, чем SYTO 9, он конкурентно исключает последнюю в клетке8. Кроме того, эти два красителя образуют пару резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET), в которой излучение SYTO 9 поглощается PI в качестве его возбуждения. В результате мертвые клетки демонстрируют приглушенную зеленую и сильную красную флуоресценцию. Напротив, живые клетки проявляют ярко-зеленую флуоресценцию8. Эта разница позволяет лучше дифференцировать живые и мертвые клетки при наличии вариаций интенсивности флуоресценции в каждой группе.

С момента первоначального сообщения о его применении на дрожжах в 2004 году, использование SYTO 9/PI в исследованиях дрожжей было неравномерным и в значительной степени ограничивалось качественными оценками с использованием микроскопии 7,9,10,11,12,12,13,14,15. Основным ограничением его использования в качестве количественного анализа выживаемости дрожжей является отсутствие систематической характеристики и сравнения с широко используемыми методами, такими как КОЕ. В этом протоколе описывается стандартизированный анализ, включающий буфер для окрашивания, концентрацию красителя, время окрашивания и настройки проточной цитометрии, которые, как было установлено, минимизируют артефакты и дают воспроизводимые результаты при применении к C. glabrata и двум другим видам дрожжей16. Поскольку окрашивание SYTO 9/PI выявляет промежуточную «поврежденную» популяцию клеток, которые отличаются как от живых, так и от мертвых клеток по характеру окрашивания, оно может дополнить КОЕ, раскрывая более подробную информацию о влиянии лечения стресса на дрожжевые клетки, что потенциально открывает новые возможности для применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Применение напряжения перекиси водорода

  1. По крайней мере, за сутки до эксперимента инкуляндируйте ночную культуру C. glabrata из одной колонии на только что прорезанном планшете в 3 мл синтетической полной (SC) среды (1,7 г/л дрожжевого азотного основания, полная смесь аминокислот, 2% по сравнению с глюкозой, водой) и культивируйте ее, поместив стеклянную трубку в роликовый барабан, и выращивайте при 30 °C. В качестве альтернативы можно использовать орбитальный встряхиватель, поместив стеклянную трубку под наклоном и встряхнув культуру со скоростью 200 об/мин.
    1. На следующее утро измерьте оптическую плотность (OD600) ночной культуры и разбавьте ее свежей средой SC до наружного диаметра600 ~0,2 в общем объеме 10 мл. Дайте ему вырасти в течение двух удвоений, что занимает около 4 часов, чтобы достичь фазы среднего бревна (наружный диаметр600 ~ 1).
      ПРИМЕР: Если посев на ночь имеет наружный диаметр600 = 10, добавьте 200 мкл этой культуры к 9,8 мл среды SC.
  2. В течение 30 минут до обработки напряжения приготовьте среду для снятия напряжения перекисью водорода. Последовательно разбавляйте перекись водорода из 30%-ной массы (9,798 М) в синтетическую полную среду (SC) до желаемой концентрации. Включите имитацию лечения (СК без добавления перекиси водорода) и смертельную дозу (1 М подходит для C. glabrata).
    ПРИМЕР: Чтобы получить стрессовую среду из перекиси водорода 100 мМ, добавьте 10,3 мкл из 9,798 М перекиси водорода в 1 мл SC. Аккуратно перемешайте пипеткой. Чтобы получить стрессовую среду с пероксидом водорода 10 мМ, разбавьте 500 мкл из 100 мМ стрессовой среды перекиси водорода в 4,5 мл SC.
  3. Измерьте внешний диаметр600 культуры среднего логарифма и стандартизируйте его, например, до600 = 1, добавив среды SC.
    ПРИМЕР: Язык и региональные параметры среднего логарифма находятся на уровне OD600 = 1,2. Добавьте 0,2 мл среды SC на 1 мл культуры.
  4. Перекачайте 600 мкл среднелогарифмической культуры для каждого условия испытания в планшет для глубоких лунок 96. Грануляционные ячейки методом центрифугирования при давлении 3 000 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации, не нарушая клеточную гранулу.
  5. Добавьте 600 μл имитации или перекиси водорода стрессовой среды, приготовленной на шаге 1.2, в каждую лунку и аккуратно пипетируйте для ресуспендирования клеток.
  6. Инкубировать планшет в течение 120 минут при 30 °C с встряхиванием при 300 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от интересующего нас биологического вопроса.

2. Нанесение красителя SYTO 9/PI

  1. Перед экспериментом приготовьте не менее 10 мл стерильного 0,85% физиологического буфера.
    Примечание: Мы обнаружили 0,85% солевой буфер для получения минимальных артефактов окрашивания, т.е. неокрашенных и мертвых клеток в образцах, обработанных под имитацией, по сравнению с деионизированной водой или питательной средой16.
  2. Приготовьте раствор рабочего состава ПИ в дозе 0,2 мМ с использованием стерильной, деионизированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий запас PI может храниться до 6 месяцев при температуре 4 °C.
  3. Непосредственно перед экспериментом приготовьте рабочий стоковый раствор SYTO 9 при концентрации 33,4 мкМ со стерильной, деионизированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготавливайте рабочую массу SYTO 9 в свежем виде для каждого эксперимента. Не храните и не используйте повторно.
  4. Аккуратно пипеткой перемешайте клетки в каждой лунке из лечебной пластины. Измерьте внешний диаметр600 для каждого условия обработки и рассчитайте количество буфера, необходимого для ресуспендирования клеток до внешнего диаметра600 из 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальные пипетки можно использовать для эффективного и равномерного смешивания. Избегайте перемешивания образцов.
  5. Соберите дрожжевые клетки после имитации или стрессовой обработки центрифугированием при 3 000 x g в течение 5 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации. Ресуспендируйте клетки в стерильном 0,85% физиологическом буфере до наружного диаметра600 = 1 (рассчитано на шаге 2.4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте многоканальную пипетку для ресуспендирования клеток. Обращайтесь со всеми культурами после обработки с осторожностью и избегайте чрезмерного смешивания.
  6. Зарезервируйте 50 μл каждого образца для использования в качестве контроля окрашивания без окрашивания и окрашивания одним красителем.
    Примечание: Минимальная автофлуоресценция была обнаружена для дикого типа C. glabrata в обоих каналах для SYTO 9 и PI. Тем не менее, всегда проверяйте неокрашенные образцы на автофлуоресценцию и выполняйте надлежащее фоновое вычитание или используйте питательные среды с низкой автофлуоресценцией.
  7. Аликвоту 16 мкл образца после обработки ресуспендировали в 0,85% физиологическом буфере в ПЦР-пробирку объемом 50 мкл. Добавьте 2 мкл из 0,2 мМ рабочего состава PI в клеточную суспензию. Затем добавьте 2 мкл из 33,4 мкМ рабочего состава SYTO 9 в ту же пробирку до конечного объема 20 мкл.
    1. Конечные концентрации PI и SYTO 9 составят 20 мкМ и 3,34 мкМ соответственно. Аккуратно перемешайте пипеткой и инкубируйте в течение 30 минут в темноте (можно использовать черный ящик) при комнатной температуре.

3. Настройка и калибровка проточного цитометра

ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует делать при каждом новом приборе, а также при новых применениях окрашивания SYTO 9/PI, в том числе для другого вида/штамма, нового стрессора или протокола роста и т.д. Приведенные ниже настройки были разработаны на проточном цитометре Attune NxT. Обратитесь к руководству пользователя используемого прибора для получения конкретных инструкций.

  1. Выберите подходящие флуоресцентные каналы/фильтры для проточного цитометра: полосовой фильтр с длиной волны 530 нм ± 30 нм (BL1) и фильтр длиной 600 нм (> 600 нм, BL3) использовались для сбора сигналов в зеленом (SYTO 9) и красном (PI и SYTO 9) каналах. Оба были возбуждены синим лазером с длиной волны 488 нм.
  2. Установите скорость потока на 200 μл/мин и остановитесь, когда будет собрано не менее 30 000 событий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество событий на выборку может быть скорректировано с целью получения надежных оценок процентов. Выборки со слишком малым количеством событий (ячеек) должны быть исключены. Следующим шагом является регулировка напряжений на каналах FSC и SSC во время первоначальной настройки.
  3. Разведите 16 мкл неокрашенного образца, обработанного под мышкой, в 200 мкл стерильного 0,85% физиологического буфера. Аккуратно пипеткой перемешать непосредственно перед проточной цитометрией. Запустите этот пример и отрегулируйте напряжения каналов FSC и SSC так, чтобы население находилось в центре FSC по сравнению с . График плотности SSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение 345 мВ и 399 мВ использовалось для FSC и SSC соответственно. Следующими шагами являются регулировка напряжения на каналах сбора (BL1 и BL3) во время первоначальной настройки.
  4. Смешайте 24 мкл образца, обработанного искусственно обработанным, с 24 мкл образца объемом 1000 мМ, обработанного перекисью водорода или термически убитым.
  5. Разделите смешанный образец живых и мертвых клеток на три пробирки по 16 мкл каждая. Окрасьте три пробирки (1) 2 мкл SYTO 9 и 2 мкл воды на 30 минут; (2) 2 μL PI и 2 μL воды в течение 30 минут; (3) 2 мкл SYTO 9 и 2 мкл PI в течение 30 мин. Следуйте протоколу окрашивания, описанному в предыдущем разделе.
    1. После инкубации добавьте в каждую пробирку 200 мкл стерильного 0,85% физиологического буфера. Теперь они готовы к проточной цитометрии.
  6. Пусковая трубка (1) для регулировки напряжения зеленого флуоресцентного канала (BL1); затем проложите трубку (2) для регулировки напряжения красной флуоресценции (BL3). Цель состоит в том, чтобы мода распределения интенсивности каждого канала была ~104-10 5 , чтобы использовать полный динамический диапазон прибора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, следуйте инструкциям вашего конкретного проточного цитометра при регулировке напряжения. Некоторые проточные цитометры имеют фиксированное напряжение, и этот этап не учитывается.
  7. Проведите через трубку (3), чтобы проверить, хорошо ли разделены популяции живых и мертвых клеток. При необходимости отрегулируйте напряжение канала BL1 или BL3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение 200 мВ использовалось для каналов BL1 и BL3 на Attune NxT.
  8. Запустите обработанный, неокрашенный образец при установленных настройках напряжения, чтобы убедиться, что образец имеет минимальную автофлуоресценцию в интересующих каналах (<102).

4. Запуск образцов на проточном цитометре

  1. Примените установленные выше настройки проточного цитометра и сначала запустите неокрашенный образец, чтобы убедиться, что сигналы автофлуоресценции ниже 10:2 как в каналах BL1, так и в канале BL3.
  2. Добавьте 200 мкл 0,85% физиологического буфера к каждому окрашенному образцу и запустите его на проточном цитометре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализируется несколько образцов, распределите стадию окрашивания таким образом, чтобы каждый образец окрашивался в течение 30 минут перед запуском на проточный цитометр.
  3. Экспортируйте выходные данные проточной цитометрии в виде файлов .fcs (стандарт FCS 3.0 или 3.1).

5. Анализ данных в R

ПРИМЕЧАНИЕ: Пример сценария анализа представлен в виде дополнительного файла 1. Примеры стратегий стробирования приведены в разделе «Репрезентативные результаты».

  1. Установите и загрузите необходимые пакеты: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Импортируйте файлы .fcs в текущую среду R.
  3. Настройте имена файлов и укажите условия лечения.
  4. Построение 2D графика плотности для всех событий на FSC. H против SSC.H. Используйте полигональный вентиль для исключения событий, не относящихся к ячейкам. Назовите этот вентиль "cells".
    ПРИМЕЧАНИЕ: На некоторых проточных цитометрах рекомендуется использовать параметр Площадь над параметром Высота. Ознакомьтесь с рекомендациями для конкретного прибора.
  5. Для "ячеечных" забитых популяций построим 2D график плотности на FSC. H против FSC.W. Как правило, видны два кластера с одинаковыми диапазонами FSC. H, но другой FSC.W. Кластер с более низким средним FSC. Уровень W содержит одиночные ячейки («синглеты»). Нарисуйте многоугольные ворота, чтобы выбрать их, и назовите ворота «синглетами».
  6. Для закрытой популяции "синглетов" постройте 2D график плотности на BL1. H против BL3.H. Нарисовать полигональные вентили для живых, повреждённых и мёртвых популяций на основе элементов управления живыми и мёртвыми клетками. Пример приведен в разделе «Репрезентативные результаты».
  7. Определите выживаемость, используя процентное соотношение каждой популяции, и экспортируйте статистику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Окрашивание SYTO 9/PI отличает живые дрожжевые клетки от мертвых на основе их сигналов флуоресценции в зеленом (500-560 нм) и красном (>600 нм) каналах. Живые клетки, которые накапливают только SYTO 9, сильно флуоресцируют в зеленом канале с минимальным количеством красных сигналов. Мертвые клетки накапливают как SYTO 9, так и PI и, как ожидается, будут сильно флуоресцировать в красном канале, с более низкими зелеными флуоресцентными сигналами по сравнени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает анализ ЖИВОЙ/МЕРТВЫЙ с использованием двух флуоресцентных красителей, SYTO 9 и PI, и с использованием проточной цитометрии для количественной оценки постстрессовой выживаемости дрожжей. Несмотря на то, что эти два красителя применялись для оценки выживаемости у различных видов дрожжей в литературе и доступны в виде коммерческого набора, ни руководство производителя, ни литература не содержат достаточных подробностей о протоколе окрашиванияили нас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов отсутствует конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить доктора Майкла Дейли и Центр визуализации Карвера за их обучение и поддержку микроскопии. Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних сотрудников Лаборатории генной регуляции за бесценные отзывы о протоколе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96-колодцевая глубокая скважинная плитаТермо Фишер278606NUNC 96
Цитометр потока Attune NxT с считывателем пластинТермо Фишер A24858A24858Автосэмплер (A42901)
Candida glabrataCG99, лабораторный штамм, полученный из клинического изолята (Cormack & Фалков, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD KitТермо Фишер A24858L34952Содержит SYTO 9 (3,34 мм) и йодид пропидия (20 мм). Эти два компонента также можно приобрести отдельно у разных поставщиков.
Перекись водородаСигма ОлдричH1009
Конфокальный микроскоп Leica SP8LeicaTCS SP8 X
Хлорид натрияСигма ОлдричS9888Используется для изготовления стерилизированного раствора NaCl 0,85%
Дрожжевое азотное основание без аминокислотСигма ОлдричY0626используется для изготовления синтетической полной среды с 2% смесью глюкозы и аминокислот

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lourens-Hattingh, A., Viljoen, B. Growth and survival of a probiotic yeast in dairy products. Food Res Int. 34 (9), 791-796 (2001).
  2. Qiu, X., et al. Stress tolerance phenotype of industrial yeast: industrial cases, cellular changes, and improvement strategies. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (16), 6449-6462 (2019).
  3. Welsh, R., et al. Survival, persistence, and isolation of the emerging multidrugresistant pathogenic yeast Candida auris on a plastic health care surface. J Clin Microbiol. 55 (10), 2996-3005 (2017).
  4. Millard, P. J., Roth, B. L., Thi, H. P., Yue, S. T., Haugland, R. P. Development of the FUN1 family of fluorescent probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl Environ Microbiol. 63 (7), 2897-2905 (1997).
  5. WlochSalamon, D. M., Bem, A. E. Types of cell death and methods of their detection in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Appl Microbiol. 114 (2), 287-298 (2013).
  6. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD BacLight: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. J. Microbiol. Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  7. Zhang, T., Fang, H. H. P. Quantification of Saccharomyces cerevisiae viability using BacLight. Biotechnol Lett. 26 (12), 989-992 (2004).
  8. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry A. 61A (2), 189-195 (2004).
  9. Sun, S., Baryshnikova, A., Brandt, N., Gresham, D. Genetic interaction profiles of regulatory kinases differ between environmental conditions and cellular states. Mol Syst Biol. 16 (5), e9167(2020).
  10. Li, Z., et al. Allicin shows antifungal efficacy against Cryptococcus neoformans by blocking the fungal cell membrane. Front Microbiol. 13, 1012516(2022).
  11. Jin, Y., Zhang, T., Samaranayake, Y., Fang, H. H. P., Yip, H. K., Samaranayake, L. P. The use of new probes and stains for improved assessment of cell viability and extracellular polymeric substances in Candida albicans biofilms. Mycopathologia. 159 (3), 353-360 (2005).
  12. Bojsen, R., Regenberg, B., Folkesson, A. Saccharomyces cerevisiae biofilm tolerance towards systemic antifungals depends on growth phase. BMC Microbiol. 14, 305(2014).
  13. Ryan, L. K., et al. Activity of potent and selective host defense peptide mimetics in mouse models of oral candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 58 (7), 3820-3827 (2014).
  14. Chudzik, B., Koselski, M., Czuryło, A., Trębacz, K., Gagoś, M. A new look at the antibiotic amphotericin B effect on Candida albicans plasma membrane permeability and cell viability functions. Eur. Biophys. J. (EBJ). 44 (1-2), 77-90 (2015).
  15. Roscetto, E., Contursi, P., Vollaro, A., Fusco, S., Notomista, E., Catania, M. R. Antifungal and antibiofilm activity of the first cryptic antimicrobial peptide from an archaeal protein against Candida spp. clinical isolates. Sci Rep. 8 (1), 17570(2018).
  16. Tang, H., Liang, J., He, B. Z. An optimized LIVE/DEAD assay using flow cytometry to quantify poststress and antifungaltreatment survival in diverse yeasts. BioRiv. , (2025).
  17. Stiefel, P., SchmidtEmrich, S., ManiuraWeber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol. 15 (1), 36(2015).
  18. Rego, A., Ribeiro, A., CôrteReal, M., Chaves, S. Monitoring yeast regulated cell death: Trespassing the point of no return to loss of plasma membrane integrity. Apoptosis. 27 (9), 778-786 (2022).
  19. CarmonaGutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  20. Miller, J., et al. Using colony size to measure fitness in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 17 (10), e0271709(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Candida glabrataSYTO 9

Похожие статьи