В данном исследовании оптимизируется метод экстракции РНК с использованием горячего фенола для Mycobacteriumв результате чего была получена высококачественная РНК, пригодная для транскриптомного анализа. При сравнении с методами TRIzol и RNeasy в идентичных условиях данный метод обеспечил более высокий выход, сопоставимую целостность и повышенную экономическую эффективность, что делает его практичной альтернативой для крупномасштабных исследований экспрессии генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированная экстракция РНК из микобактерий на основе горячего фенола: надежный подход для достоверного анализа экспрессии генов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) остается серьезной глобальной угрозой для здравоохранения, что подчеркивает необходимость в надежных транскриптомных исследованиях для понимания биологии этого микроорганизма и механизмов его лекарственной устойчивости. Такие анализы зависят от получения высококачественной РНК с высоким выходом. Хотя доступно несколько методов экстракции РНК, многие из них требуют дорогостоящих реагентов, больших объемов культур или специализированного оборудования, что ограничивает их применимость для крупномасштабных исследований, особенно в условиях ограниченных ресурсов. В данной работе представлен оптимизированный метод экстракции РНК на основе горячего фенола, специально адаптированный для микобактерий. Метод использует минимальный объем культуры и общедоступные реагенты для стабильного получения высококачественной РНК, подходящей для высокопроизводительных транскриптомных приложений. Количество и целостность РНК оценивали с помощью гель-электрофореза и анализа целостности РНК (RIN), а пригодность для последующих приложений подтверждали с помощью qPCR и Qubit 4. Для оценки эффективности оптимизированного метода была проведена параллельная экстракция РНК с использованием TRIzol и RNeasy при идентичных экспериментальных условиях, включая те же виды Mycobacterium, объемы культур, фазы роста (логарифмическую и стационарную) и условия лизиса. Это позволило провести прямое сравнение выхода, качества, осуществимости и стоимости. Оптимизированный метод с горячим фенолом продемонстрировал сопоставимый или улучшенный выход и качество РНК, при этом значительно снизив стоимость реагентов и зависимость от специализированного оборудования. Благодаря своей эффективности, воспроизводимости и доступности, данный протокол представляет собой практическую альтернативу для крупномасштабных исследований экспрессии генов и транскриптомики Mtb и других видов микобактерий.
Введение
M. tuberculosis (Mtb), возбудитель туберкулеза (ТБ), остается ведущей причиной смерти от одного инфекционного патогена, опережая ВИЧ/СПИД. В 2024 году ТБ стал причиной примерно 1,3 миллиона смертей во всем мире1. Ситуация осложняется растущим распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Таким образом, существует острая необходимость в понимании молекулярных основ патогенеза ТБ и поиске новых терапевтических мишеней2.
Транскрипционный профилинг Mtb стал важным инструментом для выяснения функциональных элементов, участвующих в взаимодействиях между хозяином и патогеном3, адаптации к воздействию стрессовых факторов окружающей среды4 и механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости5. Современные методологии, такие как ПЦР в реальном времени, микрочиповый анализ и секвенирование РНК (RNA-seq), значительно расширили возможности анализа транскриптома микобактерий6. Однако успех этих методов в значительной степени зависит от наличия высококачественной РНК, что, в свою очередь, обусловлено эффективностью лизиса клеток при экстракции. Сложная структура клеточной стенки Mtb, состоящая из миколятов, арабиногалактана и пептидогликана, особенно затрудняет экстракцию РНК7. Существующие методы лизиса, включая ферментативный гидролиз8, соникацию9 и дезинтеграцию с помощью стеклянных или керамических бусин (bead-beating)10, часто требуют дорогостоящего оборудования и больших объемов культуры, что ограничивает их практическое применение во многих лабораториях уровня BSL-3. Кроме того, медленная скорость роста Mtb требует длительного культивирования для получения достаточной биомассы1.
Для преодоления этих ограничений был разработан оптимизированный, быстрый и экономичный метод экстракции РНК на основе горячего фенола. Используя всего 3 mL культуры в середине логарифмической фазы, данный метод позволяет получить 45–60 µg высококачественной РНК, подходящей для последующего транскриптомного анализа. Лизис клеток осуществляется с помощью компактного ручного гомогенизатора тканей и общедоступных реагентов, что избавляет от необходимости использования дорогостоящего оборудования. Хотя метод горячего фенола описывался ранее1,12, оптимизированный вариант метода горячего фенола повышает удобство, экономическую эффективность и выход РНК. Оптимизация проводилась с использованием M. smegmatis mc2155 (Msmeg) и была успешно валидирована на Mtb H37Rv.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Культивирование Mycobacterium
- Внесите 1 мл из глицеринового стока Msmeg или Mtb в 10 мл среды Middlebrook 7H9, дополненной 0,2% глицерином, 0,05% Tween 80 и 10% ADC, при 37 °C при перемешивании со скоростью 150 об/мин до достижения значения OD 1–1,5.
- Вырастите вторичную культуру, добавив 1% первичной культуры в 10 мл среды 7H9, до достижения середины логарифмической фазы роста (OD).600 нм = 0.6–0.7.
- Разделите культуры на аликвоты по 3 мл и центрифугируйте при 2000 x г в течение 5 мин при комнатной температуре (23–25 °C).
- Храните осадки при температуре -80 °C до экстракции РНК.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с культурами Mtb соблюдайте соответствующие правила безопасности уровня BSL3 и подвергайте осадок тепловой инактивации при 95 ˚C в течение 20–25 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 на блок-схеме представлены основные этапы экстракции РНК методом горячего фенола.
Рисунок 1: Схематическое представление метода горячего фенола и анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Экстракция РНК
- Метод горячего фенола (метод ГФ)
- Добавьте 200 µL TES-буфера (100 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 5 мМ ЭДТА, pH 8,0; 0,1 М NaCl; % SDS; 1% β-меркаптоэтанола) к клеточному осадку и ресуспендируйте осадок путем вортексирования.
- Добавьте к образцу примерно 0,1 г силикатных микросфер диаметром 0,1 мм. Используйте ручной гомогенизатор тканей в течение 10–15 с до полного размораживания осадка на льду. Повторите этот этап еще 2 раза, после каждого повторения подвергая образец шоковой заморозке в жидком азоте.
- ИЛИ Используйте высокоскоростной настольный гомогенизатор (bead ruptor) в течение 1 мин при настройке скорости 5 (5,0 м/с) при комнатной температуре. Повторите этот шаг в течение 3 циклов, инкубируя образец на льду после каждого цикла для предотвращения перегрева.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите лизис клеток Mtb в течение 6–8 циклов (по 1 мин каждый) с помощью ручного гомогенизатора тканей или бид-руптора, периодически охлаждая образец на льду после каждого цикла. Для приготовления всех буферов и реагентов, необходимых для экстракции РНК, используйте воду, обработанную DEPC (диэтилпирокарбонатом). - Добавьте дополнительный 200 µL буфера TES (предварительно нагретого до 65 °C) в каждую пробу, чтобы довести объем до 400 µLК каждому образцу добавьте 200 µL кислотного фенола (фенол, уравновешенный с 100 мМ цитратным буфером, pH 4,5) и 200 µL хлороформа (перед добавлением к образцу смешайте фенол с кислотой и хлороформом в равных пропорциях).
- Инкубируйте образец при 65 °C на нагревательном блоке с перемешиванием при 900 об/мин в течение 30 мин, затем центрифугировать при 12000 x г в течение 15 мин при комнатной температуре. Убедитесь в правильном разделении фаз после центрифугирования (должны наблюдаться прозрачная верхняя водная фаза, содержащая РНК, четко выраженный интерфейс с ДНК и нижняя органическая фаза, содержащая белки и липиды).
- Удалите верхний слой водной фазы и перенесите его в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Снова добавьте равный объем смеси кислого фенола и хлороформа. Центрифугируйте при 12 000 x г в течение 15 мин при комнатной температуре. Убедитесь в правильном разделении фаз.
- Перенесите верхний водный слой в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, затем добавьте 30 µL 3 М натрия ацетата буфера, pH 5,3, и 240 µL охлажденного изопропанола. Инкубировать при −80 °C в течение 30 мин – 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирку для микроцентрифуги можно хранить в течение ночи при температуре -80 °C На данном этапе загерметизируйте микроцентрифужную пробирку несколькими слоями парафильма, чтобы предотвратить ее открытие при 65 °C во время инкубации.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Фенол и хлороформ являются опасными химическими веществами, поэтому необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), средства инженерного контроля, такие как вытяжные шкафы, и соблюдать специальные процедуры по утилизации отходов. - Центрифугируйте при 12 000 x г в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь в образовании осадка и осторожно слейте супернатант, не повреждая осадок.
- Ресуспендируйте осадок в 1 мл 75% этанола и центрифугируйте при 12 000 x г в течение 1 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг дважды и высушите осадок на воздухе.
- Ресуспендируйте осадок в 50 µL воды, не содержащей нуклеаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворения РНК инкубируйте ее в воде, свободной от РНКаз, в течение 10–30 мин при комнатной температуре.
- Метод TRIzol
- Добавить 200 µL реагента TRIzol к клеточному осадку.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: TRIzol является опасным химическим веществом, поэтому необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), средства инженерного контроля, такие как вытяжные шкафы, и соблюдать специальные процедуры по утилизации отходов. - Следуйте методу лизиса клеток, описанному в этапах 2.1.2 – 2.1.3.
- Добавьте дополнительный 200 µL реагента TRIzol, после чего 200 µL хлороформа, затем перемешивайте на вортексе в течение 1 мин. Центрифугируйте при 13 400 x г в течение 15 мин при 4 °CУбедитесь в правильном разделении фаз после центрифугирования.
- Осторожно перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Осадите РНК, добавив 500 µL изопропанола в водную фазу и инкубирование при −80 °C в течение 30 мин – 1 ч.
- Осадите РНК путем центрифугирования при 15 000 x г в течение 20 мин при 4 °CВнимательно осмотрите осадок и удалите супернатант, не задевая осадок.
- Резуспендируйте осадок в 1 мл 75% этанола и центрифугируйте при 13 400 x г в течение 1 мин при 4 °CПовторите этот этап дважды, высушите осадок на воздухе в течение 30 мин при комнатной температуре и ресуспендируйте в 50 µL воды, свободной от нуклеаз.
- Добавить 200 µL реагента TRIzol к клеточному осадку.
- Метод выделения РНК с использованием имеющегося в продаже набора реагентов
- Ресуспендируйте осадок клеток в 200 µL буфера для ресуспендирования (входит в состав набора).
- Выполните метод лизиса клеток согласно этапам 2.1.2–2.1.3.
- Проведите последующий эксперимент в соответствии с инструкциями производителя.
3. Обработка ДНКазой, количественное определение и визуализация
- Для удаления контаминации геномной ДНК добавьте 1 µL DNase I (10units) и 5 µL буфера RDD (1x) в каждый образец РНК и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Оцените количество РНК в образце спектрофотометрически с помощью Nanodrop, а целостность РНК — с помощью Qubit4. Допустимое значение RIN составляет от 7,5 до 10. Допустимые значения A260/A280 и A260/A230 находятся в диапазоне 1,8–2,0 и 2,0–2,2 соответственно.
- Визуализируйте РНК в 1% агарозном геле, используя 1X краситель для нанесения РНК.
4. Синтез кДНК и количественная ПЦР в реальном времени
- Подготовьте реакционную смесь объемом 20 µL для синтеза кДНК, используя набор для обратной транскрипции кДНК и 1 µg РНК, следуя инструкциям производителя; проведите реакцию в термоциклере.
- Подготовьте реакционную смесь для ПЦР в реальном времени объемом 10 µL, используя 50 ng кДНК, 0.4 µM каждого праймера и SYBR в соответствии с инструкциями производителя. Проведите анализ образца на термоциклере для ПЦР в реальном времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа методом кПЦР использовались следующие праймеры:
Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'
5. Статистический анализ
- Выполните t-критерий Стьюдента для всех биологических повторностей с помощью программы Graph Pad Prism; значения P ≤ 0.05 считались статистически значимыми. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку как минимум трех биологических повторностей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Качество и выход РНК
Качество и количество РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле (Рисунок 2). Для всех методов экстракции наблюдались четкие, резкие полосы, соответствующие 23S и 16S рРНК, что подтверждает успешную изоляцию тотальной РНК. При использовании методов с горячим фенолом и TRIzol наблюдались три отчетливые полосы, соответствующие 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp) и 5S рРНК (~120 bp), что указывает на сохра...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для разработки простого и надежного метода экстракции РНК из Mycobacterium был оптимизирован метод горячего фенола. Впоследствии экстрагированная РНК была сравнена с двумя широко используемыми подходами: методом TRIzol и колоночным набором12,13. Эти методики сравнивались по выходу РНК, чистоте, целостности, стоимости и времени обработки для оценки их практичности при последующем молекулярном анализе. Методы горячего фенола и TRIzol, несмотря на их относи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликтов интересов между авторами отсутствовало. Все авторы одобрили подачу рукописи.
Благодарности
Я хотел бы выразить благодарность за поддержку Департаменту биотехнологий (DBT), Индийскому совету по медицинским исследованиям (ICMR) и Совету по исследованиям в области науки и техники (SERB).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| кремнеземные бусины диаметром 0,1 мм | MP Biomedicals | MP1691050 | |
| 2-пропанол | Sigma | 278475 | |
| Bead Ruptor 4 | Revvity | ||
| Хлороформ | Sigma | 288306 | |
| Охлаждаемая центрифуга | ThermoScientific | 42541217 | |
| ДНКаза I | QIAGEN | 79254 | |
| ЭДТА | сигма | E02SS | |
| HCl | СРЛ | 62889 | |
| Термоблок | MIULAB | MU-E02-1049 | |
| Набор для высокоэффективной обратной транскрипции в кДНК | Thermo Fischer Scientific | 4368814 | |
| Моторизированный гомогенизатор тканей G10 | Корона | G261608 | |
| NaCl | сигма | S586 | |
| Нанофотометр N50 | РЕАЛИЗАЦИЯ | T51601 | |
| фенол, уравновешенный 0,1 М цитратным буфером (pH 4,5) | Sigma | P4682 | |
| PowerUP SYBR | Applied Biosystems | A25742 | |
| Флуориметр Qubit 4 | Invitrogen | 2,32262E+12 | |
| Амплификатор для ПЦР в реальном времени | Analytik Jena AG | 844-00503-2 | |
| Набор RNeasy Kit | Qiagen | 74104 | |
| SDS (додецилсульфат натрия) | Sigma | S988 | |
| Ацетат натрия | Sigma | S289 | |
| амплификатор | Biorad | 621BR29739 | |
| Реагент TRI | Sigma | T9424 | |
| Трис-основание | Himedia | MB029 | |
| β-меркаптоэтанол | Sigma | 516732 |
Ссылки
- Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
- Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
- Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
- Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
- Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
- Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
- Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
- Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
- Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
- Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
- Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
- Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
- Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
- Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
- Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
