Методическая статья

Оптимизированная экстракция РНК из микобактерий на основе горячего фенола: надежный подход для достоверного анализа экспрессии генов

176 просмотров

⸱

11 сентября 2026 г.

 ,  ,  , 
1Amity Institute of Molecular Medicine and Stem Cell Research, Amity University Uttar Pradesh, 2Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании оптимизируется метод экстракции РНК с использованием горячего фенола для Mycobacteriumв результате чего была получена высококачественная РНК, пригодная для транскриптомного анализа. При сравнении с методами TRIzol и RNeasy в идентичных условиях данный метод обеспечил более высокий выход, сопоставимую целостность и повышенную экономическую эффективность, что делает его практичной альтернативой для крупномасштабных исследований экспрессии генов.

Аннотация

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) остается серьезной глобальной угрозой для здравоохранения, что подчеркивает необходимость в надежных транскриптомных исследованиях для понимания биологии этого микроорганизма и механизмов его лекарственной устойчивости. Такие анализы зависят от получения высококачественной РНК с высоким выходом. Хотя доступно несколько методов экстракции РНК, многие из них требуют дорогостоящих реагентов, больших объемов культур или специализированного оборудования, что ограничивает их применимость для крупномасштабных исследований, особенно в условиях ограниченных ресурсов. В данной работе представлен оптимизированный метод экстракции РНК на основе горячего фенола, специально адаптированный для микобактерий. Метод использует минимальный объем культуры и общедоступные реагенты для стабильного получения высококачественной РНК, подходящей для высокопроизводительных транскриптомных приложений. Количество и целостность РНК оценивали с помощью гель-электрофореза и анализа целостности РНК (RIN), а пригодность для последующих приложений подтверждали с помощью qPCR и Qubit 4. Для оценки эффективности оптимизированного метода была проведена параллельная экстракция РНК с использованием TRIzol и RNeasy при идентичных экспериментальных условиях, включая те же виды Mycobacterium, объемы культур, фазы роста (логарифмическую и стационарную) и условия лизиса. Это позволило провести прямое сравнение выхода, качества, осуществимости и стоимости. Оптимизированный метод с горячим фенолом продемонстрировал сопоставимый или улучшенный выход и качество РНК, при этом значительно снизив стоимость реагентов и зависимость от специализированного оборудования. Благодаря своей эффективности, воспроизводимости и доступности, данный протокол представляет собой практическую альтернативу для крупномасштабных исследований экспрессии генов и транскриптомики Mtb и других видов микобактерий.

Введение

M. tuberculosis (Mtb), возбудитель туберкулеза (ТБ), остается ведущей причиной смерти от одного инфекционного патогена, опережая ВИЧ/СПИД. В 2024 году ТБ стал причиной примерно 1,3 миллиона смертей во всем мире1. Ситуация осложняется растущим распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Таким образом, существует острая необходимость в понимании молекулярных основ патогенеза ТБ и поиске новых терапевтических мишеней2.

Транскрипционный профилинг Mtb стал важным инструментом для выяснения функциональных элементов, участвующих в взаимодействиях между хозяином и патогеном3, адаптации к воздействию стрессовых факторов окружающей среды4 и механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости5. Современные методологии, такие как ПЦР в реальном времени, микрочиповый анализ и секвенирование РНК (RNA-seq), значительно расширили возможности анализа транскриптома микобактерий6. Однако успех этих методов в значительной степени зависит от наличия высококачественной РНК, что, в свою очередь, обусловлено эффективностью лизиса клеток при экстракции. Сложная структура клеточной стенки Mtb, состоящая из миколятов, арабиногалактана и пептидогликана, особенно затрудняет экстракцию РНК7. Существующие методы лизиса, включая ферментативный гидролиз8, соникацию9 и дезинтеграцию с помощью стеклянных или керамических бусин (bead-beating)10, часто требуют дорогостоящего оборудования и больших объемов культуры, что ограничивает их практическое применение во многих лабораториях уровня BSL-3. Кроме того, медленная скорость роста Mtb требует длительного культивирования для получения достаточной биомассы1.

Для преодоления этих ограничений был разработан оптимизированный, быстрый и экономичный метод экстракции РНК на основе горячего фенола. Используя всего 3 mL культуры в середине логарифмической фазы, данный метод позволяет получить 45–60 µg высококачественной РНК, подходящей для последующего транскриптомного анализа. Лизис клеток осуществляется с помощью компактного ручного гомогенизатора тканей и общедоступных реагентов, что избавляет от необходимости использования дорогостоящего оборудования. Хотя метод горячего фенола описывался ранее1,12, оптимизированный вариант метода горячего фенола повышает удобство, экономическую эффективность и выход РНК. Оптимизация проводилась с использованием M. smegmatis mc2155 (Msmeg) и была успешно валидирована на Mtb H37Rv.

Протокол

Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культивирование Mycobacterium

  1. Внесите 1 мл из глицеринового стока Msmeg или Mtb в 10 мл среды Middlebrook 7H9, дополненной 0,2% глицерина, 0,05% Tween 80 и 10% ADC, при 37 °C при встряхивании со скоростью 150 об/мин до достижения значения OD 1–1,5.
  2. Вырастите вторичную культуру, добавив 1% первичной культуры в 10 мл среды 7H9, до достижения середины логарифмической фазы роста (OD)60 нм = 0.6–0.7.
  3. Разделите культуры на аликвоты по 3 мл и центрифугируйте при 200 x г в течение 5 мин при комнатной температуре (23–25 °C).
  4. Храните осадки при температуре -80 °C до экстракции РНК.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с культурами Mtb соблюдайте соответствующие правила уровня биобезопасности BSL3 и подвергайте осадок термической инактивации при температуре 95 ˚C в течение 20–25 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1 представлена блок-схема основных этапов экстракции РНК методом горячего фенола.

Схема экстракции РНК горячим фенолом; рабочий процесс включает центрифугирование, разделение фаз и анализ целостности РНК.
Рисунок 1: Схематическое представление метода горячего фенола и последующего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Экстракция РНК

  1. Метод с использованием горячего фенола (метод HP)
    1. Добавьте 200 µL буфера TES (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoethanol) к клеточному осадку и ресуспендируйте осадок с помощью вортекса.
    2. Добавьте в образец примерно 0,1 г силикатных бусин размером 0,1 mm. Используйте ручной гомогенизатор тканей в течение 10–15 с до полного размораживания осадка на льду. Повторите этот шаг еще 2 раза, после каждого повтора проводя мгновенное замораживание в жидком азоте.
    3. ИЛИ используйте высокоскоростной настольный дезинтегратор с бусинами в течение 1 мин при настройке скорости 5 (5,0 m/s) при комнатной температуре. Повторите этот шаг в течение 3 циклов и инкубируйте образец на льду после каждого цикла для предотвращения нагрева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите лизис клеток Mtb в течение 6–8 циклов (каждый цикл по 1 мин) либо с помощью ручного гомогенизатора тканей, либо дезинтегратора с бусинами, периодически охлаждая на льду после каждого цикла. Для приготовления всех буферов и реагентов, необходимых для экстракции РНК, используйте воду, обработанную DEPC (диэтилпирокарбонатом).
    4. Добавьте в каждый образец еще 20 µL буфера TES (предварительно нагретого до 65 °C), чтобы довести общий объем до 40 µL. В каждый образец добавьте 20 µL кислого фенола (фенол, уравновешенный 10 mM цитратным буфером, pH 4,5) и 20 µL хлороформа (перед добавлением в образец смешайте кислый фенол и хлороформ в равном соотношении).
    5. Инкубируйте образец при 65 °C на термоблоке с перемешиванием при 900 rpm в течение 30 мин и центрифугируйте при 120 x g в течение 15 мин при комнатной температуре. Убедитесь в правильном разделении фаз после центрифугирования (должны наблюдаться прозрачная верхняя водная фаза, содержащая РНК, четкая интерфаза с ДНК и нижняя органическая фаза, содержащая белки и липиды).
    6. Удалите верхний слой водной фазы и перенесите его в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL. Снова добавьте равный объем смеси кислого фенола и хлороформа. Центрифугируйте при 12,0 x g в течение 15 мин при комнатной температуре. Убедитесь в правильном разделении фаз.
    7. Перенесите верхний водный слой в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL, затем добавьте 30 µL 3 M ацетата натрия (pH 5,3) и 240 µL охлажденного изопропанола. Инкубируйте при −80 °C от 30 мин до 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе микроцентрифужную пробирку можно хранить в течение ночи при -80 °C. Плотно закройте микроцентрифужную пробирку несколькими слоями парафильма, чтобы предотвратить ее открытие при 65 °C во время инкубации.
      ОСТОРОЖНО: Фенол и хлороформ являются опасными химическими веществами; поэтому необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), инженерные средства контроля, такие как вытяжные шкафы, и соблюдать специальные процедуры утилизации отходов.
    8. Центрифугируйте при 12,0 x g в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь в образовании осадка и осторожно удалите супернатант, не задевая осадок.
    9. Ресуспендируйте осадок в 1 mL 75% этанола и центрифугируйте при 12,00 x g в течение 1 мин при комнатной температуре. Выполните этот шаг дважды и высушите осадок на воздухе.
    10. Ресуспендируйте осадок в 50 µL воды, свободной от нуклеаз.
      ​ПРИМЕЧАНИЕ: Для растворения РНК инкубируйте ее в воде, свободной от РНказ, в течение 10–30 мин при комнатной температуре.
  2. Метод с использованием TRIzol
    1. Добавьте 20 µL реагента TRIzol к клеточному осадку.
      ОСТОРОЖНО: TRIzol является опасным химическим веществом; поэтому необходимо использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), инженерные средства контроля, такие как вытяжные шкафы, и соблюдать специальные процедуры утилизации отходов.
    2. Проведите лизис клеток согласно шагам 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Добавьте еще 20 µL реагента TRIzol, затем 20 µL хлороформа и перемешайте на вортексе в течение 1 мин. Центрифугируйте при 13,40 x g в течение 15 мин при 4 °C. Убедитесь в правильном разделении фаз после центрифугирования.
    4. Осторожно перенесите водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL.
    5. Осадите РНК, добавив 50 µL изопропанола к водной фазе и инкубируя при −80 °C от 30 мин до 1 ч.
    6. Осадите РНК путем центрифугирования при 15,0 x g в течение 20 мин при 4 °C. Внимательно осмотрите осадок и удалите супернатант, не задевая его.
    7. Ресуспендируйте осадок в 1 mL 75% этанола и центрифугируйте при 13,40 x g в течение 1 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды, высушите осадок на воздухе в течение 30 мин при комнатной температуре и ресуспендируйте в 50 µL воды, свободной от нуклеаз.
  3. Метод с использованием коммерческого набора для экстракции РНК
    1. Ресуспендируйте клеточный осадок в 20 µL буфера для ресуспендирования (Resuspension buffer), входящего в состав набора.
    2. Проведите лизис клеток согласно шагам 2.1.2 - 2.1.3.
    3. Выполните последующие этапы эксперимента в соответствии с инструкциями производителя.

3. Обработка ДНКазой, количественное определение и визуализация

  1. Для удаления контаминации геномной ДНК добавьте к каждому образцу РНК 1 µL DNase I (10units) и 5 µL буфера RDD (1x), затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
  2. Определите количество РНК в образце спектрофотометрически с помощью Nanodrop, а целостность РНК — с помощью Qubit4. Допустимое значение RIN должно находиться в диапазоне 7.5–10. Допустимые значения A260/A280 и A260/A230 должны составлять 1.8–2.0 и 2.0–2.2 соответственно.
  3. Визуализируйте РНК в 1% агарозном геле, используя 1X краситель для нанесения РНК.

4. Синтез кДНК и количественная ПЦР в реальном времени

  1. Подготовьте реакционную смесь объемом 20 µL для синтеза кДНК, используя набор для обратной транскрипции кДНК и 1 µg РНК, следуя инструкциям производителя, в амплификаторе.
  2. Подготовьте реакционную смесь для ПЦР в реальном времени объемом 10 µL, используя 50 ng кДНК, по 0.4 µM каждого праймера и SYBR согласно инструкциям производителя. Проведите анализ образца в амплификаторе для ПЦР в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа методом кПЦР использовались следующие праймеры:
    Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
    Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
    Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacct 3'
    Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccac 3'
    Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
    Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Статистический анализ

  1. Выполните t-критерий Стьюдента для всех биологических повторностей с использованием Graph Pad Prism; значение P ≤ 0.05 считалось статистически значимым. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку как минимум трех биологических повторностей.

Результаты

Качество и выход РНК

Качество и количество РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле (Рисунок 2). Для всех методов экстракции наблюдались отчетливые четкие полосы, соответствующие 23S и 16S рРНК, что подтверждает успешное выделение тотальной РНК. При использовании методов с горячим фенолом и TRIzol наблюдались три четкие полосы, соответствующие 23S (~290 bp), 16S (~1500 bp) и 5S рРНК (~120 bp), что указывает на получение неповрежденной высококачественной РНК. Напротив, при использовании метода с набором на основе колонок наблюдались только полосы 23S и 16S, а полоса 5S рРНК отсутствовала или находилась ниже порога обнаружения, что, вероятно, связано с преимущественной потерей малых РНК при очистке на колонках. Количественно метод с горячим фенолом обеспечил выход РНК в 1,5–2 раза выше, чем TRIzol и RNeasy соответственно (Рисунок 2A,C). Средний выход составил ~60 µg для горячего фенола, ~45 µg для TRIzol и ~30 µg для RNeasy, причем последний вариант показал выход примерно на 50% ниже, чем метод с горячим фенолом. Несмотря на различия в выходе, целостность и чистота РНК были сопоставимы для всех методов (Рисунок 2D,E).

Для оценки эффективности метода лизиса экстракцию РНК также проводили с использованием бисерного гомогенизатора. Были получены сопоставимые выходы, качество и целостность, что доказывает возможность эффективного лизиса с помощью простого ручного измельчителя тканей без использования специализированного оборудования, такого как бисерный гомогенизатор/размельчитель (Рисунок 2B,F–H).

Поскольку Mtb более устойчив к лизису, чем Msmeg, мы дополнительно валидировали оптимизированный метод с использованием горячего фенола на штамме Mtb H37Rv. Лизис клеток с помощью гомогенизатора тканей и бисерного дезинтегратора позволил получить РНК с хорошим выходом, качеством и целостностью (Рисунок 3A–D), что подтверждает надежность метода. Хотя выход РНК при экстракции с помощью ручного гомогенизатора тканей был ниже (~35–45 µg/3 mL культуры) по сравнению с бисерным дезинтегратором (50–60 µg/3 mL), эта разница оказалась статистически незначимой, а количество РНК находилось в приемлемом диапазоне, достаточном для крупномасштабных исследований экспрессии генов. Все процедуры экстракции РНК повторялись несколько раз, и представлены все независимые биологические повторности. На изображениях гелей был проведен денситометрический анализ, который дополнительно подтверждает статистические различия в выходе РНК при использовании разных методов, причем метод с горячим фенолом обеспечил самый высокий выход (Дополнительный Рисунок 1A–D).

Чистота и целостность РНК

Все методы позволили получить РНК с приемлемым соотношением A260/A280 около 2,0, что указывает на минимальное загрязнение белками (Рисунок 2D). Целостность РНК (RIN) была сопоставима для всех методов, при этом значения варьировали от 7,5 до 10 (Рисунок 2D–H, Дополнительный Рисунок 2, нижняя панель). Это свидетельствует о хорошем качестве, целостности и минимальной деградации.

Количественный ПЦР-анализ для проверки качества РНК

Для оценки пригодности РНК, экстрагированной каждым из методов, для последующих исследований экспрессии генов была проведена qRT-PCR. Мы изучили экспрессию генa домашнего хозяйства Msmeg, mysA (MSMEG 2758), и двух транскрипционных регуляторов, sigE (MSMEG 5072) и sigH (MSMEG 1914), используя эквивалентные количества исходной РНК. Полученные значения Ct (пороговый цикл) отражают относительное содержание интактной, амплифицируемой РНК в каждом образце. Как показано на (Рисунке 2I), РНК, экстрагированная с помощью горячего фенола и TRIzol, дала сопоставимые значения Ct в диапазоне примерно 2–25, что свидетельствует о более высокой целостности РНК и совместимости с обратной транскрипцией и амплификацией. Метод с использованием набора показал несколько более высокие значения Ct (~27–30), что указывает на более низкий уровень детектируемого транскрипта. Анализ кривых плавления показал специфическую амплификацию генов mysA, sigE и sigH, что подтверждает специфичность и эффективность qPCR (Дополнительный рисунок 2, верхняя панель). Анализ qPCR с использованием генов Mtb также показал приемлемые значения Ct (~20–25), подтверждая пригодность для последующих исследований экспрессии генов (Рисунок 3E).

Сравнение методов экстракции РНК; гель-электрофорез (28S, 18S, 5S) и столбчатые диаграммы выхода, Ct и чистоты.
Рисунок 2Сравнение методов экстракции РНК для Mycobacterium. (A) Электрофорез в агарозном геле, демонстрирующий общую РНК, выделенную методами с использованием горячего фенола, TRIzol и RNeasy. Во всех образцах видны четкие полосы 23S и 16S рРНК, что свидетельствует о целостности РНК. (B) Электрофорез в агарозном геле, демонстрирующий общую РНК, экстрагированную с использованием горячего фенола посредством различные методы лизиса, а именно с использованием бисерного гомогенизатора и ручного гомогенизатора тканей. (C) Общий выход РНК, демонстрирующий наивысший выход при использовании горячего фенола, за которым следуют TRIzol и метод с использованием набора. (DЧистота РНК оценивалась по соотношению A260/A280; при использовании всех методов значения составили около 2,0, что указывает на минимальное загрязнение белками.Е) индекс целостности РНК (RIN), демонстрирующий сопоставимую целостность. (F–H) Сравнение выхода РНК, соотношения 260/280 и целостности РНК в образцах, лизированных с помощью ручного гомогенизатора тканей и Bead Ruptor, и выделенных методом горячего фенола. (I) значения Ct, полученные в результате qRT-ПЦР с использованием гена домашнего хозяйства (например, mysA) и факторы транскрипции (sigE и sigH). Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку по трем биологическим повторностям (n = 3). Pзначение p, рассчитанное с помощью t-критерия Стьюдента t-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сравнение методов экстракции РНК Mycobacterium, гель-электрофорез и столбчатые диаграммы анализа выхода и чистоты.
Рисунок 3Выделение РНК из Mtb методом горячего фенола. (A) Электрофорез в агарозном геле, демонстрирующий общую РНК, экстрагированную с использованием Bead Ruptor и ручного гомогенизатора тканей с применением оптимизированного метода с горячим фенолом из штамма Mtb H37Rv. (B–D) Сравнение выделенной РНК по выходу, соотношению 260/280 и оценке целостности РНК (RIN). (Е) значения Ct, полученные в результате ОТ-ПЦР с амплификацией специфических последовательностей sigA, 16S рРНК, и hsp70 гены. Столбики погрешностей представляют собой стандартную ошибку по трем биологическим повторностям (n = 3). Pзначение p, рассчитанное с помощью t-критерия Стьюдента t-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Горячий фенолTrizolНабор RNeasy
Выход60 -70 μg35 -50 μg30 - 45 μg
Время2.5-3 ч2-2.5 ч30-45 мин
Стоимость за реакцию$0.10 – $0.20$1.50 – $2.0$7.0 – $10.00
Ограничения Трудоемкость, использование сильных денатурантов (фенол/SDS) Трудоемкость, высокотоксичные реагенты (например, Trizol), необходимость в охлаждаемой центрифуге, стоимость в 15 раз выше, чем у метода с горячим феноломВысокая стоимость (в 72 раза дороже метода с горячим фенолом), более низкий выход, засорение колонок
ПреимуществаБолее высокий выход из меньшего объема, низкая стоимость, отсутствие необходимости в гомогенизаторе для лизиса клеток, отсутствие необходимости в охлаждаемом центрифугированииСредний выход и умеренная стоимость, необходимость в охлаждаемом центрифугированииСредний выход, очень высокая стоимость
Основные статьи расходовОбщелабораторные реагенты (компоненты TES-буфера, кислый фенол, хлороформ, изопропанол, этанол)Коммерческий TRI Reagent®, хлороформ или смесь хлороформ:изоамиловый спирт, изопропанол, этанолЗапатентованные спин-колонки и буферы Qiagen
RIN8-10 RIN7.5-10 RIN9-10 RIN

Таблица 1: Сравнение стоимости, временных затрат и ограничений трех различных процедур экстракции РНК (методы с использованием горячего фенола, TRIzol и RNeasy).

Дополнительный рисунок 1: Оптимизация экстракции РНК. (A) Экстракция РНК с использованием горячего фенола и лизис с помощью ручного гомогенизатора тканей. (BВыделение РНК с использованием TRIzol.C) Выделение РНК с использованием метода RNeasy. (D) Денситометрический анализ изображений гелей РНК, экстрагированной из Msmeg различными методами. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку, рассчитанную с помощью GraphPad Prism (n = 8). (Е) Экстракция РНК из штамма Mtb с использованием горячего фенола. Все изображения гелей представляют собой независимые биологические повторности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: (Верхняя панель) Анализ кривых плавления mysA, sigE, и sigH из M. smeg, n = 3; (Нижняя панель) Анализ целостности РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Для разработки простого и надежного метода экстракции РНК из Mycobacterium был оптимизирован метод горячего фенола. Впоследствии экстрагированная РНК была сравнена с двумя широко используемыми подходами: методом TRIzol и колоночным набором12,13. Эти методики сравнивались по выходу РНК, чистоте, целостности, стоимости и времени обработки для оценки их практичности при последующем молекулярном анализе. Методы горячего фенола и TRIzol, несмотря на их относительную трудоемкость по сравнению с набором, позволили получить интактную высококачественную РНК. Все три метода обеспечили сопоставимую чистоту и целостность РНК; однако метод горячего фенола стабильно давал более высокий выход РНК. Кроме того, РНК, экстрагированная с помощью горячего фенола и TRIzol, показала схожие значения Ct. Однако между методами горячего фенола и RNeasy наблюдалась статистически значимая разница в значениях Ct. Поскольку в эксперименте использовались равные количества РНК, ожидалось получение схожих значений Ct для всех методов. Различия, наблюдаемые в случае с методом RNeasy, могут быть обусловлены особенностями химии экстракции РНК. Горячий фенол и TRIzol являются методами на основе органических растворителей и часто более эффективны при солюбилизации трудноизвлекаемых транскриптов, таких как транскрипты, кодирующие внутренние мембранные белки, или транскрипты с высоким содержанием GC. Напротив, RNeasy представляет собой метод на основе силикационной колонки и может приводить к более низкому выходу определенных транскриптов, которые не связываются эффективно с мембраной или теряются во время стадий промывки по сравнению с методами на основе фенола (Рисунок 2). Важно отметить, что сопоставимые выходы РНК были достигнуты при использовании как ручного гомогенизатора тканей, так и бисерного дезинтегратора для лизиса клеток, что обеспечивает операционную гибкость при проведении лизиса. Кроме того, метод экстракции был оптимизирован для работы с малыми объемами культур и без необходимости центрифугирования при низких температурах. Это упрощение повышает общую легкость и эффективность обработки образцов.

Важным фактором при выборе метода экстракции РНК является баланс между стоимостью, затратами времени и качеством выходного продукта (Таблица 1). Метод с использованием горячего фенола, несмотря на некоторую трудоемкость, остается экономически эффективным благодаря применению общедоступных лабораторных реагентов и способности обеспечивать высокий выход РНК (60–70 µg РНК Msmeg и 35–45 µg РНК Mtb на 3 mL культуры в средней логарифмической фазе) даже при малом объеме культуры (3 mL) и без использования дорогостоящего оборудования для разрыва клеток с помощью бусин, которое применяется в большинстве опубликованных до настоящего времени методов. Это делает данный подход особенно выгодным для лабораторий, работающих в условиях ограниченных ресурсов. Ранее опубликованные методы экстракции РНК на основе горячего фенола различаются по нескольким ключевым аспектам. Например, Mangan и др. использовали M. bovis для экстракции РНК методом горячего фенола, сообщив о выходе примерно 20 µg РНК на 109 клеток. Однако такие критические параметры, как объем культуры и температура экстракции, не были четко указаны. Кроме того, их метод включает промывку детергентом Divolab-1 перед механическим разрушением клеток (реагент, который труднодоступен), с последующей экстракцией хлороформом и изоамиловым спиртом1. В другом методе с использованием горячего фенола РНК экстрагировали из клеток Mtb, получив примерно 39 µg общей РНК, что сопоставимо с оптимизированным методом, описанным здесь. Однако этот метод требовал относительно большого объема культуры (25 mL), что увеличивало время обработки и требовало использования центрифуг большего размера. Более того, при экстракции использовалась смесь хлороформа и изоамилового спирта, а температура экстракции не была указана12,14. TRIzol также широко используется для получения РНК хорошего качества и выхода при умеренных затратах15; однако выход был сравнительно низким. Набор RNeasy обеспечивает превосходное удобство и скорость, что делает его подходящим для рабочих процессов, ограниченных по времени, или для менее опытных пользователей, но при существенно более высокой стоимости по сравнению с двумя другими методами, а выход был значительно ниже. Таким образом, метод, описанный здесь, обеспечивает операционную гибкость при лизисе микобактериальных клеток и последующей экстракции РНК. Он позволяет пользователям выбирать наиболее подходящий способ в зависимости от их приоритетов — будь то стоимость и выход или время обработки — при сохранении сопоставимого качества и целостности РНК во всех трех методах.

Раскрытие информации

Конфликтов интересов между авторами отсутствовало. Все авторы одобрили подачу рукописи.

Благодарности

Я хотел бы выразить благодарность за поддержку Департаменту биотехнологий (DBT), Индийскому совету по медицинским исследованиям (ICMR) и Совету по исследованиям в области науки и техники (SERB).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
кремнеземные бусины диаметром 0,1 ммMP BiomedicalsMP1691050
2-пропанолSigma278475
Bead Ruptor 4 Revvity
ХлороформSigma288306
Охлаждаемая центрифугаThermoScientific42541217
ДНКаза I QIAGEN79254
ЭДТАсигмаE02SS
HClСРЛ62889
ТермоблокMIULABMU-E02-1049
Набор для высокоэффективной обратной транскрипции в кДНК Thermo Fischer Scientific4368814
Моторизированный гомогенизатор тканей G10КоронаG261608
NaClсигмаS586
Нанофотометр N50 РЕАЛИЗАЦИЯT51601
фенол, уравновешенный 0,1 М цитратным буфером (pH 4,5)SigmaP4682
PowerUP SYBRApplied BiosystemsA25742
Флуориметр Qubit 4 Invitrogen2,32262E+12
Амплификатор для ПЦР в реальном времениAnalytik Jena AG844-00503-2
Набор RNeasy KitQiagen74104
SDS (додецилсульфат натрия)SigmaS988
Ацетат натрияSigmaS289
амплификатор Biorad621BR29739
Реагент TRISigmaT9424
Трис-основаниеHimediaMB029
β-меркаптоэтанолSigma516732

Ссылки

  1. Global tuberculosis report, 2024. , Available from: https://www.who.int/publications/b/74877 (2024).
  2. Lange, C., et al. Drug-resistant tuberculosis: An update on disease burden, diagnosis and treatment. Respirology. 23 (7), 656-673 (2018).
  3. Tailleux, L., et al. Probing host-pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages. PLoS One. 3 (1), e1403(2008).
  4. Voskuil, M. I., et al. Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. 198 (5), 705-713 (2003).
  5. Zhang, Y., Yew, W. W. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 13 (11), 1320-1330 (2009).
  6. Arnvig, K. B., Young, D. B. Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 73 (3), 397-408 (2009).
  7. Brennan, P. J., Nikaido, H. The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem. 64, 29-63 (1995).
  8. Belisle, J. T., Sonnenberg, M. G. Isolation of genomic DNA from mycobacteria. Methods Mol Biol. 101, 31-44 (1998).
  9. Manganelli, R., et al. Role of the extracytoplasmic-function sigma factor σH in Mycobacterium tuberculosis global gene expression. Mol Microbiol. 45 (2), 365-374 (2002).
  10. Rustad, T. R., et al. Global analysis of mRNA stability in Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 41 (1), 509-517 (2013).
  11. Mangan, J. A., Sole, K. M., Mitchson, D. A., Butcher, P. D. An effective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria. Nucleic Acids Res. 25 (3), 675-676 (1997).
  12. Venkataraman, B., Gupta, N., Gupta, A. A robust and efficient method for the isolation of DNA-free, pure and intact RNA from Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Meth. 93 (3), 198-202 (2013).
  13. Hiebert, R. M., et al. RNA extraction and RNA-sequencing method for transcriptomic analysis of Mycobacterium tuberculosis. Biotechniques. 77 (1), 23-34 (2025).
  14. Kumar, K., Tharad, M., Ganapathy, S., et al. Phenylalanine-rich peptides potently bind ESAT6, a virulence determinant of Mycobacterium tuberculosis, and concurrently affect the pathogen's growth. PLoS One. 4, e7615(2009).
  15. Alli, A. O., et al. Optimization of RNA extraction in Mycobacterium tuberculosis for studying intracellular gene expression. Afr J Clin Exp Microbiol. 10 (2), 64-79 (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

Mycobacterium tuberculosisTRIzolRNeasy
Оптимизированная экстракция РНК из микобактерий на основе горячего фенола: надежный подход для достоверного анализа экспрессии генов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.