Методическая статья
В данной работе изучается влияние мускона, основного компонента мускуса, на пролиферацию и апоптоз шванновских клеток. Полученные результаты предварительно иллюстрируют потенциальный механизм снижения активности пути NF-κB мускусом путем ингибирования IL-1R1 для ослабления повреждения окислительным стрессом при неврите лицевого нерва.
Основной механизм лечения паралича Белла с помощью натурального мускуса неясен. Это исследование направлено на выявление потенциального механизма использования мускуса в лечении повреждения периферических нервов in vitro. Для достижения этой цели была создана модель повреждения от окислительного стресса в шванновских клетках (СК) с использованием хлорида кобальта (CoCl2). Для оценки защитных эффектов мускона (Mus) на это повреждение и изучения его механизма были использованы анализы жизнеспособности клеток, трансфекция миРНК, иммуноферментный анализ (ИФА), количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (qRT-PCR), вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентное окрашивание и ультраструктурный анализ клеток. В результате показано, что вмешательство Mus усиливает пролиферацию СК и мРНК S-100b в условиях гипоксии, а также снижает активные формы кислорода (АФК) и повышает уровень супероксиддисмутазы (СОД). Mus уменьшает окислительный стресс и воспаление при гипоксических СК за счет снижения IL-1β и TNF-α. Кроме того, Mus модулировал ключевые показатели, участвующие в метаболизме кислорода, восстановлении клеток и нейрометаболизме, включая C-JUN и GDNF. IL-1R1, локализованный в мембране SC, повышался при гипоксии, но значительно снижался после вмешательства Mus. Mus также ингибировал экспрессию компонентов пути NF-κB (IRAK1, IKK, p65, p50) и увеличивал IκB-α. Важно отметить, что отмена экспрессии IL-1R1 с помощью нокдауна миРНК показала устойчивый эффект с Mus. Сделан вывод о том, что путем подавления IL-1R1 Mus ослабляет воспаление в гипоксических СК за счет ингибирования пути NF-κB. Это исследование показало роль IL-1R1 в дисфункции СК, вызванной гипоксией. Кроме того, Мус может быть потенциально эффективным лекарственным средством для лечения паралича Белла.
Мускон (Mus), 3-метилциклопентадеканон, был выделен из натурального экстракта мускуса оленя еще в 1906году1. Мускус, ценная и эффективная традиционная китайская медицина (ТКМ), обладает обширными лечебными эффектами, такими как детумесценция, противовоспалительное действие, реанимацияи улучшение кровообращения. Мускуссодержащая ТКМ используется для лечения различных распространенных заболеваний, включая заболевания центральной нервной системы3, детоксикацию4, опухоли желудочно-кишечного тракта5, вирусный гепатит6, ишемическую болезнь сердца7 и т. д. Являясь активным фармацевтическим ингредиентом мускуса, Mus продемонстрировал отличные биологические эффекты, включая противовоспалительные 8, антиокислительные 8,9, восстановление поврежденных нейронов, облегчение инфаркта миокарда10 и т. д. Механически исследования показали, что Mus может уменьшать высвобождение воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин (IL)-1β, IL-6, фактор некроза опухоли (TNF)-α, активные формы кислорода (АФК)1,8, и регулировать митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK), ядерный фактор каппа-легк-цепь-энхансер активированных В-клеток (NF-κB), AKT/механистическую мишень рапамицина (mTOR) и путь CaN/Erk1/2 1. 8,11 и т.д.
В Китае сообщалось, что некоторые врачи успешно лечили паралич Белла натуральным мускусом, согласно более ранним литературным записям и клиническомуопыту. Мюс не является рекомендуемым препаратом в руководствах по диагностике и лечению, но в недостаточно развитых областях медицины или для некоторых людей, которые не могут использовать стероиды или противовирусные препараты, Мюс может быть еще одним предпочтительным вариантом. Анализ литературы последних лет также показывает, что мускус является наиболее часто используемым китайским лекарством в опубликованных рецептах пластырей китайской медицины и исследованиях акупунктурных точек для лечения периферическогопаралича лицевого нерва. Несмотря на то, что существует множество фармакологических и медицинских исследований муса, до сих пор неизвестно, как именно мускус вылечил паралич Белла и каковы лежащие в его основе нейрохимические и клеточные биологические механизмы.
Паралич Белла, острый идиопатический паралич лицевого нерва, возникает в результате дисфункции периферического лицевого нерва, который иннервирует все лицевые мышцы. Наиболее заметным признаком симптомов неврита лицевого нерва является слабость и опущение лицевых мышц с одной стороны. Хотя паралич лицевого нерва Белла не опасен для жизни, он может повлиять на качество жизни пациента и даже вызвать тревогу и депрессию. Особую тревогу вызывает тот факт, что до 30% пациентов страдают от долгосрочных последствий, включая синкинезии, контрактуры, постоянные лицевые парезы и асимметрию лица, даже при соответствующем лечении. Таким образом, поиск решения неврита лицевого нерва и снижение риска паралича являются нашими основными целями. Современные знания о патогенном механизме неврита лицевого нерва остаются неясными. Недавние исследования показали, что реактивация вирусов может быть основной причиной паралича Белла, и эти вирусы могут вызывать отек нейронов и воспаление, что вызывает приступ паралича Белла.
Основываясь на последних данных, мы предположили, что Mus облегчает симптомы паралича Белла, улучшая повреждение лицевого нерва от окислительного стресса. Это исследование экспериментально показало терапевтические эффекты Муса, показав, что повышенная регуляция IL-1R1 в СК активирует путь NF-κB, вызывая повреждение клеток. Важно отметить, что мы продемонстрировали, что Mus ингибирует передачу сигналов NF-κB, подавляя IL-1R1. Наши результаты выявили роль апрегуляции IL-1R1 у СК, подвергшихся окислительному стрессу in vitro , и позиционировали введение Mus в качестве новой терапевтической стратегии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Это экспериментальное исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (номер одобрения: LL-240077).
Культивирование клеток и медикаментозное вмешательство
Шванновские клетки крыс (СК) культивировали в шванновской клеточной среде, состоящей из базальной среды, 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавки для роста шванновских клеток, 1% пенициллина и 1% стрептомицина. Все клетки содержались в атмосфере с содержаниемСО2 5% при 37 °C. Когда им позволили вырасти до плотности 70-80%, СК разделили на четыре группы (n = 5 в группе): (1) группа НК; (2) группа NC+CoCl2 ; (3) группа NC+CoCl2+Mus; (4) NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus группа.
Известно, что хлорид кобальта (CoCl2), часто используемый агент для имитации гипоксии, вызывает реакции, сходные с реакцией на гипоксию, такие как препятствующая деградация и стабилизация индуцируемых гипоксией факторов и накопление белка HIF-1α15. Согласно модифицированному методу на основе Osuru et al.17, в группах NC+CoCl2 и NC+CoCl2+Mus СК культивировали в Schwann Cell Medium с добавлением 240 мкМ CoCl2 в течение 8 ч при атмосферных условиях 95% воздуха и 5%CO2 при 37 °C в увлажненном инкубаторе (21%O2). Затем в группах Mus применяли вмешательство в виде 1,25 мкг/мл Mus в течение дополнительных 24 ч. Между тем, в группе NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus СК сначала обрабатывали инфекцией миРНК в течение 24 ч, затем непрерывно культивировали 240 мкМ CoCl2 в течение 8 ч, после чего проводили вмешательство 1,25 мкг/мл Mus в течение дополнительных 24 ч, как и в предыдущих группах. Блок-схема экспериментального процесса показана на рисунке 1.
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность СК определяли с помощью реагента для анализа Cell Counting Kit-8 (CCK-8) в соответствии с инструкцией производителя. Культивируемые СК с плотностью 5 × 105 клеток /лунку высевали в 96-луночный клеточный планшет со 100 мкл полной питательной среды при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5%CO2 . Когда слияние достигало 70-80%, в каждую лунку добавляли по 10 мкл раствора CCK-8, и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. Оптическую плотность (OD) 96-луночных планшетов измеряли на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов, а также рассчитывали жизнеспособность клеток. Клетки были разделены на четыре группы: группа NC+CoCl2 , группа NC+CoCl2+Mus и группа NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus. Результаты эксперимента корректировались с помощью пустой лунки (среда+раствор CCK8). Выживаемость клеток = [(экспериментальная группа - глухая лунка)/(группа НК - глухая лунка)] × 100%.
Трансфекция миРНК
Трансфекцию проводили в соответствии с инструкциями производителя коммерческого реагента для трансфекции миРНК/микроРНК in vitro с использованием синтетических дуплексов миРНК siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) в концентрации 100 нг/мкл в течение 24 ч. После трансфекции siIL-1R1 экспрессию siIL-1R1 оценивали путем проведения анализа RT-qPCR через 24 ч после трансфекции18, и эффективность должна быть выше 80%
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Посткультуральные надосадочные жидкости собирали и центрифугировали в групповых условиях (2950 г, 20 мин, 25 °C). Внеклеточные уровни IL-1β, TNF-α, АФК и СОД определяли с помощью иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями набора. Окончательные показания поглощения на длине волны 450 нм были получены с помощью считывателя микропланшетов.
Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-кПЦР)
Следуя инструкциям производителя, общая РНК была экстрагирована из культивируемых клеток с помощью реагента TRisol. Гены-мишени (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) амплифицировали в 20 мкл реакций смеси SYBR qPCR в течение 40 циклов на ПЦР-инструменте. Для нормализации данных использовался β-актин, а специфичность ПЦР была проверена с помощью анализа кривой плавления. С помощью метода 2−ΔΔCt количественно оценивали относительную экспрессию пяти независимых образцов, проанализированных в трех экземплярах. Грунтовки приведены в таблице 1.
Вестерн-блот
После обработки СК из всех опытных групп инкубировали в течение 24 ч и собирали. Общий белок экстрагировали с помощью набора для экстракции общего белка. Лизаты белков комбинировали с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле электрофорезом (SDS-PAGE) в загрузочном буфере, денатурированном при 98 °С в течение 5 мин и разделенным (20 мкг на полосу) на 10-12% SDS-полиакриламидных гелях. Растворенные белки электрофоретически переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF). Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в течение 60 мин при комнатной температуре, затем инкубировали в течение ночи при 4 °C в объеме 6 мл со следующими первичными антителами: антитело против HIF-1α (1:1000), антитело против GAPDH (1:1000), антитело против IL-1R1 (1:1000), антитело против C-JUN (1:1000), антитело против GDNF (1:1000), антитело против IRAK1 (1:1000), антитело против IKK (1:1000), антитело против p65 (1:800), антитело против p50 (1:900), антитела против IκB-α (1:900) и антитела против β-актина (1:1000). После промывки мембраны зондировали вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP) в течение 60 мин при 25 °С. Белковые сигналы были обнаружены с помощью Image Studio Digits Ver 4.0. Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ и нормализована до экспрессии β-актина и GAPDH. Было проведено три независимых эксперимента.
Иммунофлюоресценция
Локализацию IL-1R1 в СК оценивали по Zhao et al.19. Соберите клетки во время логарифмической фазы роста путем трипсинизации, повторно суспендируйте их в свежей полной среде и тщательно растирайте для получения однородной одноклеточной суспензии. Высадите клетки на культуральные планшеты, содержащие стерильные покровные листы. Как только клетки достигнут полного слияния, промойте их 1-2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), тщательно удалите покровные листы и зафиксируйте адгезивные клетки 4% параформальдегидом в PBS на 10 минут, пропитайте 0,05% Triton X-100 (10 минут) и заблокируйте 5% козьей сывороткой (1 час). В первичной инкубации использовался кролик против крыс IL-1R1 mAb. После промывки PBS образцы инкубировали с FITC-конъюгированным козьим антикроличьим IgG в течение 2 ч при комнатной температуре. Добавьте водорастворимые монтажные агенты в защитное стекло для монтажа. Иммуномеченые клетки визуализировали и количественно оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 492 нм и длиной волны излучения 520 нм.
Ультраструктурный анализ
В соответствии с протоколом19 Zhao et al., СК фиксировали в 2,5% глутаральдегиде и после фиксации в течение ночи при 4°C в 1% тетраоксиде осмия. Образцы подвергались серии дегидратации этанола/ацетона. Ультратонкие срезы (80 нм) окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца перед ультраструктурным исследованием с помощью просвечивающего электронного микроскопа.
Утилизация опасных химических реагентов
Среда и растворы, содержащие CoCl2 , собираются в специальный контейнер для отходов из тяжелых металлов. Все одноразовые материалы, вступившие в контакт с вышеупомянутыми жидкостями, включая наконечники для пипеток, центрифужные пробирки и перчатки, классифицируются как опасные отходы тяжелых металлов и передаются лицензированной компании по управлению опасными отходами, одобренной соответствующими органами, для надлежащей утилизации. Выбросьте отработанный раствор параформальдегида в специальный контейнер для отходов альдегида. Использованные расходные материалы должны собираться как отходы альдегида и перерабатываться той же лицензированной компанией по обращению с опасными отходами.
Статистический анализ
Многогрупповые сравнения были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с апостериорным тестом Тьюки в GraphPad Prism 8.0. Статистическая значимость была определена как P < 0,05. Данные представлены в виде среднего ±± стандартного отклонения (SD).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протективное действие Mus на окислительное стрессовое повреждение шванновских клеток in vitro
Экспрессия HIF-1α проявляла изменения в ответ на вариации гипоксических условий20. Для моделирования гипоксии СК подвергали воздействию CoCl2, который успешно индуцировал гипоксию, что подтверждается повышенным уровнем белка HIF-1α, канонического маркера гипоксии, с помощью вестерн-блоттинга (рис. 2A). Последующее вмеша...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Неврит лицевого нерва — это идиопатический паралич периферических нервов лицевого нерва, характеризующийся односторонней слабостью лица. Миелиновая оболочка выполняет различные важнейшие функции в эффективном функционировании нейронов23. Он обеспечивает плавную проводимость нервных импульсов, поддерживает нейроны, поставляя питательные факторы, и помогает в процессе регенерации24 . Следовательно, потеря миелина в периферической нервной сист...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Все авторы хотели бы выразить свою признательность финансирующим органам, которыми являются Программа Комиссии по здравоохранению района Баошань «Таланты (отличные академические лидеры)» (BSWSYX-2024-02), Программа бюджета расходов Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK003), Программа отличников молодежи Комиссии по здравоохранению района Баошань (Yucai) (BSWSYC-2024-02) и Проект по выращиванию класса B в основных медицинских дисциплинах и характерных брендах, Комиссия по здравоохранению района Баошань, Шанхай (BSZK-2023-BP07). Эти финансирующие органы не играли никакой роли в разработке исследования или принятии решения о представлении рукописи для публикации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,25% раствор для расщепления трипсина (без ЭДТА) | Сервисбио | Г4002 | |
| 10 ТБС | Юбиотех | БФ0153 | |
| 10-180 KDPrestained Color Protein Marker | Юбиотех | П0069 | |
| 5% обезжиренное сухое молоко | Beyotime Biotechnology, Китай | П0216-300г | |
| антитела к C-JUN | Cell Signaling, США | #9165T | |
| антитела против GAPDH | abcam, Великобритания | АБ245355 | |
| антитела к GDNF | Cell Signaling, США | #47808 | |
| анти-HIF-1&альфа; антитело | Cell Signaling, США | #14179 | |
| антитела к IKK | Cell Signaling, США | #2682 | |
| антитела к IL-1R1 | Cell Signaling, США | #6775 | для ВБ |
| антитела к IL-1R1 | ПротеинТек | 84094-6-РР | для иммунофлюоресценции |
| антитела к IRAK1 | Cell Signaling, США | #4395 | |
| анти-Iκ B-& антитело | Cell Signaling, США | #8943 | |
| Антитела против p50 | abcam, Великобритания | АБ305263 | |
| антитела к p65 | abcam, Великобритания | АБ16502 | |
| антикрысиный IL-1R1 mAb | Beyotime Biotechnology, Китай | АФ7212 | |
| анти-&бета;-актиновые антитела | АБКАМ | АБ179467 | |
| Набор для количественного определения белка BCA | Юбиотех | ВБ2123 | |
| Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) реагент для анализа | Beyotime Biotechnology, Китай | К0048М | |
| Хлорид кобальта (CoCl<суб>2) | Маклин, Китай | C804815 | |
| Звезда EuECL | Юбиотех | ВБ2131 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Берголин, Китай | ПВЛ001 | |
| Козий антикроличий IgG с маркировкой FITC | Сервисбио | GB22303 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Nikon | ||
| Hieff Trans реагент для трансфекции миРНК/микроРНК in vitro | YEASEN, Китай | 40806ЭС01 | |
| Конъюгированные вторичные антитела к пероксидазе хрена (HRP) меченые Hrp козьи антимышиные IgG | Servicebio, Китай | GB23301 | |
| Набор ИЛ-1&бета;, ФНО--альфа;, АФК и ИФА СОД | БОСТЕР, Китай | BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K | |
| Мускон (Mus) | Аладдин, Китай | M141496 | |
| Буфер PBS | Сервисбио | Г4202 | |
| Пенициллин-стрептомицин раствор, 100x | Процелл | PB180120 | |
| Мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) | Миллипор, США | IPFL00010 | |
| Шванновские клетки крысы (СК) | Procell Медико-биологические науки и Технологии Китай | КМ-М111 | |
| Буфер для лизиса RIPA | Юбиотех | ВБ2116 | |
| Шванновская клеточная среда | ScienCell, США | 1701 | |
| Буфер загрузки SDS-PAGE | Beyotime Biotechnology, Китай | П0015 | |
| SDS-PAGE Protein l Загрузочный буфер, 5x | Юбиотех | ВБ2122 | |
| си-Ил-1Р1 | Ген Универсал | RX0114371 | |
| Додецилсульфат натрия полиакриламид гельэлектрофорез (SDS-PAGE) Набор для приготовления | Юбиотех | ВБ2118 | |
| Смесь для количественной ПЦР SYBR | Beyotime Biotechnology, Китай | Д7260 | |
| Набор для экстракции общего белка | Beyotime Biotechnology, Китай | ПП123-01 | |
| Просвечивающий электронный микроскоп | Hitachi | HT7800 | |
| Тризол | Beyotime Biotechnology, Китай | Р0011 | |
| Подросток-20 | Юбиотех | ВБ2114 | |
| Водорастворимые монтажные агенты | Абсин, Китай | АБС9240 | |
| Западный буфер передачи | Юбиотех | ВБ2129 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение