Методическая статья

Точный фаговый мутагенез с помощью систем CRISPR-Cas с помощью NgTET

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69022

⸱

14 октября 2025 г.

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол для уменьшения модификаций ДНК в бактериофагах с использованием фермента NgTET, что обеспечивает эффективный и безрубцовый мутагенез CRISPR-Cas. Этот метод облегчает генную инженерию фагов для применения в биотехнологии и фаготерапии.

Аннотация

Бактериофаги – вирусы, которые целенаправленно нацелены на своих бактериальных хозяев, обладают значительным потенциалом для биотехнологии и медицины, особенно в борьбе с инфекциями с множественной лекарственной устойчивостью. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе фаговой инфекции, остаются в значительной степени недостаточно изученными. Точный, сайт-специфичный мутагенез фагов является мощным инструментом для выяснения функций генов и взаимодействия фагов и хозяина.

Тем не менее, основной проблемой в мутагенезе генома фага является наличие модификаций ДНК фага, которые мешают обычным инструментам редактирования генома, таким как CRISPR-Cas.

В то время как системы CRISPR-Cas успешно используются для целевого мутагенеза у различных организмов, их эффективность в фаговом мутагенезе часто ограничена модификациями ДНК, такими как гликозилирование цитозина. Для преодоления этого барьера мы разработали эффективный метод, который временно снижает количество модификаций фаговой ДНК, обеспечивая эффективное нацеливание CRISPR-Cas и точное внедрение мутаций в фаговые геномы. В частности, мы используем метилцитозиндиоксигеназу Ten Eleven Translocation (TET) от Naegleria gruberi (NgTET), которая итеративно демодифицирует метилированные и гидроксиметилированные цитозины в ДНК. Окисляя гидроксиметилированные цитозины в ДНК фагов, NgTET предотвращает последующую модификацию цитозина, такую как гликозилирование, и значительно повышает эффективность Cas-опосредованного расщепления ДНК.

В заключение, представленный здесь подход к безшрамовому и точному редактированию генома позволяет эффективно вводить точечные мутации при сохранении архитектуры нативных генов в геномах фагов. Сохраняя нетронутые транскрипционные и трансляционные структуры, этот метод сводит к минимуму непреднамеренные сбои в сложных регуляторных сетях. Это особенно важно для исследования эссенциальных или многофункциональных фаговых белков. Возможность генерировать целевые генетические модификации без введения посторонних последовательностей значительно расширяет экспериментальный инструментарий биологии фагов. Эта стратегия не только способствует детальным функциональным исследованиям, но и расширяет возможности рациональной инженерии фагов для терапевтических и биотехнологических применений.

Введение

Бактериофаги — это вирусы, которые целенаправленно нацелены на бактерии. Они привлекли значительный исследовательский интерес благодаря своему огромному потенциалу в биотехнологии и медицине, особенно в борьбе с бактериями с множественной лекарственной устойчивостью 1,2,3. Несмотря на это, биология фагов остается относительно малоизученной. Более глубокое понимание их молекулярных механизмов захвата бактериальных хозяев имеет важное значение для полного использования их терапевтического и биотехнологическогопотенциала. Для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе эффективной фаговой инфекции, и для дальнейшей разработки фагов для конкретных применений, возможность генетической модификации геномов фагов имеет важное значение. Тем не менее, она остается одной из самых значительных проблем в области биологии фагов 3,5,6.

ДНК фагов часто модифицируется специфическими химическими изменениями пуриновых и пиримидиновых оснований, например, гликозилированием и метилированием цитозина. Эти модификации защищают фаговый генетический материал от распознавания и деградации нуклеазами хозяина6. В то время как эти модификации имеют решающее значение для приспособленности фагов, они являются значительным препятствием для подходов к геномной инженерии фагов, которые основаны на системах нацеливания ДНК 2,3,7.

Существующие стратегии мутагенеза, в том числе системы модификации рестрикции и технологии на основе белков на основе кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)-CRISPR-ассоциированных (Cas), сталкиваются со значительными проблемами при модификации фаговой ДНК из-за защитных эпигенетических модификаций, таких как гликозилирование цитозина. CRISPR-Cas-опосредованное редактирование генома, которое является высокоэффективным в бактериальных и эукариотических клетках, основано на двух ключевых этапах: точном расщеплении ДНК в целевых геномных локусах нуклеазой Cas с последующей репарацией ДНК путем гомологичной рекомбинации с донорской ДНК, несущей желаемую мутацию1. Однако в фагах модификации ДНК часто препятствуют эффективному связыванию или расщеплению генома нуклеазами Cas. Кроме того, быстрый и преходящий характер репликации фагов может еще больше ограничивать эффективность гомологичной рекомбинации. Эти барьеры особенно затрудняют применение технологии CRISPR-Cas, нацеленной на ДНК, для мутагенеза фагов. Было показано, что модификации фаговой ДНК нарушают нацеливание на фагальную ДНК с помощью CRISPR-Cas как in vitro, так и in vivo 6,7.

Чтобы решить проблемы, связанные с защитными модификациями ДНК в фагах, мы представляем стратегию мутагенеза генома, которая использует активность метилцитозиндиоксигеназы, транслокации ten-eleven (TET), в частности, NgTET. У эукариот ферменты TET катализируют ступенчатое окисление метилированного цитозина посредством итерационных процессов: метилцитозин (5mdC) сначала превращается в гидроксиметилцитозин (5hmdC), затем в формилцитозин (5fdC) и, наконец, в карбоксицитозин (5cadC) (рис. 1).

В нашем подходе к фаговому мутагенезу NgTET используется для временного снижения обилия защитных модификаций ДНК, тем самым повышая доступность фаговой ДНК для инструментов редактирования генома, таких как ферменты Cas9. NgTET был выбран для модуляции генома бактериофага в связи с предыдущими сообщениями о его успешной экспрессии в активной растворимой форме в гетерологичном бактериальном хозяине, в частности E. coli. Это свойство имеет существенное значение, так как NgTET должен оставаться активным во время фаговой инфекции10.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Ступенчатое окисление 5-метилцитозина TET-диоксигеназой1. TET-диоксигеназа катализирует последовательное окисление 5-метил-2'-дезоксицитидина (5mdC) до 5hmdC, 5-формил-2'-дезоксицитидина (5fdC) и, в конечном итоге, до 5-карбоксил-2'-дезоксицитидина (5cadC). Конечный продукт, 5cadC, спонтанно или ферментативно возвращается к немодифицированному цитозину (dC), тем самым способствуя динамической эпигенетической регуляции. Этот многоступенчатый процесс занимает центральное место в активном метилировании ДНК у эукариот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Поскольку метилцитозин и гидроксиметилцитозин являются общими предшественниками гипермодификаций фаговой ДНК, включая объемные защитные структуры, такие как гликозилирование, окислительная активность ТЕТ-диоксигеназы может быть использована для предотвращения образования этих гипермодификаций ДНК9. В этом подходе к мутагенезу генома на основе TET мы гетерологически экспрессируем NgTET рекомбинантно в E. coli для окисления гидроксиметилированных цитозинов в геноме фага при инфицировании, тем самым предотвращая образование объемного гликозилирования. Уменьшая распространенность этих громоздких модификаций ДНК, наш подход может увеличить доступность фаговой ДНК к нуклеазам CRISPR-Cas. Эта улучшенная доступность способствует эффективному распознаванию мишеней, точному расщеплению ДНК и введению безрубцовых точечных мутаций в геном фага, что отличает его от традиционных методов мутагенеза фагов, основанных на делециях генов, вставках репортерных генов или интеграции искусственных соединений для отбора мутантов на основе ПЦР 1,11. Эти традиционные стратегии до сих пор были единственными доступными инструментами для целевого мутагенеза в геномах фагов и, следовательно, представляют собой важную основу для представленного здесь метода. Тем не менее, отдельные фаговые белки могут обладать несколькими функциями. Делеция всего гена, кодирующего интересующий белок, нарушает все связанные с ним функции. Напротив, целенаправленное введение точечных мутаций позволяет селективно инактивировать определенные функции, что позволяет детально анализировать их роли. На сегодняшний день функции многих фаговых белков остаются в значительной степени неизученными; Таким образом, мы можем упустить из виду дополнительные активности, связанные с данным геном. Таким образом, минималистский подход, направленный на удаление только одной функции, вызывая при этом минимальные изменения в общем белке, является предпочтительным12,13. Описанный здесь метод позволяет проводить точные генетические модификации без нарушения общей геномной организации или функции. Еще одной серьезной проблемой предыдущих методов мутагенеза фагов была их низкая эффективность, которая обычно давала частоту мутаций около 0,1%1,11. С помощью этой методики мы представляем первую стратегию мутагенеза, способную вводить изменения в одиночные кодоны, достигая заметного семикратного увеличения эффективности нацеливания. Благодаря сочетанию его с высокопроизводительным методом скрининга на основе ONT обнаружение точечных мутаций упрощается, что устраняет необходимость скрининга больших популяций фагов для выделения одного мутанта. Описанная здесь стратегия мутагенеза на основе TET устраняет давнее ограничение в этой области и позволяет более надежно редактировать геном.

В целом, этот метод не может быть применен не только для углубления нашего понимания механизмов заражения бактериофагами, но и имеет значительные перспективы для синтетической биологии. Обеспечивая точную и эффективную геномную инженерию фагов, она прокладывает путь к адаптации фагов к конкретным приложениям, тем самым увеличивая их потенциал для биотехнологических и медицинских приложений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Схема, демонстрирующая генерацию обработанного NgTET фага Т4, показана на рисунке 2.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Схематический обзор установленного рабочего процесса для мутагенеза фагов Т4 и скрининга мутантов. Рабочий процесс включает в себя генерацию гипомодифицированного фага Т4 с использованием NgTET, который может быть валидирован либо с помощью анализа LC-MS, либо с помощью анализа расщепления CRISPR-Cas. Впоследствии представляющая интерес мутация вводится в геном фага посредством CRISPR-Cas-опосредованного сайт-направленного мутагенеза и идентифицируется с помощью контротбора. Наличие желаемой мутации затем может быть подтверждено с помощью секвенирования с помощью нанопор. После валидации мутантный фаг может быть размножен для восстановления гипермодификаций ДНК. Это позволяет использовать сконструированный фаг в последующих приложениях, включая анализ фенотипов инфекций с помощью анализов лизиса и измерения размера всплеска. Каждый шаг на рисунке аннотирован соответствующим номером протокола в скобках, чтобы облегчить увязку этапов протокола с соответствующими частями рисунка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Уменьшение модификаций ДНК фагов с помощью предварительной обработки NgTET (~2 дня)

Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения эффективного нацеливания на нуклеазы Cas во время мутагенеза за счет уменьшения количества модификаций фаговой ДНК.

  1. Инокулируют штамм E. coli BL21 (DE3), преобразованный с pET28a_NgTET, путем переноса материала из глицеринового запаса в 10 мл LB-среды с добавлением 30 мкг/мл канамицина. Выдерживать в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
  2. На следующий день используют ночную культуру для инокуляции основной культуры с исходным наружным диаметром600 0,1 на 50 мл LB-среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина. Индуцировать культуру с помощью 50 мкМ IPTG при достижении OD600 0,4.
  3. Выращивайте культуру при температуре 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин до тех пор, пока она не достигнет наружного диаметра600 0,8.
  4. Инфицируют культуру интересующим фагом при кратности инфекции (MOI) 0,1 и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре с встряхиванием при 120 об/мин.
  5. Соберите клетки центрифугированием при 4000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
  6. Пропустите надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм, чтобы получить обработанные NgTET фаги с гипомодифицированной ДНК. Храните отфильтрованные фаги при температуре 4 °C для дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Отфильтрованные фаги стабильны в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, хранятся в среде LB в стеклянной бутылке.

2. Валидация

Примечание: Целью данного этапа является экспериментальная проверка сниженного количества модификаций фаговой ДНК.

  1. Валидация лечения с помощью ЖХ-МС (~ 2 дня)
    1. Фаговая очистка с помощью градиента сахарозы
      1. Чтобы удалить остаточную нуклеиновую кислоту из лизата, обработайте 500 мкл фаговой суспензии (>10 10 БОЕ/мл) 20 ЕД ДНКазы I и 2 мкл смеси РНКазы А/Т1 (4 мкг РНКазы А, 10 ЕД РНазы Т1).
      2. Выдерживать смесь при температуре 37 °C в течение 30 минут.
      3. Приготовьте градиент сахарозы 0-45% в TM-буфере (50 мМ Tris-HCl, 10 мМ MgCl2, pH 7,5). Готовьте градиент с помощью градиентного миксера или вручную.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для ручного приготовления начните с пипетирования 5 мл TM-буфера в градиентную пробирку. Затем, используя канюлю с тупым концом, медленно пипетируйте 5 мл 45% раствора сахарозы со дна пробирки, позволяя 0% раствору постепенно подниматься.
      4. Загрузите 500 мкл обработанного фагового раствора поверх градиента.
      5. Центрифугируйте при 70 000 × г в течение 20 минут при 4 °C.
      6. Зажгите центрифужную трубку снизу. Это позволит визуализировать фаг, который выглядит как мутная полоса в градиенте. Осторожно удалите фагсодержащую фракцию с помощью тупой канюли.
      7. Перенесите извлеченную фаговую фракцию в новую ультрацентрифужную пробирку.
      8. Добавьте 30 мл ледяного буфера TM и центрифугируйте при 100 000 × г в течение 1 ч при 4 °C.
      9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл буфера TM.
      10. Храните ресуспендированные фаги в стеклянном флаконе при температуре 4 °C в течение ночи.
    2. Выделение ДНК фагов
      1. Добавьте 1 г протеиназы К к ресуспендированным фагам.
      2. Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C.
      3. Добавьте 1 объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (P/C/I). Перемешайте методом инверсии. Разделите фазы центрифугированием при температуре 15 000 x g в течение 1 минуты при 4 °C. Перенесите водную фазу в новую реакционную трубку. Повторите экстракцию три раза.
        ВНИМАНИЕ: Фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (P/C/I) является высокотоксичным, коррозионным и летучим. Всегда держите его в вытяжном шкафу, надев соответствующие защитные средства, включая лабораторный халат, защитные очки и двойные нитриловые перчатки. Избегайте контакта с кожей и глазами и храните в плотно закрытом контейнере в специальном шкафу для химикатов. Утилизируйте отходы через утвержденные каналы для опасных отходов. В случае контакта немедленно промойте водой и обратитесь за медицинской помощью.
      4. Чтобы удалить остаточный фенол, проведите трехкратную обратную экстракцию хлороформа 1 объемом хлороформа.
      5. Осаждение ДНК в течение ночи с 0,1 объемом 3 М NaOAc (pH 5,5) и 2,5 объемом этанола при -20 °C.
      6. На следующий день гранулируйте ДНК центрифугированием при 15 000 × г в течение 1 ч при 4 °C.
      7. Дважды промойте гранулу ДНК 200 μл 70% этанола, осторожно встряхивая, центрифугируя при 15 000 × г в течение 15 минут при 4 °C и осторожно удаляя надосадочную жидкость.
      8. Ресуспендируйте очищенную ДНК в сверхчистой воде.
      9. Храните ДНК при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (точка паузы) Осажденная ДНК может храниться при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев.
    3. Подготовка ДНК фага для анализа ЖХ-МС
      1. Расщепите очищенную ДНК на отдельные нуклеозиды с помощью смеси для разложения нуклеозидов.
      2. Анализ состава ДНК с помощью ЖХ-МС.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет подтвердить эффективность лечения NgTET. Протокол адаптируется к конкретному оборудованию и колонке, имеющимся в лаборатории, но может быть скорректирован в зависимости от имеющихся ресурсов и условий.
      3. Используйте расщепленную ДНК, выделенную из очищенного фага (шаг 2.1.10).
      4. Включите следующие коммерчески доступные стандарты для измерений: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Если это возможно, включите стандарт гипермодификации цитозина, присутствующей на ДНК фага.
      5. Используйте систему ВЭЖХ, оснащенную колонной C18 (150 × 2,1 мм, 100 Å, 3 μм) и защитной колонной 20 × 2,1 мм.
      6. Установите температуру колонки на 40 °C и скорость потока элюента на 0,2 мл/мин.
      7. Готовят элюенты следующим образом:
        Элюент А: 10 мМ ацетата аммония в воде (pH 4,5).
        Элюент В: 0,1% муравьиной кислоты в метаноле.
        ВНИМАНИЕ: 0,1% муравьиной кислоты в метаноле легко воспламеняется и может раздражать кожу, глаза и дыхательные пути. Всегда используйте в хорошо проветриваемом помещении или вытяжном шкафу. Наденьте соответствующие защитные средства, включая лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки. Держите подальше от источников тепла, искр и открытого огня. Хранить в легковоспламеняющемся шкафу для хранения. Утилизируйте в соответствии с утвержденными протоколами по утилизации опасных отходов.
      8. Примените следующий профиль подвижной фазы: 0-1 мин: постоянный при 5% B; 1-5 мин: Градиент от 5% до 90% В; 5-7 мин: Постоянный при 90% B; 7-7,1 мин: Градиент от 90% до 5% В; 7,1-12 мин: Постоянный при 5% B.
      9. Используйте масс-спектрометр в режимах отрицательной и положительной ионизации (отдельные инжекции) с источником ионизации высокотемпературным электрораспылением (H-ESI) при следующих условиях:
        Напряжение распыления H-ESI: 3400 В (+), 2400 В (-), Газ оболочки: 35 условных единиц, Вспомогательный газ: 7 условных единиц, Разверточный газ: 0 условных единиц, Температура ионообменной трубки: 300 °C, Температура испарителя: 275 °C, Режим обнаружения: Полное сканирование с помощью масс-анализатора Orbitrap, Массовое разрешение: 120 000, Диапазон масс: 200-450 (м/з).
      10. Извлечение ионных хроматограмм форм [M-H]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) и [M+H]+ (5ghmdC) с помощью программного обеспечения Tracefinder.
      11. Рассчитайте относительную распространенность каждой модификации путем нормализации пиковой площади каждого сигнала до пиковой площади dG в пределах выборки, используя dG в качестве внутреннего стандарта, специфичного для выборки.
  2. Валидация с помощью анализа расщепления CRISPR-Cas (~2,5 дня)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет фенотипически оценить успех лечения NgTET и его влияние на расщепление CRISPR-Cas. Если NgTET активен, то из обработанной ДНК фага не должны образовываться бляшки, или титр фага должен быть снижен, так как удаление защитных модификаций ДНК делает геном восприимчивым к расщеплению CRISPR-Cas12 или 9. Напротив, если ДНК фага не лечить, количество образовавшихся бляшек будет соответствовать титру фагов, что указывает на то, что гипермодифицированный геном фага Т4 устойчив к расщеплению CRISPR-Cas12 или 9.
    1. Инокулируйте E. coli BL21 (DE3) из ночной культуры, трансформированной как pET28a_NgTET плазмидой, так и плазмидой экспрессии Cas12 или Cas9 (например, DS-spCas или pCpf1 без спейсера). Все плазмиды с дополнительной информацией можно найти в таблице 1.
      1. Выращивайте клетки в среде LB с добавлением соответствующих антибиотиков при 3 °C с встряхиванием, начиная с наружного диаметра600 0,1. Как только культура достигнет OD600 , равного приблизительно 0,4, индуцируйте экспрессию NgTET путем добавления 0,05 мМ IPTG и инкубируйте еще 2 ч при 3 °C.
      2. В качестве контроля сравните штаммы E. coli BL21 (DE3) с гиперэкспрессией NgTET и без нее. При отсутствии активности NgTET ожидается большее количество звеньев, образующих бляшки, что указывает на снижение эффективности CRISPR-Cas из-за присутствия гликозилированного 5ghmdC в ДНК фага.
    2. Перенесите 300 μл культур E. coli в стерильную пробирку.
    3. Инфицируйте культуру с помощью T4 WT или фага, обработанного NgTET, с MOI 0,01. Для этого эксперимента примените низкий MOI, чтобы гарантировать, что бактерии заражаются только одним фагом за раз. Это максимизирует эффективность скрининга спайности CRISPR-Cas и упрощает интерпретацию результатов. Аккуратно перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение фагов.
    4. Инкубировать суспензию бактерий-фагов при 37 °C в течение 7 минут.
    5. Добавьте бактериально-фаговую смесь к 4 мл мягкого агара LB (0,75%) с добавлением антибиотиков. Тщательно перемешайте, но осторожно, чтобы не попасть пузырьки.
    6. Вылейте мягкую агаровую смесь на предварительно подогретую агаровую пластину LB.
    7. Дайте пластинам ненадолго застыть при комнатной температуре. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи.
    8. На следующий день подсчитайте образовавшиеся бляшки, чтобы определить единицы, образующие бляшки (PFU).

3. Мутагенез CRISPR-Cas (~ 1 неделя)

Примечание: Мутагенез CRISPR-Cas основан на принципе, согласно которому определенный участок в геноме фага становится мишенью нуклеазы Cas во время фаговой инфекции, что приводит к двухцепочечному разрыву. Этот разрыв восстанавливается путем гомологичной рекомбинации с использованием донорской ДНК, которая обеспечивается на второй плазмиде, присутствующей в инфицированном штамме хозяина во время мутагенеза. Плазмида, содержащая донорскую ДНК, также кодирует NgTET, который необходим для поддержания доступности фаговой ДНК для нуклеазы Cas за счет снижения содержания модифицированных цитозинов, как описано ранее. На этом этапе целевые мутации вводятся в геном обработанных NgTET Т4 фагов при инфицировании E. coli15. Для обеспечения стабильно низких уровней модификаций ДНК в геноме Т4 диоксигеназа NgTET экспрессируется путем добавления 50 мкМ IPTG (по аналогии с этапом 1.2) на протяжении всего процесса мутагенеза.

  1. Генерация pET28a_NgTET_donor плазмид ДНК с помощью клонирования золотых ворот15
    1. Для генерации донорской ДНК закажите нужную последовательность в виде целого гена или амплифицируйте из генома, например, из генома фага, и введите нужную мутацию.
      Примечание: Для дизайна донорской ДНК включите гомологичные участки, фланкирующие целевой сайт (≈200.н. с каждой стороны для точечных мутаций; более длинные области для более крупных вставок). Фрагмент линейного донора должен нести сайты распознавания BsaI, которые генерируют совместимые выступы с плазмидой при расщеплении. Клонирование in silico рекомендуется для проверки конструкции конструкции. В репрезентативных результатах все критические компоненты донорской ДНК проиллюстрированы на примере.
    2. Введите фрагмент донорской ДНК после кодирующей последовательности NgTET и терминатора в pET28a_NgTET магистраль с помощью сборки Golden Gate.
      1. Реакции сборки готовят путем объединения 70 фмоль pET28a_NgTET плазмиды, 140 фмоль донорской ДНК-вставки, 1 мкл BsaI (20 Ед/мкл), 5 Ед Т4 ДНК-лигазы и 2 мкл 10× лигазного буфера, с добавлением воды, не содержащей нуклеаз, до конечного объема 20 мкл.
      2. В ПЦР-амплификаторе проведите реакции в 25 циклов со следующими настройками: 1) Рестрикция, 37 °C в течение 1,5 мин, 2) Лигирование, 16 °C в течение 3 мин, 3) Окончательное ограничение, 37 °C в течение 5 мин и 4) Денатурация, 60 °C в течение 10 мин.
    3. Добавьте 6 мкл реакционной смеси (начиная с стадии 3.1.2) в 100 мкл химически компетентной E. coli DH5α, инкубируйте на льду в течение 10 мин и испытайте тепловой шок при 42 °C в течение 45 с. Сразу же поместите клетки на лед на 1 минуту, затем добавьте 750 μL LB среды. Восстановите при 37 °C с встряхиванием (500 об/мин) в течение 1 часа. Планшет на ЛБ агар содержит канамицин (30 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при 37 °С.
    4. Выберите одну колонию и введите 20 мл среды LB с добавлением канамицина (30 мкг/мл). Выдерживать в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
    5. Из 5 мл ночной культуры гранулировать клетки и изолировать плазмидную ДНК с помощью стандартного метода плазмидной экстракции. Разбавьте плазмиду в 40 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    6. Подтвердите правильность клонирования путем секвенирования места вставки плазмиды с помощью секвенирования по Сэнгеру.
  2. Конструирование плазмид CRISPR-Cas, содержащих спейсер (модель pCpf1-sp)15
    Примечание: Плазмида, описанная в этой главе, обеспечивает первый этап мутагенеза путем введения сайт-специфичного двухцепочечного разрыва в геноме фага. Хотя эта процедура продемонстрирована здесь с использованием системы CRISPR-Cas12 (плазмида pCpfl-sp), также могутбыть использованы альтернативные нуклеазы, такие как CRISPR-Cas9 (плазмида DS-spCas).
    1. Разработка 20-нт спейсера, нацеленного на сайт мутагенеза (PAM: TTTV). Определение и проектирование подходящих протоспейсеров и соответствующих спейсеров с использованием биоинформационных инструментов.
    2. Синтезировать два 5'-фосфорилированных олигонуклеотида. Убедитесь, что каждый из них несет 10 нт желаемой последовательности спейсера (вместе образуя полный спейсер 20 нл) и дополнительную область 10 нл, комплементарную сайту вставки в плазмиде pCpf1-sp.
    3. Введите разработанный спейсер CRISPR-Cas в плазмиду pCpf1-sp методом амплификации ПЦР с использованием праймеров из шага 2. Настройте реакцию следующим образом (конечный объем 50 мкл): 5 мкл 10× GC буфера, 1 мкл 10 мМ dNTPs, 1 мкл прямого праймера (10 мкМ), 1 мкл обратного праймера (10 мкМ), 2,5 мкл ДМСО, плазмидный матрик, соответствующий 2 фмоль, 1 мкл фузионной ДНК-полимеразы (2 Ед/мкл) и безнуклеазная вода до 50 мкл.
    4. Поместите реакционные пробирки в амплификатор и запустите следующую программу: начальная денатурация при 98 °C в течение 30 с; 25 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с, отжиг при соответствующей температуре (X °C) в течение 30 с и удлинение при 72 °C в течение 6 минут; с последующим окончательным выдержанием при температуре 72 °C в течение 10 минут. Подержите образцы при температуре 4 °C до дальнейшей обработки.
    5. Смешайте 5 мкл ПЦР-реакции с буфером для загрузки ДНК (10×) и загрузите в 1% агарозный гель. Запустите гель при напряжении 130 В в течение 20 минут и визуализируйте полосы ДНК с помощью ультрафиолетового транс-освещения. Если амплификация прошла успешно, очистите продукт ПЦР с помощью подходящего набора для очистки и разбавьте 20 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    6. Циркуляризовать плазмиду путем лигирования с использованием 100 нг амплифицированного продукта, смешанного с буфером 1× Т4 ДНК-лигазы и 60 U Т4 ДНК-лигазой в общем объеме реакции 15 мкл. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Трансформируйте 100 мкл химически компетентной кишечной палочки с продуктом лигирования, как описано в шаге 3.1.3. Поместите клетки на агар LB, содержащий 50 мкг/мл стрептомицина, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
    7. Выберите одну колонию из планшета и инокулируйте ее в 20 мл LB среды с добавлением 50 мкг/мл стрептомицина. Выдерживать в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин. Из 5 мл ночной культуры соберите клетки центрифугированием и выделите плазмидную ДНК с помощью выбранного метода плазмидной экстракции. Разбавьте плазмиду в 40 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    8. Подтвердите успешное клонирование путем секвенирования плазмиды в месте введения с помощью секвенирования по Сэнгеру.
  3. Фаговый мутагенез
    1. Трансформируйте клетки E. coli BL21 (DE3) двумя плазмидами: pET28a_NgTET_donor-ДНК и спейсером pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (полученными на этапах 3.1 и 3.2). Смешайте по 1 мкл каждой плазмиды со 100 мкл химически компетентной E. coli BL21 (DE3). Следуйте протоколу, описанному в шаге 3.1.3. Трансформированные клетки наносят на агар, содержащий 50 г/мл стрептомицина и 30 г/мл канамицина, и инкубируют в течение ночи при 37 °С.
    2. Инокулируют трансформированный штамм E. coli (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-ДНК и pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) в 10 мл LB среды с добавлением 30 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл стрептомицина. Выдерживать в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
    3. На следующий день разбавляют ночную культуру до исходного OD600 0,1 в 50 мл LB среды, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 50 мкг/мл стрептомицина.
    4. Выращивайте культуру при температуре 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр600 0,8. Снизьте температуру до комнатной (RT) и уменьшите скорость перемешивания до 130 об/мин.
      1. Чтобы усилить адсорбцию фагов и инжекцию ДНК, добавьте MgCl2 и CaCl2 до конечных концентраций 1 мМ каждая, поскольку эти двухвалентные катионы способствуют эффективному взаимодействию фага и хозяина.
      2. Инфицируйте культуру фагами Т4, предварительно обработанными NgTET, и в качестве отрицательного контроля необработанными NgTET фагами Т4 с MOI 0,1. Продолжайте инкубацию в RT в течение 4 ч.
    5. После инкубации переложите культуры в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 4000 × г при 4 °C в течение 20 минут для гранулирования клеток. Фильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить остаточные бактериальные клетки. Используйте отфильтрованные надосадочные жидкости для анализа бляшек (описано в шаге 2.2) для определения концентрации фагов или выполнения контротбора.

4. Идентификация мутантов

Примечание: Целью контротбора является уменьшение доли фагов дикого типа, оставшихся в популяции после мутагенеза. Для этого фаги, полученные на стадии мутагенеза (стадия 3.3), используют для инфицирования кишечной палочки , несущей ту же систему CRISPR-Cas13, которая кодируется другой плазмидой pBA560 (дополнительная информация в таблице 1) и той же последовательностью спейсера, примененной при мутагенезе. В этой конфигурации нуклеазы Cas избирательно распознают и расщепляют фаговую ДНК дикого типа, в то время как фаги, несущие желаемые мутации, остаются незатронутыми. Это селективное давление подавляет репликацию дикого типа и обогащает популяцию мутантными фагами14.

  1. Контрвыбор с помощью Cas13
    1. Инфицируйте E. coli Cas13a_spacer (плазмиду pBA560) фагами для контротбора. Этот этап способствует контротбору за счет деградации РНК фага, которая не подверглась предполагаемой мутации.
    2. Выполните контротбор в тех же условиях, которые использовались при мутагенезе (см. шаги 3.3.1-3.3.5). Используйте E. coli, экспрессирующую нецелевой спейсер Cas13a, в качестве отрицательного контроля, чтобы подтвердить, что уменьшение бляшек является специфичным для спейсера.
    3. После инкубации отфильтруйте надосадочную жидкость, содержащую контротобранные фаги, через фильтр 0,45 мкм для удаления бактериальных остатков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Отфильтрованные фаги стабильны в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, хранятся в среде LB в стеклянной бутылке.
    4. Используйте контротобранные и отфильтрованные фаги для анализа бляшек на штамме E. coli B, чтобы изолировать отдельные бляшки для последующей валидации.
  2. Секвенирование нового поколения (~ 1 неделя)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Способ высокомультиплексного секвенирования включает в себя двухэтапный процесс ПЦР для получения мультиплексированной ампликонной ДНК, пригодной для длинного секвенирования следующего поколения16.
    1. Отделите фаги от мутагенеза, выделив их, как описано в шаге 2.2. Включите надлежащий контроль с использованием фагов, полученных в результате мутагенеза, выполненного как в присутствии, так и в отсутствие экспрессии NgTET. В качестве контроля, нацеливание на CRISPR-Cas9 и Cas12 без NgTET не должно приводить к введению точечных мутаций. Напротив, ожидается, что коэкспрессия NgTET обеспечит успешное редактирование, что приведет к более высокой эффективности мутагенеза.
    2. Чтобы выделить отдельные фаги, возьмите отдельные бляшки из планшета и перенесите их в пробирку, содержащую 100 мкл буфера Pi-Mg (26 мМ Na2PHO4, 68 мМ NaCl, 22 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, pH 7,5) и 1 мкл CHCl3.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ токсичен, летуч и является подозреваемым канцерогеном даже в небольших количествах. Обращайтесь только в вытяжном шкафу и носите полное защитное снаряжение, включая лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки. Избегайте ингаляций и контакта с кожей. Хранить в плотно закрытой таре в вентилируемом, легковоспламеняющемся шкафу для химикатов. Утилизируйте отходы хлороформа путем сбора опасных отходов.
    3. Используйте 1 мкл выделенного фага T4 в буфере Pi-Mg в качестве матрицы для скрининга.
    4. Приготовьте реакционную смесь с 0,125 μМ каждого праймера (вокруг места введения) и 1x высокоточной полимеразной мастер-смесью, регулируя общий объем реакции амплификации до 10 μл. Запустите реакцию ПЦР с 30 циклами амплификации.
    5. Проведите вторую ПЦР для прикрепления штрих-кодов. Поэтому в качестве матрицы используйте 1 мкл разведения продукта в соотношении 1:10 из первой ПЦР.
    6. Приготовьте реакционную смесь с помощью праймеров штрих-кодирования 0,3 μМ и высокоточной полимеразной смеси горячего пуска в общем объеме 7 μл. Проведите ПЦР с 20 циклами амплификации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (точка паузы) Продукты из ПЦР могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель.
    7. Объедините все продукты ПЦР со штрихкодами и очистите их с помощью очистки на основе магнитных шариков в соответствии со стандартными протоколами подготовки библиотеки секвенирования нового поколения.
    8. Захватите ДНК с помощью магнитных шариков, дважды промойте 80% этанолом и выведите в 100 мкл элюирующего буфера (5 мМ Tris-HCl, pH 8,5).
    9. Измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометрических и флуориметрических методов, применяя либо широкодиапазонный, либо высокочувствительный анализ, в зависимости от ситуации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) ДНК может храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель.
    10. Создание библиотек секвенирования с использованием протокола на основе лигирования в соответствии с инструкциями производителя, начиная с 1 мкг входной ДНК.

5. Мутантное размножение, восстановление модификаций ДНК и доказательство

Примечание: После того, как желаемый мутант фага идентифицирован, его размножают в кишечной палочке дикого типа для восстановления уровней модификации ДНК, аналогичных уровням фага WT. Это гарантирует, что мутантный фаг может быть использован в последующих биологических экспериментах без каких-либо компромиссов, за исключением введенной мутации.

  1. Приготовьте культуру штамма E. coli B в объеме 10 мл в среде LB и инкубируйте в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин.
  2. На следующий день инокулируйте свежую среду объемом 50 мл LB с ночной культурой, чтобы достичь начального наружного диаметра600 0,1.
  3. Дайте культуре расти при 37 °C с встряхиванием при 160 об/мин, пока она не достигнет наружного диаметра600 0,8.
  4. Добавьте в культуру 50 мкл мутантного фагового материала (4.2.2). Осторожно удалите фазу, чтобы избежать переноса CHCl3.
  5. Инкубируйте зараженную культуру в течение ночи при комнатной температуре с легким встряхиванием при 120 оборотах в минуту.
  6. После инкубации культуру центрифугируют при 4000 × г для удаления бактериальных клеток. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм для сбора фага.
  7. Переложите отфильтрованный мутантный фаг в стеклянную емкость и храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Отфильтрованные фаги стабильны в течение нескольких месяцев при температуре 4 °C, хранятся в среде LB в стеклянной бутылке.
  8. В качестве дополнительной валидации регенерации модификаций ДНК, в частности, гликозилированных цитозинов, проводят анализ ЖХ-МС, как описано на шаге 2.1.
    1. С этой целью очистите выделенную ДНК фага из потомства фага, как описано в шаге 2.1.1, изолируют, как описано в шаге 2.1.2, и затем подготовьте к анализу LC-MS, как описано в шаге 2.1.3.
    2. Проанализируйте ионные хроматограммы и рассчитайте относительную распространенность каждой модификации путем нормализации пиковой площади каждого сигнала до пиковой площади dG в образце, используя dG в качестве внутреннего стандарта для конкретного образца, как описано в шагах 2.1.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется включить фаг дикого типа Т4, фаг Т4, обработанный NgTET, и фаг Т4, обработанный неактивным вариантом NgTET D234A, в качестве контроля, чтобы непосредственно подтвердить и сравнить распространенность 5ghmdC10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Идентификация фаговой полосы в градиенте.
Видимость фаговой полосы в градиенте зависит от концентрации фагов в исходном образце, загруженном на градиент. Когда фаг достаточно сконцентрирован (~>1 × 1011 PFU/мл), полосу можно четко увидеть, подсветив градиент снизу источником света (см. рисунок 3).

Однако при низких концентрациях фагов полоса может быть не так хорошо заметна. В этом случае мы рекомендуем повторить попытку визуализа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании представлена надежная и адаптируемая стратегия введения точных точечных мутаций в геномы бактериофагов, включая однонуклеотидные изменения. Центральным элементом рабочего процесса является интеграция строгих этапов валидации на каждом этапе, что имеет важное значение для обеспечения точности и эффективности редактирования генома. Это особенно важно, учитывая многоступенчатый характер рабочего процесса и динамические взаимодействия между фагами и их бактериальными хозя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

KH и NP подали заявку на европейский патент на «Инженерию фагов», заявку на европейский патент No 23 175 257.7. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Этот проект получил финансирование от Немецкого научно-исследовательского совета (DFG; SPP 2330 проект No 464500427, RTG 2355 проект 11 и RTG 2937 (проект No 505997786) от Общества Макса Планка (финансирование Max Planck Research Group Leader для K.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реакционные пробирки объемом 1,5 млСарштедт72.690.001
Каноциальные трубки объемом 15 млСарштедт62.554.502
Тонкостенные полипропиленовые трубки с открытым верхом 15 млBeckman Coulter Медико-биологические науки36170616 мм x 95 мм (для ультрацентрифугирования)
50 мл канонических пробирокСарштедт62.547.254
5x буфер GCThermo Fisher Scientific Ф519Л
6x Краситель для загрузки ДНК TriTrack Thermo Fisher Scientific Р1161
АгарозаМеридиан БИОНАУКАБИО-41025Молекулярный сорт
Центрифуга Avanti J-30IBeckman Coulter Медико-биологические наукиНет каталога  числоSerien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Борная кислота Мерк10043-35-3
BsaI-HF v2КЛЮВР3733С
Гексагидрат хлорида кальцияАКРОС ОРГАНИК7774-34-797 %, экстра чистый 
Измеритель плотности ячеекГарвардский биохром 80211630
ChemiDoc MP Биорад12003154
ХлороформВВР650498
КюветыСарштедт67.742
Диметилсульфоксид (ДМСО) Сигма ОлдричД4540
Ди-натрия гидрофосфатneoFroxx GmbH7558-79-4Фармацевтический класс
Одноразовые стеклянные пастеровские пипеткиВВР612-1702230 мм
ДНКаза I Рош471672800110 Ед/&микро; L
смесь dNTP (по 10 мМ каждый dNTP) Сигма-Олдрич72004
DS_SPcas_ModAСобственный продукт.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsПлазмидная конструкция, содержащая sgRNA CRISPR-Cas12/ModA
DS-spCas (система CRISPR-Cas9)Addgene 48645 (дополнительный номер addgene)Плазмида для конструирования плазмид CRISPR-Cas, содержащих спейсер (система CRISPR-Cas9) для мутагенеза фагов (шаг 3.2)
Штамм E. coli B использовался для лечения инфекции Т4ДСМЗНет каталога  числоEscherichia coli (Migula 1895) Castellani and Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Экспрессионный штамм, компетентная клеткаИнвитрогенC600003Экспрессия штамма, компетентных клеток.
E. coli DH5α Клонируемый штамм, компетентные клеткиИнвитроген18265017Клонирование штамма, компетентных клеток. 
ЭДТАРот8043.2
Этанол (абсолют) ВВР200-578-6
Проточная ячейка FlongleОксфорд Нанопоровые технологииНет каталога  числоR10.4.1. химия, https://nanoporetech.com/document/flongle
Набор для мини-подготовки к плазмиде Gene JET Thermo Fisher Scientific 10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladderThermo Fisher Scientific СМ1331
Лестница ДНК GeneRuler ULR Thermo Fisher Scientific СМ1213
Градиент Мастер 108БИОКОМПНет каталога  числоhttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Центрифуга Heraeus Pico 17Термо Сайентиал75002410
Инфорс ХТ Инкубатор МинитронИнфорс АГНет каталога  числоhttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Изопропил-&бета;-D-1-тиогалактопиранизид (ИПТГ)Сигма-Олдрич367-93-1
КанамицинКарл РотТ832.1
ЛБ-агарКарл-РотХ969.1
LB-средний (Лурия/Миллер) Карл-РотХ968.1
Магния хлорид гексагидрат Сигма-Олдрич7791-18-6
Сульфат магния Сигма-Олдрич7487-88-9
Устройство MinION Оксфрод Нанопоровые технологииНет каталога  числоhttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
МодА E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		Прямой праймер для введения точечной мутации для ModA E165A и для введения липких концов для клонирования Golden Gate (Шаг 3.1)
МодА E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		Обратный праймер для введения точечной мутации для ModA E165A и для введения липких концов для клонирования Golden Gate (Шаг 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTAAA
GTTCTTAGACCCG		Прямой праймер для генерации спейсера для систем CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 для мутагенеза фагов и контрселекции (шаг 3.2 и шаг 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		Обратный праймер для генерации спейсера для систем CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 для мутагенеза фагов и контрселекции (шаг 3.2 и шаг 4.1)
Спектрофотометр NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher ScientificAZY2019944
Набор NucleoMag Мачери НагельКОД 744970.50
Смесь для разложения нуклеозидов Биолаборатории Новой АнглииМ0649С
pBA560 (система CRISPR-Cas13)Адджен186236 (дополнительный номер addgene)Плазмидная кодирующая система CRISPR-Cas13 для контрселекции (шаг 4.1)
Плазмида pCpfl-sp (система CRISPR-Cas12)Адджен122186
Плазмида pCpfl-sp (система CRISPR-Cas12)Адджен122186 (дополнительный номер addgene)Плазмида для конструирования спейсерсодержащих плазмид CRISPR-Cas (система CRISPR-Cas12) для мутагенеза фагов (шаг 3.2)
Реакционные пробирки для ПЦРСарштедт72.991.002
ПеqГРИНВВР732-3196
pET28a_NgTET Собственный продукт.Нет каталога  числоПлазмида предоставляется по запросу, карту плазмид можно найти по следующим https://zenodo.org/records/10615143 
pET28a_NgTET Собственный продукт.Нет каталога  числоПлазмида для конструирования pET28a_NgTET_donor ДНК методом клонирования Golden Gate (шаг 3.1), плазмида  предоставляется по запросу, карту плазмид можно найти по следующим https://zenodo.org/records/10615143 
Пластины ПетриСарштедт82.1473.00192 x 16 мм с кулачками
Фузионная ДНК-полимераза Thermo Fisher Scientific Ф-530XL2 U/&микро; L
Фосфат калияСигма Олдрич7778-77-0Монобазовый
Универсальный блок питания PowerPacБио Рад1645070
Протеиназа K Карл Рот 7528.1100 мг/мл
Набор для очистки ПЦР QIAquick ЦИАГЕН28506
Флуорметр Quantus, система дцДНК QuantiFluorКомпания PromegaЕ2670
РНКаза А/Т1 Thermo Fisher ScientificЕН0551смешать 2 мг/мл РНКазы А 5000 Ед/мл РНКазы Т1 
Roti-Aqua P/C/I для экстракции ДНК Карл РотХ985.1
Ацетат натрия Сигма-Олдрич127-09-3
Хлорид натрия Сигма-Олдрич7647-14-5
SQK-LSK109 Набор для секвенирования лигированияОксфорд Нанопоровые технологииНет каталога  числоhttps://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Фильтры Steritop, 0,22 &; м размер порМногородностьS2GPT05RE250 мл и 500 мл
Стрептомицин 50 мг/лКарл РотНР66.1
СахарозаNeoFroxx GmbH57-50-1Для молекулярной биологии 
Качающийся ковш Алюминиевый ротор Beckman Coulter Медико-биологические наукиДС[1]24.15
T4 DNA Ligase 5 U/µ LThermo Fisher Scientific ЭЛ0011
Буфер ДНК-лигазы Т4Thermo Fisher Scientific В69
Пробирки толстостенные безободковыеКарл Хехт ГмбХ42775054100 мм x 18 мм
Термоамплификатор, T100Биорад1861096
Термомиксер комфорт Эппендорф5382000015
База ТризмаСигма Олдрич77-86-1
Ванна, VWB2 ВВР462-0557Объем 12 л

Ссылки

  1. Pozhydaieva, N., et al. Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications. PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).
  2. Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).
  3. Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. Bacteriophage applications for food production and processing. Viruses. 10 (4), 205(2018).
  4. Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels. Viruses. 14 (11), 2502(2022).
  5. Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics. Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).
  6. Vlot, M., et al. Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes. Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).
  7. Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9. ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).
  8. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  9. Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science. 328 (5980), 916-919 (2010).
  10. Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
  11. Shitrit, D., et al. Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages. ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).
  12. Dedrick, R. M., et al. Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus. Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).
  13. Marinelli, L. J., et al. BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes. PLoS One. 3 (12), e3957(2008).
  14. Adler, B. A., et al. Broad-spectrum CRISPR-Cas13a enables efficient phage genome editing. Nat Microbiol. 7 (12), 1967-1979 (2022).
  15. Pozhydaieva, N., Höfer, K. Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis. Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).
  16. Ramírez Rojas, A. A., et al. DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs. ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).
  17. Lagerbäck, P., et al. Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates. Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).
  18. Lagerbäck, P., Carlson, K. Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis. J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).
  19. Shembrey, C., et al. Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision. Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).
  20. Molina Vargas, A. M., et al. New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity. Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).
  21. Shi, P., Wu, X. Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13. RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).
  22. Levin, B. R., et al. The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity. PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).
  23. Hershey, A. D., Chase, M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).
  24. Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI. J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NgTETGolden GateT4 Ecoli

Похожие статьи