Методическая статья

Оценка ответов листьев на микробные вторичные метаболиты с использованием высокопроизводительного формата

DOI:

10.3791/69026

⸱

5 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2The Boyce Thompson Institute for Plant Research, 3Department of Biology, University of Ottawa

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает высокопроизводительный подход для оценки утечки ионов растений, активности пероксидазы и производства каллозы в одном образце.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробы выделяют структурно разнообразные вторичные метаболиты во время заражения растениями, часть из которых обнаруживается клетками растений, вызывая стрессовые реакции. В этом методе индукция утечки ионов, активность пероксидазы и образование каллозы измеряется в одном образце листового диска. Во-первых, диски Arabidopsis или ячменные листья инфильтруются вакуумом в пластине с 96 лунками. Через 4–6 часов измеряется проводимость, затем активность пероксидазы и отложение каллозы через 24 часа. Пептид flg22 вызывает все три ответа и является доступным положительным контролем. Циклические липопептиды Сурфактина и Грамиллина вызывают соответственно активность пероксидазы и утечку ионов, тогда как фитотоксичный трихотецен Т-2 подавляет активность пероксидаз. В целом такой подход позволяет проводить многократные сравнения как по генотипам растений, так и по методам обработки метаболитами. Этот подход может применяться к химической генетике или биопротекции для выявления соединений, модулирующих стресс, для дальнейшего изучения. В генетике растений этот подход можно использовать для сравнения реакций между популяциями растений на генетическое картирование и для улучшения понимания взаимодействий между растениями и микробами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растения реагируют на различные микробные молекулы, активируя клеточные стрессовые реакции, что может привести к устойчивости к болезни. Молекулярные паттерны, связанные с микробами (MAMP), такие как пептид flg22 бактериального флагеллина, обнаруживаются белками растительных рецепторов для запуска ряда клеточных сигнальных ответов. К ним относятся ранние реакции, такие как каскады киназ, производство реактивных форм кислорода (ROS), скачки кальция, деполяризация мембран, а также поздние реакции, такие как отложение каллозы и индукция активностипероксидазы 1. Микробные вторичные метаболиты (МСМ) — это небольшие (50–1 500 дальтон), структурно разнообразные молекулы, которые ненужны для роста и развития, но способствуют выживанию микроба. Некоторые МСМ вызывают клеточные стрессовые реакции у растений, хотя механизмы, связанные с инициацией этих ответов, остаютсянерешёнными 2,3. Предлагаемые механизмы распознавания МСМ у растений включают механозензию, модификации белка, вызванные редокслом, или липидную сигнализацию 4,5. В некоторых случаях МСМ вызывает стрессовые реакции или приводит к повреждению клеток в зависимости от концентрации. Например, токсин T-2 индуцирует производство каллозы и ROS при 1 мкм и вызывает гибель клеток при 10 мкм, обычно описывается как фитотоксин4. МСМ влияют на патогенез в некоторых взаимодействиях растений и микробов и могут вызвать как восприимчивость, так и устойчивость растений. Например, циклический липопептид с граммиллином индуцирует выработку ROS, утечку ионов и каллозу, одновременно повышая восприимчивость ячменя к Fusarium graminearum2. Циклические липопептиды сирингомицина и сирингопептина стимулируют выработку ROS растений и способствуют устойчивости хозяина к бактериям Pseudomonas fluorescens 3. Другие МСМ, такие как сурфактин и итурин, вырабатываются непатогенными микроорганизмами и способствуют устойчивости к последующему заражению патогенами, вызывая стрессовые реакциирастений 6,7. Эти биопротекторные МСМ вызывают клеточные ответы, включая ионные потоки, выработку ROS, транскрипционные изменения и выработкукаллозы 8. Понимание взаимодействия между МСМ и растениями может помочь определить роль МСМ в устойчивости к болезням и выявить гены хозяина, которые можно использовать для повышения устойчивости сельскохозяйственных культур.

Современные методы оценки стрессовых реакций растений, вызванных МСМ, обычно включают тестирование одной стрессовой реакции зараз 8. Учитывая, что вторичные МСМ трудно извлечеть, а наличие ограниченного количества метаболита, тестирование множества ответов в одном образце может дать уверенность в том, что МСМ влияет на клетки растений. Одним из высокопроизводительных методов оценки апопластических вспышек ROS является обнаружение люминесценции, генерируемой окислённым люминолом в присутствии пероксидазыхрена 9. К сожалению, люминесценция на основе люминола закалывается катионами и некоторыми растворителями, что ограничивает использование этого анализа для экстрактов, содержащих соли, или для неполярных молекул, которые необходимо растворять в DMSO, что требует метода, работающего с этимизагрязнителями 9. Для решения этих проблем мы расширили современные методы, чтобы оценить три стрессовых ответа (утечку ионов, активность пероксидазы и мозоли) из одного и того же образца листьев в высокопроизводительном анализе (рисунок 1)10,11,12. Наш подход включает обработку листовых дисков с помощью МСМ с помощью вакуумной инфильтрации в пластине с 96 лунами. Далее проводятся измерения проводимости через 4–6 часов после обработки для оценки утечки ионов, затем измеряют активность пероксидазы и осаждения каллозы через 24 часа. Наш подход оптимизирован для Arabidopsis и ячменя, но может быть распространён и на другие виды растений с экспериментальной валидацией. Например, индуцированная активность ячменной пероксидазы не обнаруживается этим методом, но подавление активности токсичными соединениями может быть обнаружено. Таким образом, характеристики листьев или амплитуда индуцированного ответа варьируются между видами, что ограничивает применимость такого подхода к некоторым видам растений.

Проектирование экспериментов с использованием этого метода должно учитывать контроль, репликацию и концентрацию используемых МСМ для достижения наилучших результатов. Отрицательный контроль необходим для выявления МСМ, вызывающих статистически разные уровни стрессовой реакции по сравнению с последствиями ранения. В идеале отрицательный контроль должен содержать тот же растворитель, что и MSM, но без MSM. Типичные растворители для гидрофобных МСМ включают DMSO и метанол, которые вызывают клеточные ответы, такие как выработка ROS, при высокихконцентрациях 13,14. В этом анализе наблюдается влияние на активность пероксидазы: 10% и выше DMSO и метанола блокируют активность, вызванную flg22 пероксидазой (рисунок 2). В случае сложных экстрактов может быть сложно выработать отрицательный контроль без МСМ, когда интересующие метаболиты неизвестны. Вместо этого фракционирование экстрактов по размеру, полярности или заряду позволило бы сравнить дроби для выявления наиболее вызывающей напряжения фракции для дальнейшего анализа. Кроме того, включение положительного контроля, такого как токсин 1 мкм flg22 или 10 мкм токсина T-2, гарантирует, что исследователь может оценить работу анализа. Мы рекомендуем включать четыре технических репликации на каждую обработку и включать положительные и отрицательные контроли в каждую пластину, когда в эксперименте измеряются несколько пластин.

В целом, этот подход охватывает три реакции стресса растений, вызванных МСМ, предлагая доступный и экономичный метод для обследования взаимодействий растений и МСМ. Высокапроизводительный формат позволяет исследователям фиксировать тонкие различия между генотипами растений или микробными экстрактами в рамках одной экспериментальной единицы. Это позволяет системным подходам понимать семейства генов растений или проводить обследование популяций растений для генетического картирования. Со стороны микроорганизмов этот подход может использоваться для скрининга потенциальных биопротекторных соединений или в химической геномике для выявления соединений, которые усиливают или подавляют специфические стрессовые реакции.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка и обработка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать все необходимые меры безопасности и процедуры утилизации, чтобы минимизировать риск для экспериментатора и окружающей среды.

  1. Выращивание растений
    1. Выращивайте Arabidopsis до стадии 4-5 недель на почвенной смеси Корнелла (300 торфяных мхов: 630 вермикулита, 1 медленно высвобождающееся удобрение: 4,2 известняка) с двумя растениями в горшке в 24 горшках на лоток. Поливайте растения по мере необходимости снизу, добавляя воду в поддон. Установите температуру в камере роста на 21 °Cнепрерывно, при этом 16 часов света и 8 часов темноты, и держите влажность примерно 30-50%. Используйтеполностью развернутые листья 5-9 для экспериментов и сбора урожая утром.
    2. Выращивайте ячмень, пока первый и второй настоящие листья полностью не раскрытся, в 75 горшках почва: 24 чёрная земля: 1 смесь известковой почвы. Сажайте по одному семяну в горшок на 24 участка в лотке, поливайте по необходимости. Установите условия в камере роста на 21 °C при 16 часах света и 8 часах темноты при влажности примерно 30-50%. Попробуйте первый и второй полностью расширенные листья и собирайте урожай утром.
  2. Собирайте три листовых диска на каждое растение с помощью пробкового сверлителя диаметром 4 мм, избегая средней жилки. Избегайте мацерации ткани, используя острый сверлитель с скручивающим движением.
  3. Немедленно и аккуратно поместите листовые диски в одну из ямок пластины на 96 лунок в 196 мкл стерильного Milli-QH 2O. Продолжайте сбор дисков, пока не будет собрано необходимое количество образцов.
  4. Добавьте вторичные метаболиты или растворители в желаемой концентрации до итогового объёма 200 мкл в отдельные скважины.
  5. Поставьте пластину на 96 лунок с закрытой крышкой в колокольчик с вакуумным соплом.
  6. Подключите вакуумный шланг к соплу колокольчика и включите вакуумное давление, пока вакуум не достигнет 9,8 фунта на квадратный дюйм (обычно 10 секунд). Повторите этот процесс ещё раз.
  7. Поставьте крышку на пластину и инкубуйте на орбитальном шейкере (55 об/мин) под светом (13 Вт, 50 мкм∙м-2∙с-1), установленном на 23 см над шейкером, в течение 4 часа.

2. Измерения утечки ионов

  1. Помойте зонд в воде Milli-Q и слегка нанесите Kimwipe для сушки. Обратите внимание на показатели проводимости воды для сравнения.
  2. Через 4-6 часов после обработки возьмите пробы и зафиксируйте проводимость отдельных скважин, погружая зонд в жидкость вокруг листового диска. Держите пластину под углом 45°, чтобы убедиться, что зонд полностью засушен.
  3. Промывайте зонд между образцами, окунув в воду Milli-Q и промокнув зонд насухо на Kimwipe. Иногда проверяйте проводимость воды, чтобы убедиться, что показания зонда остаются стабильными.
  4. Положите на пластину пластиковую герметизационную пленку и верните в орбитальный шейкер для инкубации на ночь.

3. Измерения активности пероксидазы

  1. Ежедневно готовьте пероксидазный субстрат свежим в виде раствора объёмом 50 мл. Нагрейте 40 мл дистиллированной стерильной воды до 70 °C в стакане с баром для перемешивания и растворите 50 мг 5-аминосалициловой кислоты (1 мг/мл) в нагретой воде. Добавьте воду до 50 мл и отрегулируйте pH до 6 с помощью NaOH. Раствор чувствительный к свету, поэтому накройте его алюминиевой фольгой или используйте янтарную трубку.
  2. В янтарной конической трубке объёмом 50 мл приготовьте раствор 1% H2O2, добавив 1,7 мл 30% H2O2 до 48,3 мл Milli-QH 2O.
  3. Непосредственно перед анализом добавьте 10 мкл раствора 1% H2O2 на миллилитр 5-аминосалицилового раствора, необходимого для получения среды для анализа.
  4. Для отбора образцов обработанных листовых дисков возьмите 50 мкл из каждой ямы в нужное время. Переложите на прозрачную плоскодонную пластину на 96 лунок и добавьте 50 мкл пробиральной среды, перемешав с помощью пипетки 5 раз.
  5. Инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 3 минут и остановить её, добавив 20 мкл 2 N NaOH, аккуратно постукивая для смешивания.
  6. Измерьте поглощение скважин на 595 нм в считывателе пластин.

4. Каллозская визуализация и анализ изображений

  1. После отбора проб для анализа пероксидазы удалите оставшуюся жидкость и добавьте 100 мкл раствора уксусной кислоты:этанол (1:3) для фиксации и окрашивания. Накройте пластину крышкой и инкубуйте её на шейкере (60 об/мин) в вытяжной жидкости 24 часа при комнатной температуре.
  2. Замените раствор для удаления пятен на свежий и инкубируем ещё 24 часа при комнатной температуре.
  3. Пипетом выпустите раствор для удаления пятен и добавьте 100 мкл 150 мМ K2HPO 4 в каждую скважину. Поставьте тарелку на шейкер и инкубуйте 30 минут при комнатной температуре.
  4. Удалите раствор K2HPO 4 и добавьте 100 мкл 150 мМ K2HPO4 с 0,1 мг/мл анилин-синего. Накройте пластину на 96 лунок крышкой и алюминиевой фольгой и инкубуйте на шейкере не менее 2 часов (Arabidopsis) или ночью (ячмень).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анилиновый синий светочувствительный и должен быть изготовлен свежим для каждой технической реплики.
  5. Удалите анилин-синий раствор и замените на 50% глицерин. Накройте пластины на 96 скважин алюминиевой фольгой и храните при 4 °C до готовности к снимку.
  6. Капли раствора 50% глицерина на чистое стекло. Аккуратно возьмите диск из листьев пинцетом и положите его абаксиальной стороной вверх на затвор. Накройте 1,5-дюймовым заслоном, минимизируя воздушные пузырьки, и при необходимости добавьте дополнительно 50% глицерина, чтобы заполнить под слоем.
  7. Подведите материал листьев в фокус с помощью пропускаемого белого света (яркого поля) под объективом с 20-кратным сухим объективом.
  8. Выберите длину волны возбуждения до 370 нм и длину волны излучения до 509 нм для анилино-синего изображения и установите время экспозиции. Оптимизируйте время экспозиции, чтобы обеспечить достаточный сигнал, но избежать перенасыщения пикселей. Для количественного сравнения изображений убедитесь, что интенсивность лазера и время экспозиции одинаковы для всех биологических репликаций, методов обработки и технических репликаций.
  9. Для каждого листового диска выберите три разных поля зрения и получите изображения для каждого с помощью параметров, установленных в шаге 4.8. Сделайте все изображения с растительным материалом, полностью заполняющим поле зрения с минимальными зонами фона (нерастительный материал). Сделайте изображения на одной Z-плоскости поверхности листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие некоторого предыстории может быть неизбежным, и это можно исправить на последующих этапах количественной оценки изображения. В этом примере изображения делаются с помощью вертикального эпифлуоресцентного микроскопа с ртутной лампой и фильтром DAPI (возбуждение 360/40 нм, эмиссия 460/50 нм). В случаях, когда ртутная лампа недоступна, можно использовать многоволновый светодиодный источник света.
  10. Чтобы количественно определить пятна каллоза по изображениям, скачайте и установите бесплатно доступное программное обеспечение для обработки изображений FIJI, используя инструкции на сайте https://imagej.net/Fiji/Downloads. Откройте FIJI и импортируйте анилино-синие изображения для анализа. Для анализа используйте .tiff файлы с разрешением не менее 300 dpi. Экспортировать файлы изображений в .tiff формате с помощью микроскопа перед анализом или дать FIJI открыть файлы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи может открывать большинство проприетарных типов файлов (например, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
  11. Установите масштаб изображения (нажмите Анализ | Set Scale), используя значения расстояния из установки микроскопа.
  12. Преобразуйте изображение в 32-битный оттенок серого (нажмите Изображение | Тип | 32 бит).
  13. Отрегулировать порог (нажмите на изображение | Корректируйте | Порог), чтобы включать только флуоресцентный сигнал, который представляет анилиновое синее окрашивание, нажимая Auto и вручную регулировав минимальные и максимальные значения на пороговой кривой. После окончательного определения порога нажмите «Подать заявку» | Конвертируй в маску. С помощью программного обеспечения для создания таблиц запишите выбранные пороговые параметры для каждого изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за врождённой автофлуоресценции образцов растений и очищения ткани, порог может различаться между образцами. Для воспроизводимости важно записывать порог каждого изображения и быть последовательным в корректировке пороговых значений между выборками.
  14. Количественно определите количество и размер анилиновых синих пункт с помощью Analyze Particles (нажмите Analyze | Analyze Particles) с использованием стандартных настроек. Для средних значений всех пунктов на изображении выберите «Обобщить » в всплывающем окне, затем нажмите OK.
  15. Скопируйте и вставьте эти результаты из поля Summary в таблицу с пороговыми параметрами для дальнейшего анализа. Значения, включённые в эту количественную оценку, включают Count (количество анилиновых синих пункт), Total Area (общая площадь вединицах 2 анилиновой синей пункты), Средний размер (средний размер вединицах 2 анилиновой синей пункты), %Площадь (процент среднего покрытия вединицах 2 анилиново-голубой флуоресценции по сравнению с общей площадью), Perimeter (средний периметр пункты) и IntDen (показатель флуоресцентной интенсивности анилиново-голубого цвета).
  16. Повторите шаги 4.11-4.15 для всех изображений, полученных во время эксперимента. При закрытии порогового изображения из FIJI выберите «Не сохранять », чтобы не менять пороговую маску.
  17. Если какие-либо изображения содержат область не с растительным фоном, измерьте площадь ткани растения, вручную обведя область с помощью инструментов выбора Polygon или Freehand и измерив площадь (нажмите Analyze | Мера). Скопируйте это значение в таблицу для каждого изображения.
  18. В таблице усредняйте значения трёх изображений из одного биологического репликации. Если некоторые изображения из эксперимента содержат не-растительную область (см. шаг 4.17), исправьте все значения в зависимости от площади растительной ткани на каждом изображении. Например, делите значение Count на площадь растительной ткани для каждого изображения перед построением графиков и статистическими сравнениями.

5. Анализ данных

  1. Оцените качество эксперимента, сравнивая положительные контроли с отрицательными в одной пластине с помощью t-теста. Если положительные контроли не вызвали значительных изменений в стрессовых реакциях, пересмотрите экспериментальные условия, такие как состояние растений, сроки обработки, отрицательный контроль и возможное ухудшение состояния МСМ.
  2. Тестирование значимости
    1. Если все технические копии обработки оцениваются в одной пластине, проанализируйте различия между отдельными методами обработки и отрицательным контролем с помощью стандартных статистических методов, таких как односторонний ANOVA с тестом Тьюки.
    2. Если технические копии обработки оценивались на нескольких пластинах, необходимо нормализовать каждый образец относительно отрицательного контроля, чтобы минимизировать влияние ошибки между пластинами. Разделите каждое значение на среднее по отрицательным контрольным образцам из той же пластины. Нормализованные значения подвергаются стандартным статистическим методам.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью этого метода можно определить, активирует ли МСМ подмножество клеточных стрессовых реакций растений. Результаты этого анализа позволяют количественно оценить активность пероксидазы, утечку ионов и производство каллозы, чтобы определить, вызывает ли МСМ дифференциальные реакции по сравнению с отрицательным контролем. Положительный результат для соединения обозначается значительным отличием от отрицательного контроля, как показано для ионофора с грамиллином, который индуцирует утечку иона и образование каллозы (рисунок 3)2. Включение положительного контроля, такого как 1 мкм flg22, индуцирующего все три реакции, обеспечивает целостность работы завода и экспериментальные условия (см. рисунок 3)11,15. Грамиллин и flg22 растворяются в воде, а гидрофобный сурфактин и токсин Т-2 растворяются в ДМСО. Для подготовки гидрофобных молекул мы сначала готовим запас 10 мМ в DMSO. Этот бульон используется для создания конечной концентрации 10 мкм в воде Milli-Q для обработки листьев, содержащей 0,1% DMSO. Сурфактин (10 мкМ) индуцирует активность пероксидазы и мозолисты, тогда как токсин Т-2 (10 мкм) подавляет активность пероксидазы и стимулирует выработку каллозы, вероятно, из-за гибеликлеток 2,6,16. Использование воды или 0,1% DMSO в качестве отрицательных контролей уместно для указанных методов обработки, так как оба контроля дают схожие результаты (см. рисунок 2).

В наших предварительных скринингах 100 коммерчески доступных МСМ мы видим индукцию каллозы для большинства обследованных нами соединений (>70%), а утечку ионов и активность пероксидазы вызывают меньшее количество соединений (30% и 35%). Большинство этих соединений производятся видами Fusarium , включая семь различных трихотеценов, таких как дезоксиниваленол (DON) и токсин T-2. Хотя продолжается дальнейшее воспроизведение для подтверждения этих результатов, они свидетельствуют о схожих тенденциях с нашими положительными контролями (рисунок 3), где каллозу индуцировали всеми методами лечения, а утечка ионов или пероксидаза была вызвана некоторыми, но не всеми методами лечения.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор процедуры оценки клеточных реакций, вызванных МСМ, у листьев. Листовые диски помещаются в пластину с 96 лунками, содержащую интересующие обработки, а диски проходят вакуумное инфильтрирование. Каждая пластина содержит четыре реплики отрицательного контроля (вода с растворителем) и положительного контроля (flg22 или токсин T-2). Через 4–6 часов проводимость жидкости вокруг листового диска измеряется как количественная оценка утечки ионов. Через 24 часа активность пероксидазы количественно измеряется с помощью колориметрического анализа с использованием жидкости вокруг диска листа, после чего диск листа очищается и обрабатывается для каллозной количественной оценки. Аббревиатура: MSM = вторичный метаболит микробов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Влияние растворителя на утечку ионов, вызванную flg22, или активность пероксидаз. Четыре реплицированных образца Arabidopsis были обработаны 1 мкм flg22 в сочетании с DMSO или метанолом (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Столбчатые графики показывают среднюю проводимость образца через 4 часа или активность пероксидазы (OD 600) через 24 часа после обработки в одном эксперименте (n = 4, SD). Эксперимент повторяли дважды с аналогичными результатами. Значимое отличие от водного контроля было определено t-тестом и отмечено звездочкой (p < 0,05). Сокращения: DMSO = диметилсульфоксид; MeOH = метанол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Индукция утечки ионов, активности пероксидазы или отложения каллозы в дисках листьев арабидопсиса молекулами, полученными из микробов. Методы лечения включали иммуногенный, нетоксичный пептид flg22 (1 мкм), циклические липопептиды грамиллин и сурфактин (10 мкм), а также токсин Т-2 (10 мкм)2,6. Все данные были нормализованы до контроля воды + 0,1% DMSO. Графики с коробкой и усами показывают проводимость образца через 4 часа, активность пероксидазы (OD 600) через 24 часа или количество каллозных отложений через 24 часа в одном эксперименте (n = 4-16 растений). Рамки показывают «x» для отображения значения среднего, а рамки — первый квартиль, медиану и третий квартиль обработки. Самые высокие и наименьшие наблюдения, которые не являются выбросами, обозначены усами (>межквартильный диапазон 1,5x, обозначенный кругами). Существенное отличие от водного контроля отмечено звездочкой и было определено односторонним ANOVA с тестом Туки (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробные сообщества, колонизирующие растения, выделяют различные МСМ для облегчения формирования биопленок, подавления конкурирующих микроорганизмов и влияния на хозяина растения17. В то время как некоторые МСМ не влияют на растение, другие вызывают быструю гибель клеток, подавляют их функцию или индуцируют устойчивостьрастений 17. Некоторые МСМ влияют на устойчивость растений к микробу, производящему МСМ, и устойчивые генотипы можно выбрать на основе нечувствительности кМСМ 2,3,18. Другие МСМ индуцируют системную устойчивость и обеспечивают защиту от микробных патогенов, что используется в сельском хозяйстве для разработки биопротекторных средств для подавленияболезней 8. Для разработки эффективных и устойчивых стратегий улучшения культур крайне важно выявлять полезные МСМ и растительные гены, обеспечивающие оптимальную реакцию на МСМ.

Поиск полезных МСМ осложняется тем, что эти соединения производятся ферментативно, при этом для готового продукта требуется несколькоферментов 2. Это затрудняет определение того, какой ген выбрать для прекращения производства МСМ в рамках генетических исследований. Энзимный биосинтез приводит к множеству структурных вариаций одного и того же МСМ с потенциально разнойбиоактивностью 19. Разделение и очистка этих МСМ для поиска биоактивных молекул может занять много времени или быть невозможным. В некоторых случаях можно очистить только низкие концентрации отдельных МСМ, при этом требуется несколько цикловочистки 2. После получения биоактивного соединения или экстракта можно использовать несколько подходов для понимания того, как микроб может влиять на растение.

Прошлые усилия были сосредоточены на мониторинге влияния МСМ на транскрипционное перепрограммирование или биопротекцию в модельныхрастениях. Для оценки реакций МСМ за пределами модельных установок могут быть полезны высокопроизводительные анализы, фиксирующие ответы на различные МСМ и требующие минимального количества МСМ. Недавние исследования показывают, что вспышки ROS являются распространённой ранней реакцией на МСМ, включая грамиллин, сурфактин, сирингомицин и сирингопептин 2,3,7. Анализ на основе люминола обнаруживает апопластический всплеск ROS, образующийся пероксидазами и оксидазами NADPH, и подвержен высокопроизводительномутестированию 21. К сожалению, внутриклеточная АФЗ, вызванная МСМ, такими как сурфактин, не обнаруживается этимметодом 7. Количественная оценка активности пероксидазы предоставляет более чувствительную альтернативу, чем анализ на основе люминола, для обнаружения временной активации ферментов, производящих ROS, во времястресса 11. Наше наблюдение о том, что сурфактин индуцирует активность пероксидазы, соответствует недавним исследованиям, показывающим, что активность пероксидазы вызывается сурфактином и боверицином при арабидопсисе (см. рисунок 3)2. Кроме того, мы показали, что flg22 и ионофорный грамиллин вызывают утечку ионов, а все протестированные соединения, включая flg22, токсин T-2, сурфактин и грамиллин, вызывают каллозу, как и ожидалось (рисунок 3)2,4,7.

Оценивая несколько ответов внутри одной выборки, мы минимизируем экспериментальные вариации при отдельной оценке каждого из этих признаков и обеспечиваем корреляцию между ними для системных исследований стрессовых реакций растений. Оценка нескольких методов лечения или генотипов в одном экспериментальном блоке также позволяет проводить популяционное фенотипирование для популяционной генетики. Например, похожий подход был использован для идентификации QTL, основанного на выработке ROS, вызванной flg22, вячмене 22. Этот анализ также может использоваться для химических генетических скринингов с целью выявления модуляторов реакций на растительный стресс или для выявления потенциальных биопротекторных МСМ из микробных экстрактов.

Чтобы убедиться, что экспериментальный метод работает в рамках интересующей системы, исследователям следует учитывать следующие факторы и ограничения:

Качество ткани листьев
Убедитесь, что ткань листьев растений не подвергается стрессу перед сбором урожая. Признаки стресса у растений различаются между видами, но обычно включают увядание, пожелтение, покраснение, пятна, чрезмерное скручивание или скручивание листьев. Взятие проб из ткани листьев вызывает ранения, поэтому избегание чрезмерной мацерации ткани снижает фоновые ошибки при обращении.

Виды растений
Этот протокол оптимизирован для использования с ячменем и листьями арабидопсиса. Ячменные листья требуют более длительного окрашивания каллозы, чем Arabidopsis, вероятно, из-за более толстого кутикулярного воска у трав, что увеличивает гидрофобность и ограничивает распространение средств влист 23. Это также может частично объяснить отсутствие индукции активности пероксидазы с помощью нашего метода, хотя мы смогли наблюдать подавление активности пероксидазы токсичными соединениями, аналогично тому, что мы представляли в Arabidopsis (рисунок 3). Мы пытались увеличить количество дисков листьев на образец до 5, скорректировать pH до 5, 6 или 7, увеличить количество вакуумных инфильтраций до 10 и изменить концентрацию субстрата или заменить субстрат нагуаякол 24. Хотя мы наблюдали повышенную активность пероксидазы с увеличением количества дисков листов и циклов инфильтрации, различия между отрицательным контрольным показателем и flg22 оставались незначительными (увеличение на 10% при flg22) или незначительными в разных экспериментах. Известно, что ячмень реагирует на flg22, индуцируя выработку ROS, каллозы и экспрессиюпероксидазы 25,26. В корнях кукурузы белковые экстракты проявляли активность, вызванную MAMP пероксидазой, что говорит о необходимости экстракции белка для обнаружения индукции, а не для обнаружения активности белка, выщелачивающегося из дисков листьев, как это сделано в нашеманализе 24. В нашем анализе ранение явно индуцирует активность пероксидазы в отрицательном контрольном образце, поскольку эта активность исчезает, когда клетки погибают из-за воздействия токсинов. Возможно, что лечение flg22 может вызвать те же пероксидазы, что и ранения, так что будет казаться, что индукция не произошла. В качестве альтернативы наш анализ может быть недостаточно чувствительным для обнаружения тонких изменений, или пероксидазы могут плохо диффундировать в растворе.

Для применения этого протокола к другим видам растений мы рекомендуем использовать описанный метод и включать Arabidopsis в качестве контроля, чтобы убедиться, что протокол работает. Если активность пероксидазы кажется низкой, то увеличение количества дисков листья на образец, увеличение количества вакуумных инфильтраций до 5 или 10 и пробные различные методы обработки, включая другие MAMP, ионофоры или токсин T-2, могут дать положительный результат.

Отрицательные методы контроля
Этот метод зависит от эффективного и соответствующего отрицательного контроля для сравнений. В идеале отрицательный контроль должен содержать тот же фоновый растворитель, что и интересующее лечение MSM, но без MSM. Фоновой растворитель будет водой или оказывает такое же влияние на измеренные напряжения, как и вода. Это практический подход в случаях, когда МСМ уже очищен и может растворяться в выбранном растворителе. При сравнении микробных экстрактов отрицательный контроль может быть побочным продуктом частичной очистки МСМ, содержащего те же фоновые среды, но с пониженной концентрацией МСМ после фракционирования. Или экспериментатор может использовать культурную среду для получения экстракта, содержащего MSM, в качестве отрицательного контроля. В этих более сложных образцах отрицательный контроль может содержать соли, увеличивающие измерение проводимости, или растворители могут подавлять активность пероксидазы (рисунок 2). Чтобы определить, влияют ли соли на результаты утечки ионов, экспериментатор может проверить проводимость отрицательного контроля и образца при отсутствии листового диска, чтобы определить, вызывают ли образец или лист изменения в проводимости. Чтобы определить, влияют ли растворители на реакции пероксидазы, экспериментатор может добавить flg22 в отрицательный контроль и сравнить результат с flg22, растворённым в воде, чтобы определить разницу. Возможно, что растворители, тонированные соединения или избыток солей в негативном контроле могут скрыть влияние МСМ на описанные стрессовые реакции растений, поэтому такой подход не будет удобен во всех сценариях.

Время выборки
Важно начинать лечение утром, так как индуцируемые защитные реакции следуют циркадному циклу и имеют максимальную амплитуду раноутром — 27. По нашему опыту, арабидопсис вызывает утечку иона в ответ на граммиллин быстрее (4 часа), чем ячмень и кукуруза (4–7 ч), поэтому для установления экспериментальныхпараметров 2,28 может потребоваться определённое время. Чувствительность клеток со временем снижается, и мы не рекомендуем проверять стрессовые реакции дольше 30+ часов после лечения.

Концентрация
Концентрация MSM может оказывать нелинейное влияние на индуцирование стрессовых реакций растений, что называетсяхормезисом 20. В зависимости от доступности и растворимости MSM, экспериментаторы в идеале должны тестировать стрессовые реакции растений в различных концентрациях MSM. Типичные концентрации варьируются от 100 нМ до 1 000 мкм как отправнаяточка 2, 11, 20.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансовая поддержка была предоставлена в рамках Sustainable Canadian Agricultural Partnership (#20230098), федерально-провинциально-территориальной инициативы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-аминосалициловая кислотаMillipore Sigma A79809
Вакуумный насос БарнартаArtisan Technology Group400-3910
Микропроводящий зонд COND-905Lazar Research Laboratories Inc.
Пептид FLG22AnaSpecAS-62633
Бесконечный 200PRO FTeCan Group Ltd.30190086
СурфактинСигма-ОлдричS3523
Токсин T-2Cayman Chemical Company Inc20433

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annu Rev Phytopathol. 55 (1), 109-137 (2017).
  2. Brauer, E. K., et al. A cyclic lipopeptide from Fusarium graminearum targets plant membranes to promote virulence. Cell Rep. 43 (7), 114384(2024).
  3. Thoms, D., et al. Innate immunity can distinguish beneficial from pathogenic rhizosphere microbiota. bioRxiv. , (2023).
  4. Nishiuchi, T., et al. Fusarium phytotoxin trichothecenes have an elicitor-like activity in Arabidopsis thaliana, but the activity differed significantly among their molecular species. Mol Plant Microbe Interact. 19 (5), 512-520 (2006).
  5. Schellenberger, R., et al. Apoplastic invasion patterns triggering plant immunity: plasma membrane sensing at the frontline. Mol Plant Pathol. 20 (11), 1602-1616 (2019).
  6. Henry, G., Deleu, M., Jourdan, E., Thonart, P., Ongena, M. The bacterial lipopeptide surfactin targets the lipid fraction of the plant plasma membrane to trigger immune-related defence responses. Cell Microbiol. 13 (11), 1824-1837 (2011).
  7. Pršić, J., et al. Mechanosensing and sphingolipid-docking mediate lipopeptide-induced immunity in Arabidopsis. bioRxiv. , (2023).
  8. Crouzet, J., et al. Biosurfactants in plant protection against diseases: rhamnolipids and lipopeptides case study. Front Bioeng Biotechnol. 8, 1014(2020).
  9. Khan, P., et al. Luminol-based chemiluminescent signals: clinical and non-clinical application and future uses. Appl Biochem Biotechnol. 173, 333-355 (2014).
  10. Schenk, S. T., Schikora, A. Staining of callose depositions in root and leaf tissues. Bio-protoc. 5 (6), e1429(2015).
  11. Mott, G. A., Desveaux, D., Guttman, D. S. A high-sensitivity, microtiter-based plate assay for plant pattern-triggered immunity. Mol Plant Microbe Interact. 31 (5), 499-504 (2018).
  12. Hatsugai, N., Katagiri, F. Quantification of plant cell death by electrolyte leakage assay. Bio-protoc. 8 (5), e2758(2018).
  13. Zhang, X. H., Yu, X. Z., Yue, D. M. Phytotoxicity of dimethyl sulfoxide (DMSO) to rice seedlings. Int J Environ Sci Technol. 13, 607-614 (2016).
  14. Mannan, A., et al. DMSO triggers the generation of ROS leading to an increase in artemisinin and dihydroartemisinic acid in Artemisia annua shoot cultures. Plant Cell Rep. 29, 143-152 (2010).
  15. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant J. 18 (3), 265-276 (1999).
  16. Jourdan, E., et al. Insights into the defense-related events occurring in plant cells following perception of surfactin-type lipopeptide from Bacillus subtilis. Mol Plant Microbe Interact. 22 (4), 456-468 (2009).
  17. Raaijmakers, J. M., De Bruijn, I., Nybroe, O., Ongena, M. Natural functions of lipopeptides from Bacillus and Pseudomonas: more than surfactants and antibiotics. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1037-1062 (2010).
  18. vábová, L., Lebeda, A. In vitro selection for improved plant resistance to toxin-producing pathogens. J Phytopathol. 153 (1), 52-64 (2005).
  19. Mousa, W. K., Raizada, M. N. The diversity of antimicrobial secondary metabolites produced by fungal endophytes: an interdisciplinary perspective. Front Microbiol. 4, 65(2013).
  20. Bektas, Y., Eulgem, T. Synthetic plant defense elicitors. Front Plant Sci. 5, 804(2015).
  21. Saeed, B., Trujillo, M. Analysis of immunity-related oxidative bursts by a luminol-based assay. Environ Responses Plants: Methods Protoc. , 339-346 (2022).
  22. Brauer, E. K., et al. Transcriptional and hormonal profiling of Fusarium graminearum-infected wheat reveals an association between auxin and susceptibility. Physiol Mol Plant Pathol. 107, 33-39 (2019).
  23. Taylor, P. The wetting of leaf surfaces. Curr Opin Colloid Interface Sci. 16 (4), 326-334 (2011).
  24. Mika, A., Boenisch, M. J., Hopff, D., Lüthje, S. Membrane-bound guaiacol peroxidases from maize (Zea mays L.) roots are regulated by methyl jasmonate, salicylic acid, and pathogen elicitors. J Exp Bot. 61 (3), 831-841 (2010).
  25. Brauer, E. K., et al. Transcriptional profiling and genetic mapping of barley responses to bacterial flagellin. Mol Plant Microbe Interact. 38 (2), 344-352 (2025).
  26. Takáč, T., et al. TALEN-based HvMPK3 knock-out attenuates proteome and root hair phenotypic responses to flg22 in barley. Front Plant Sci. 12, 666229(2021).
  27. Kim, M. G., Macoy, D. M., Lee, J. Y., Cha, J. Y., Kim, W. Y. Interactions between plant immunity, temperature, light, and circadian rhythm. J Plant Biochem Physiol. 9, 260(2021).
  28. Bahadoor, A., et al. Gramillin A and B: cyclic lipopeptides identified as the nonribosomal biosynthetic products of Fusarium graminearum. J Am Chem Soc. 140 (48), 16783-16791 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

96Arabidopsis

Похожие статьи