Создание и оценка мышиной модели коронарного артериита, вызванного болезнью Кавасаки, индуцированной водорастворимым экстрактом Candida albicans

Болезнь Кавасаки (БК), форма синдрома слизисто-кожных лимфатических узлов, является аутоиммунным заболеванием, возникающим у детей до 5 лет и сопровождающимся фебрильным васкулитом ^1,2,3. Исследования показывают, что нелеченные или длительные курсы лечения при тяжелой БК продолжительностью более 10 дней склонны вызывать серьезные сердечно-сосудистые осложнения, в основном включая коронарные аневризмы и стеноз коронарных артерий ^4,5. Разрыв коронарных аневризм может привести к кардиогенному шоку или даже внезапной смерти, что является основной причиной приобретенных пороков сердца у детей ^6,7. Несмотря на то, что внутривенное введение иммуноглобулина значительно улучшило прогноз, его этиология и патогенез остаются неясными, что ограничивает разработку таргетных терапевтических стратегий ^8,9. Поэтому создание животных моделей, которые могут точно моделировать характеристики заболеваний человека, стало насущной необходимостью для текущих исследований.

В настоящее время основным препятствием в исследованиях болезни Кавасаки является отсутствие хорошо охарактеризованных животных моделей, которые полностью повторяют патологию болезни человека. Среди различных моделей, разработанных в настоящее время, модель васкулита, индуцированного экстрактом клеточной стенки Lactobacillus casei (LCWE), является относительно зрелой системой, и эта модель может вызывать коронарный артериит. Он широко используется для изучения механизма иммунной дисрегуляции и специфических цитокинов в KD-подобных васкулитах^10,11. Модель васкулита, индуцированного водорастворимым экстрактом Candida albicans (CAWS), также привлекла большое внимание из-за ее высокого сходства с патологическими особенностями болезни Кавасаки^{у человека 12,13}. После систематической оптимизации и усовершенствования несколькими исследовательскими группами модель, индуцированная CAWS, превратилась в важный инструмент^{для исследования болезни} Кавасаки. Несмотря на то, что CAWS может вызывать воспаление коронарных артерий посредством внутрибрюшинной инъекции, он имеет ограничения в том, что не может полностью воспроизвести точный патологический процесс васкулита KD человека. Например, при поздней патологии KD¹⁵ человека нейтрофилы не были обнаружены, но инфильтрация нейтрофилов все же происходила в этой модели до 16 недель после введения CAWS¹⁶. Кроме того, механизм васкулита, вызванного CAWS, в настоящее время полностью не выяснен, что ограничивает глубокое понимание и применение модели⁹. Данное исследование направлено на создание стандартизированной животной модели БК путем оптимизации протокола индукции CAWS, выяснения механизма заболевания и содействия разработке таргетной терапии.

В этом исследовании использовалась CAWS для создания более стандартизированной животной модели болезни Кавасаки. С помощью систематических экспериментов по оптимизации дозы было определено, что внутрибрюшинное введение 8 мг в сутки в течение пяти дней подряд является оптимальным режимом введения. Этот режим может стабильно индуцировать поражение коронарных артерий, сохраняя при этом высокую выживаемость у животных. Кроме того, мы дополнительно изучили роль митохондриальной дисфункции в формировании фиброза во время хронической фазы БК, уделяя особое внимание возможному механизму потенциал-зависимого анионного канала 1 (VDAC1), ключевого белка, регулирующего митохондриальный апоптоз, во время перехода от воспаления к фиброзу¹⁷. Стоит отметить, что с помощью анализа совместной локализации аутофагосом/лизосом в этом исследовании в этой модели наблюдалась аномальная функция аутофагии. Эта оптимизированная модель является важным инструментом для систематического изучения патогенеза поражения коронарных артерий при болезни Кавасаки и оценки новых стратегий лечения.

Все исследовательские эксперименты с использованием данных на животных были одобрены комитетом по этике Народной больницы Хуайань No 1 Нанкинского медицинского университета (KY-2024-250-01). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка CAWS

1. Инокулируйте Candida albicans в бульон декстрозы Сабуро в соответствии с протоколом, установленным Duong et ^al.18. Затем инокулированный бульон культивируют анаэробно при 37 °С в течение 48 ч в герметичной анаэробной камере с газовой смесью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения стерильности питательной среды необходимо строго контролировать условия анаэробного культивирования при 37 °C для предотвращения загрязнения различными бактериями.
2. Многократно промыть С-ограничивающей средой и инкубировать при 37 °C в течение 48 ч при скорости вращения 4,5 x g.
3. Добавьте равное количество безводного этанола и дайте настояться в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Центрифугируйте при 4,5 х г в течение 15 минут при 4 °C, удалите надосадочную жидкость, добавьте в осадок равное количество безводного этанола и оставьте на ночь при температуре 4 °C.
5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в осадок 50 мл ацетона, центрифугируйте и высушите осадок. Растворите осадок в стерильном обычном физрастворе для последующего использования.

2. Построение мышиной модели болезни Кавасаки

1. Выберите восемьдесят самцов C57BL/6 класса SPF в возрасте 4-6 недель и разместите их в контролируемых условиях со свободным доступом к пище и воде.
   Примечание: Чтобы свести к минимуму потенциальное влияние колебаний уровня эстрогена на иммунные и воспалительные реакции, в этом^{предварительном исследовании по} установлению модели и характеризации использовались только самцы мышей.
2. Разделите мышей на 4 группы равномерно по методу таблицы случайных чисел, включая 3 группы инъекций CAWS с различными дозами (4 мг, 8 мг, 12 мг) и 1 контрольную группу с нормальным физиологическим раствором, по 20 мышей в каждой группе.
3. Приготовьте порошок CAWS в трех концентрациях: 40 мг/мл, 80 мг/мл и 120 мг/мл с использованием стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). В опытную группу вводят 0,1 мл CAWS в утренние часы с 1-го по 5-й день эксперимента, а контрольной группе по той же схеме вводят равное количество нормального физиологического раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинное введение проводили с помощью инсулинового шприца объемом 1 мл. Во время работы расположите мышь так, чтобы голова была ниже, а хвост выше, чтобы предотвратить повреждение таких органов, как толстый и тонкий кишечник, при введении шприца.
4. Используйте электронные весы в 9 часов утра каждый день, чтобы одновременно взвесить оставшийся корм в кормушке и рассчитать 24-часовое потребление корма для каждой клетки с мышами.
5. На 3-й, 7-й, 14-й и 28-й дни после последней инъекции случайным образом выберите и принесите в жертву по 3 мыши из каждой группы в каждую временную точку.
6. Поместите мышей в закрытую камеру, предварительно заполненную комнатным воздухом. Вводите сжатый_CO2 со скоростью потока 30% от объема камеры в минуту. Через 5 минут был выполнен вывих шейки матки для подтверждения смерти.
7. Соберите и взвесьте образцы сердца. Наблюдайте за воспалительными поражениями сердца и кровеносных сосудов с помощью окрашивания HE.

3. Стандарты окрашивания и классификации HE

1. Сердце и дуга аорты (около 3 мм × 3 мм) были быстро изолированы. Выполнить срединную стернотомию по описанному методу²⁰. Быстро отделите сердце от дуги аорты (около 3 мм × 3 мм). Собранные ткани фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение 24 ч.
2. После фиксации обезвоживайте ткани с помощью градуированного этанола (70% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч и 100% этанола в течение 1 ч), очистите их в ксилоле и замесите в парафин. Наконец, разделите блоки на непрерывные срезы по 5 мкм.
3. Для окрашивания H&E срезы окрашивают гематоксилином в течение 5 мин, промывают в проточной воде в течение 10 мин, противопоставляют эозином в течение 2 мин, а затем приступают к обезвоживанию и монтажу²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от степени повреждения сосудистой интимы он классифицируется на три степени: I степень в основном характеризуется отеком эндотелия и агрегацией нейтрофилов; II степень проявляется в виде дегенерации гладкой мускулатуры, воспалительной инфильтрации клеток и повреждения органелл; Степень III проявляется тяжелыми поражениями, такими как эндотелиальный некроз и отслаивание, а также отложение фибрина.

4. Трихромное окрашивание по Массону

1. После фиксации обезвоживайте образцы тканей с помощью градуированного этанола, очищенного в ксилоле и погруженного в парафин.
2. После депарафинизации увлажните срезы с помощью сортированного этанола до дистиллированной воды для подготовки к окрашиванию.
3. Окрашивайте ядра гематоксилином железа Вейгерта в течение 5 минут, тщательно промойте под проточной водой, а затем окрашивайте цитоплазму фуксином красной кислоты Lichun в течение 5 минут.
4. Дифференцировать с 1% фосфомомолибдовой кислотой в течение 1 мин, затем непосредственно окрашивать коллагеновые волокна анилиновым синим в течение 3 мин. Быстро смойте 1% ледяной уксусной кислотой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Строго контролируйте время этапа дифференцировки, чтобы обеспечить специфичность окрашивания.
5. После обезвоживания этанолом и ксилолом, став прозрачными, запечатайте нейтральную пленку.
6. Промойте испачканные участки под проточной водой, чтобы удалить излишки красителя.
7. Обезвожьте срезы с помощью сортированного этанола, очищенного в ксилоле, и смонтируйте с нейтральной камедью.
8. Наблюдайте за срезами под световым микроскопом при постоянном увеличении. Коллагеновые волокна должны казаться синими, мышечные волокна и цитоплазма – красными, а ядра – темно-синими.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Зафиксируйте срезы клеток или тканей и заблокируйте 5% BSA на 1 ч, чтобы уменьшить неспецифическое связывание.
2. В качестве вторичного антитела используйте обычную сыворотку того же видового происхождения, разбавьте ее PBS в соотношении 1:10 и капните на образец. Закупорьте его при комнатной температуре на 30 минут. После запечатывания аккуратно дважды промойте PBS.
3. Инкубируйте срезы с первичным антителом в течение ночи при 4 °C. После промывки PBS добавьте флуоресцентное вторичное антитело и инкубируйте в темноте в течение 1 ч.
4. Окрашивание сердечника DAPI, герметизация антизакалочным монтажным агентом и наблюдение под конфокальной микроскопией.

6. Иммуногистохимия

1. После депарафинизации и гидратации парафиновых срезов проводят репарацию антигена и блокируют эндогенную пероксидазу.
2. Инкубация антител и развитие цвета: сначала блокируйте обычной сывороткой, затем инкубируйте первичное антитело и меченное HRP вторичное антитело в последовательности, и, наконец, развитие цвета DAB. Контролируйте степень реакции под микроскопом.
3. Повторно окрашивают ядра клеток гематоксилином. После обезвоживания и прозрачности запечатайте пластины и наблюдайте за коричневато-желтым положительным сигналом под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте необходимо настроить контроль и строго контролировать условия восстановления и развития цвета.

7. Обнаружение аутолизосом

1. Совместно культивируют макрофаги RAW264.7 со спорами Candida albicans в соответствующей пропорции (10:1) и инкубируют при 37 °C и 5%_CO2 в течение 4 ч, 8 ч, 12 ч, 16 ч, 20 ч, 24 ч, 28 ч, 32 ч, 36 ч, 40 ч, 44 ч и 48 ч для создания фагоцитарной модели.
2. Трижды промыть предварительно охлажденным PBS для удаления нефагоцитарных спор.
3. Сначала заблокируйте образцы 5% BSA на 30 минут. Затем последовательно инкубируют с первичным антителом против LC3 (разведение 1:200) при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем с меченным Alexa Fluor 488 вторичным антителом при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Добавьте зонд лизосомы Lyso-Tracker Red непосредственно в клетки для визуализации лизосомальной локализации. Наконец, противопоставьте ядра DAPI (1 мкг/мл) в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс операции должен проводиться в темноте, чтобы обеспечить точный контроль времени инкубации и концентрации антител.

Первоначально мы систематически оценивали патологические изменения миокарда, индуцированные различными дозами CAWS у мышей. Смертельных исходов не наблюдалось в контрольной группе PBS, группе 4 мг CAWS и группе 8 мг CAWS (n=20 в каждой группе). Напротив, воспалительная реакция в группе 4 мг была легкой и не соответствовала требованиям моделирования. Смертность была выше в группе 12 мг CAWS (9/20, 45%), а смертность наступила с 3-го по 10-й день после инъекции. Эти данные свидетельствуют о том, что доза 12 мг может вызвать чрезмерное местное воспалительное повреждение и системную токсичность. Поэтому эта доза была исключена из последующих исследований. Доза 8 мг в конечном итоге была выбрана в качестве оптимального режима дозирования, поскольку она может эффективно индуцировать значительный коронарный артериит, сохраняя при этом приемлемую выживаемость и минимальные местные побочные реакции. (Рисунок 1А). В конце концов, было определено, что внутрибрюшинное введение 8 мг CAWS является оптимальной моделирующей дозой. Результаты окрашивания ПЭ опытной группы показали типичный динамический процесс воспаления и фиброза. На третьи сутки произошла фокальная воспалительная инфильтрация, состоящая в основном из периваскулярных нейтрофилов и моноцитов. К седьмым суткам воспалительный диапазон расширился до интерстиция миокарда, что сопровождалось значительным отеком клеток миокарда и интерстициальным отеком. На 14-е сутки воспаление достигло своего пика, и произошло нарушение расположения волокон миокарда и очаговый некроз. На 28-й день, хотя воспаление было облегчено, сформировался ранний фиброз (Рисунок 1Б и Рисунок 2А). Напротив, структура миокарда оставалась нормальной во все моменты времени в контрольной группе. Все результаты были подтверждены с помощью двойной слепой оценки, которая подтвердила, что доза 8 мг CAWS может стабильно индуцировать модель повреждения миокарда, соответствующую характеристикам болезни Кавасаки.

Впоследствии был использован метод трехцветного окрашивания Массона для изучения того, приведет ли вызванный CAWS васкулит, похожий на болезнь Кавасаки, к стойкому фиброзу, окружающему коронарные артерии (КА). Результаты эксперимента показали, что в группе инъекций CAWS мышей были обнаружены явные отложения коллагеновых волокон вокруг стенок воспаленных коронарных артерий и аорты, и эти фиброзные участки сильно совпадали с местами распределения воспалительной клеточной инфильтрации. Напротив, у мышей в контрольной группе PBS наблюдалось только слабое окрашивание коллагеном, которое было ограничено нормальным структурным диапазоном сосудистой стенки (рис. 2A). Количественный анализ показал, что значительное отложение коллагеновых волокон произошло через 14 дней, а степень фиброза статистически отличалась от таковой в контрольной группе (рис. 2C).

Учитывая, что центральным патологическим изменением при болезни Кавасаки является иммуновоспалительная реакция сосудистой стенки, которая включает скоординированное действие множественных иммунных клеток22,23, далее мы исследовали характерные изменения иммунного микроокружения в модели CAWS посредством иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания. На 14-е сутки после введения CAWS было проведено окрашивание маркеров иммунных клеток IF на сердечных тканях мышей, которым вводили CAWS. Результаты эксперимента показали, что на 14-й день моделирования на мышах в группе лечения CAWS инфильтрация CD3+ Т-клеток, CD8+ цитотоксических Т-клеток, макрофагов типа CD86+ M1, макрофагов F4/80+ и естественных киллеров NK1.1+ в коронарных артериях и тканях миокарда была значительно увеличена по сравнению с контрольной группой PBS (рис. 2B,D). Систематический анализ изменений экспрессии этих иммунных маркеров не только подтвердил, что модель CAWS может точно моделировать иммунологические характеристики болезни Кавасаки у человека, но и, что более важно, выявил возможный механизм различных подмножеств иммунных клеток в возникновении и развитии заболевания, обеспечив теоретическую основу для последующей разработки стратегий целевого иммунного вмешательства.

Исследования установили, что митохондриальная дисфункция является ключевым механизмом, лежащим в основе фиброза миокарда 24,25,26. Признано, что при воспалительном стрессе потенциал-зависимый анионный канал 1 (VDAC1), критически важный белок для контроля качества митохондрий, может вызывать аномальное открытие переходных пор митохондриальной проницаемости (mPTP) при повышении его экспрессии. Это, в свою очередь, индуцирует апоптоз и активирует фибробласты17,27. Чтобы изучить этот механизм, мы оценили экспрессию VDAC1 в хронической фазе с помощью иммуногистохимии. Наши результаты показали, что по сравнению с контрольной группой PBS, экспрессия белка VDAC1 в ткани миокарда мышей в группе, получавшей CAWS, была значительно повышена через 28 дней после моделирования (рис. 3). Положительные сигналы были преимущественно локализованы в фиброзных областях и вокруг кровеносных сосудов, что указывает на то, что VDAC1-опосредованная митохондриальная дисфункция может способствовать фиброзу миокарда в модели болезни Кавасаки. Эти данные предоставляют экспериментальные данные о молекулярных механизмах повреждения миокарда, вызванного CAWS.

Предыдущие исследования показали, что VDAC1-опосредованная митохондриальная дисфункция участвует в процессе фиброза миокарда при болезни Кавасаки, но ее конкретный механизм до сих пор не выяснен. Учитывая, что поддержание митохондриального гомеостаза зависит от нормальной функции аутофагии-лизосомальной системы. Мы предполагаем, что VDAC1 может усугублять фиброз, влияя на образование или функцию аутофаголизосом, что приводит к аномальному накоплению митохондрий. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала создали модель споровой инфекции Candida albicans в макрофагах (RAW264.7) (рис. 4) и обнаружили динамические изменения аутофагического потока и лизосомальной активности в модели. Экспериментальные результаты показывают, что образование лизосом аутофагии увеличивается на ранней стадии (в течение 2-3 ч после клеточной инфекции), в то время как аутофагический поток блокируется на более поздней стадии (через 3-4 ч после клеточной инфекции). Изменение потока аутофагии можно оценить по изменению окрашивания слиянием после совместной локализации аутофагосомы и лизосомы. Этот результат подтверждает, что дисфункция аутофаголизосом действительно может привести к нарушению клеточного клиренса.

Рисунок 1: Гистопатологический анализ сердца и коронарных артерий. (A) Кривые выживаемости мышей, которым вводили PBS или различные дозы CAWS (4 мг, 8 мг и 12 мг; n = 20 в группе). (B) Были представлены результаты окрашивания сердца методом HE в группе лечения CAWS (8 мг) в разные моменты времени (3 дня, 7 дней, 14 дней, 28 дней). Масштабные линейки: 1500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Анализ коллагенового фиброза и инфильтрации иммунных клеток. (A) Результаты окрашивания по методу Массона в группе CAWS 8 мг и контрольной группе. Коллагеновые волокна имеют характерный синий цвет, мышечные волокна и цитоплазма – красный, а клеточное ядро – темно-синего. Стрелками обозначены споры грибка. Масштабные линейки: 1500 мкм. (B) Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания группы CAWS 8 мг и контрольной группы (CD3-меченые CD3+ Т-клетки, CD8 меченые CD8+ цитотоксические Т-клетки, CD86 меченые макрофаги типа CD86+ M1, F4/80 меченые F4/80+ макрофаги и NK1.1 меченые NK1.1+ естественные киллеры). Масштабные линейки: 200 мкм. (C) Оцените степень сердечного фиброза. Степень фиброза сердца оценивали на основе процента площади трихроматического окрашивания в сердечной ткани поля зрения при 800-кратном увеличении. Конкретный метод заключается в следующем: поскольку коллагеновые волокна окрашены в ярко-зеленый цвет высокомолекулярными анионными красителями, наблюдалось 100 полей зрения при 800-кратном увеличении (все срезы толщиной 5 мкм), а степень сердечного фиброза определялась по процентному соотношению зеленого участка в общей площади. Чем выше процент, тем тяжелее фиброз. (D) Процентное содержание иммунных клеток статистически анализировалось по результатам иммунофлуоресцентного окрашивания,***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Иммуногистохимический анализ экспрессии VDAC1 в группе PBS и группе CAWS на 28-й день. (A) Иммуногистохимический анализ экспрессии VDAC1. Масштабная линейка: 800 μм. Коричнево-черные частицы являются положительными результатами. (B) Статистический анализ процентного соотношения иммуногистохимически положительных клеток VDAC1, p < 0,001. (C) Статистический анализ H-критерия иммуногистохимии VDAC1. Данные были получены из нескольких биологических репликат (n = 20 мышей в группе), а результаты были выражены в виде среднего значения ± стандартного отклонения и статистически проанализированы (***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Обнаружение аутолизосомы после фагоцитоза Candida albicans клетками мыши RAW264.7. (A) Стрелками обозначены споры грибов. Масштабные линейки: 25 μм. Изменение потока аутофагии можно оценить по изменению окрашивания слиянием после совместной локализации аутофагосомы и лизосомы. (B) Анализ скорости образования автолизосом во времени позволяет количественно определить соответствующие параметры. Результаты были выражены в виде среднего значения ± стандартного отклонения и статистически проанализированы (***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.