Создание и оценка мышиной модели коронарного артериита, вызванного болезнью Кавасаки, индуцированной водорастворимым экстрактом Candida albicans

Краткое содержание

Мышиная модель, индуцированная CAWS, эффективно моделирует прогрессирование болезни Кавасаки от острого воспаления до хронического фиброза, выявляя ключевые патологические и иммунопатологические особенности, и может способствовать разработке целевых терапевтических стратегий для болезни Кавасаки.

Аннотация

Болезнь Кавасаки (БК) является системным васкулитом, поражающим в первую очередь детей, причем поражение коронарных артерий является его наиболее тяжелым осложнением. В этом исследовании была создана оптимизированная мышиная модель БК с использованием водорастворимого экстракта Candida albicans (CAWS). Воспаление миокарда и связанные с ним патологические изменения оценивали с помощью окрашивания HE и трихромного окрашивания по Массону. Метод иммунофлуоресценции обнаружил инфильтрацию иммунных клеток в сердечной ткани. Экспрессия и локализация белка VDAC1 в ткани миокарда были выявлены с помощью иммуногистохимии. Фагоцитарная модель in vitro была создана путем совместного культивирования макрофагов RAW264.7 со спорами Candida albicans , а образование и функция аутофаголизосом оценивались с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания LC3 и зонда Lyso-Tracker Red. С помощью дозового скрининга было определено, что 8 мг является оптимальной модельной дозой для индуцирования воспаления коронарных артерий, с умеренным уровнем смертности при этой дозе. Окрашивание HE показало, что инъекция CAWS стабильно индуцировала поражения коронарных артерий, соответствующие характеристикам болезни Кавасаки у мышей. Окрашивание Массона подтвердило, что в группе мышей CAWS наблюдалось значительное отложение коллагеновых волокон вокруг коронарных артерий и аорты, которое близко совпадало с воспалительной зоной, и статистически значимая разница наблюдалась по сравнению с контрольной группой через 14 дней (p < 0,001). Иммунофлюоресценция показала, что на 14-е сутки моделирования инфильтрация множественных иммунных клеток в сердечной ткани группы CAWS значительно увеличилась (p < 0,001). Иммуногистохимические результаты показали, что на 28-е сутки моделирования экспрессия белка VDAC1 в ткани миокарда в группе CAWS была достоверно повышена (p < 0,001). Эксперименты in vitro показали, что в макрофагах, инфицированных спорами Candida albicans , образование аутофаголизосом увеличивается на ранней стадии, в то время как аутофагический поток блокируется на более поздней стадии, что указывает на функциональное расстройство.

Введение

Болезнь Кавасаки (БК), форма синдрома слизисто-кожных лимфатических узлов, является аутоиммунным заболеванием, возникающим у детей до 5 лет и сопровождающимся фебрильным васкулитом ^1,2,3. Исследования показывают, что нелеченные или длительные курсы лечения при тяжелой БК продолжительностью более 10 дней склонны вызывать серьезные сердечно-сосудистые осложнения, в основном включая коронарные аневризмы и стеноз коронарных артерий ^4,5. Разрыв коронарных аневризм может привести к кардиогенному шоку или даже внезапной смерти, что является основной причиной приобретенных пороков сердца у детей ^6,7. Несмотря на то, что внутривенное введение иммуноглобулина значительно улучшило прогноз, его этиология и патогенез остаются неясными, что ограничивает разработку таргетных терапевтических стратегий ^8,9. Поэтому создание животных моделей, которые могут точно моделировать характеристики заболеваний человека, стало насущной необходимостью для текущих исследований.

В настоящее время основным препятствием в исследованиях болезни Кавасаки является отсутствие хорошо охарактеризованных животных моделей, которые полностью повторяют патологию болезни человека. Среди различных моделей, разработанных в настоящее время, модель васкулита, индуцированного экстрактом клеточной стенки Lactobacillus casei (LCWE), является относительно зрелой системой, и эта модель может вызывать коронарный артериит. Он широко используется для изучения механизма иммунной дисрегуляции и специфических цитокинов в KD-подобных васкулитах^10,11. Модель васкулита, индуцированного водорастворимым экстрактом Candida albicans (CAWS), также привлекла большое внимание из-за ее высокого сходства с патологическими особенностями болезни Кавасаки^{у человека 12,13}. После систематической оптимизации и усовершенствования несколькими исследовательскими группами модель, индуцированная CAWS, превратилась в важный инструмент^{для исследования болезни} Кавасаки. Несмотря на то, что CAWS может вызывать воспаление коронарных артерий посредством внутрибрюшинной инъекции, он имеет ограничения в том, что не может полностью воспроизвести точный патологический процесс васкулита KD человека. Например, при поздней патологии KD¹⁵ человека нейтрофилы не были обнаружены, но инфильтрация нейтрофилов все же происходила в этой модели до 16 недель после введения CAWS¹⁶. Кроме того, механизм васкулита, вызванного CAWS, в настоящее время полностью не выяснен, что ограничивает глубокое понимание и применение модели⁹. Данное исследование направлено на создание стандартизированной животной модели БК путем оптимизации протокола индукции CAWS, выяснения механизма заболевания и содействия разработке таргетной терапии.

В этом исследовании использовалась CAWS для создания более стандартизированной животной модели болезни Кавасаки. С помощью систематических экспериментов по оптимизации дозы было определено, что внутрибрюшинное введение 8 мг в сутки в течение пяти дней подряд является оптимальным режимом введения. Этот режим может стабильно индуцировать поражение коронарных артерий, сохраняя при этом высокую выживаемость у животных. Кроме того, мы дополнительно изучили роль митохондриальной дисфункции в формировании фиброза во время хронической фазы БК, уделяя особое внимание возможному механизму потенциал-зависимого анионного канала 1 (VDAC1), ключевого белка, регулирующего митохондриальный апоптоз, во время перехода от воспаления к фиброзу¹⁷. Стоит отметить, что с помощью анализа совместной локализации аутофагосом/лизосом в этом исследовании в этой модели наблюдалась аномальная функция аутофагии. Эта оптимизированная модель является важным инструментом для систематического изучения патогенеза поражения коронарных артерий при болезни Кавасаки и оценки новых стратегий лечения.

Протокол

Все исследовательские эксперименты с использованием данных на животных были одобрены комитетом по этике Народной больницы Хуайань No 1 Нанкинского медицинского университета (KY-2024-250-01). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка CAWS

1. Инокулируйте Candida albicans в бульон декстрозы Сабуро в соответствии с протоколом, установленным Duong et ^al.18. Затем инокулированный бульон культивируют анаэробно при 37 °С в течение 48 ч в герметичной анаэробной камере с газовой смесью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения стерильности питательной среды необходимо строго контролировать условия анаэробного культивирования при 37 °C для предотвращения загрязнения различными бактериями.
2. Многократно промыть С-ограничивающей средой и инкубировать при 37 °C в течение 48 ч при скорости вращения 4,5 x g.
3. Добавьте равное количество безводного этанола и дайте настояться в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Центрифугируйте при 4,5 х г в течение 15 минут при 4 °C, удалите надосадочную жидкость, добавьте в осадок равное количество безводного этанола и оставьте на ночь при температуре 4 °C.
5. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, добавьте в осадок 50 мл ацетона, центрифугируйте и высушите осадок. Растворите осадок в стерильном обычном физрастворе для последующего использования.

2. Построение мышиной модели болезни Кавасаки

1. Выберите восемьдесят самцов C57BL/6 класса SPF в возрасте 4-6 недель и разместите их в контролируемых условиях со свободным доступом к пище и воде.
   Примечание: Чтобы свести к минимуму потенциальное влияние колебаний уровня эстрогена на иммунные и воспалительные реакции, в этом^{предварительном исследовании по} установлению модели и характеризации использовались только самцы мышей.
2. Разделите мышей на 4 группы равномерно по методу таблицы случайных чисел, включая 3 группы инъекций CAWS с различными дозами (4 мг, 8 мг, 12 мг) и 1 контрольную группу с нормальным физиологическим раствором, по 20 мышей в каждой группе.
3. Приготовьте порошок CAWS в трех концентрациях: 40 мг/мл, 80 мг/мл и 120 мг/мл с использованием стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl). В опытную группу вводят 0,1 мл CAWS в утренние часы с 1-го по 5-й день эксперимента, а контрольной группе по той же схеме вводят равное количество нормального физиологического раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внутрибрюшинное введение проводили с помощью инсулинового шприца объемом 1 мл. Во время работы расположите мышь так, чтобы голова была ниже, а хвост выше, чтобы предотвратить повреждение таких органов, как толстый и тонкий кишечник, при введении шприца.
4. Используйте электронные весы в 9 часов утра каждый день, чтобы одновременно взвесить оставшийся корм в кормушке и рассчитать 24-часовое потребление корма для каждой клетки с мышами.
5. На 3-й, 7-й, 14-й и 28-й дни после последней инъекции случайным образом выберите и принесите в жертву по 3 мыши из каждой группы в каждую временную точку.
6. Поместите мышей в закрытую камеру, предварительно заполненную комнатным воздухом. Вводите сжатый_CO2 со скоростью потока 30% от объема камеры в минуту. Через 5 минут был выполнен вывих шейки матки для подтверждения смерти.
7. Соберите и взвесьте образцы сердца. Наблюдайте за воспалительными поражениями сердца и кровеносных сосудов с помощью окрашивания HE.

3. Стандарты окрашивания и классификации HE

1. Сердце и дуга аорты (около 3 мм × 3 мм) были быстро изолированы. Выполнить срединную стернотомию по описанному методу²⁰. Быстро отделите сердце от дуги аорты (около 3 мм × 3 мм). Собранные ткани фиксировали в 10% нейтральном буферном формалине в течение 24 ч.
2. После фиксации обезвоживайте ткани с помощью градуированного этанола (70% этанола в течение 1 ч, 80% этанола в течение 1 ч, 95% этанола в течение 1 ч и 100% этанола в течение 1 ч), очистите их в ксилоле и замесите в парафин. Наконец, разделите блоки на непрерывные срезы по 5 мкм.
3. Для окрашивания H&E срезы окрашивают гематоксилином в течение 5 мин, промывают в проточной воде в течение 10 мин, противопоставляют эозином в течение 2 мин, а затем приступают к обезвоживанию и монтажу²¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от степени повреждения сосудистой интимы он классифицируется на три степени: I степень в основном характеризуется отеком эндотелия и агрегацией нейтрофилов; II степень проявляется в виде дегенерации гладкой мускулатуры, воспалительной инфильтрации клеток и повреждения органелл; Степень III проявляется тяжелыми поражениями, такими как эндотелиальный некроз и отслаивание, а также отложение фибрина.

4. Трихромное окрашивание по Массону

1. После фиксации обезвоживайте образцы тканей с помощью градуированного этанола, очищенного в ксилоле и погруженного в парафин.
2. После депарафинизации увлажните срезы с помощью сортированного этанола до дистиллированной воды для подготовки к окрашиванию.
3. Окрашивайте ядра гематоксилином железа Вейгерта в течение 5 минут, тщательно промойте под проточной водой, а затем окрашивайте цитоплазму фуксином красной кислоты Lichun в течение 5 минут.
4. Дифференцировать с 1% фосфомомолибдовой кислотой в течение 1 мин, затем непосредственно окрашивать коллагеновые волокна анилиновым синим в течение 3 мин. Быстро смойте 1% ледяной уксусной кислотой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Строго контролируйте время этапа дифференцировки, чтобы обеспечить специфичность окрашивания.
5. После обезвоживания этанолом и ксилолом, став прозрачными, запечатайте нейтральную пленку.
6. Промойте испачканные участки под проточной водой, чтобы удалить излишки красителя.
7. Обезвожьте срезы с помощью сортированного этанола, очищенного в ксилоле, и смонтируйте с нейтральной камедью.
8. Наблюдайте за срезами под световым микроскопом при постоянном увеличении. Коллагеновые волокна должны казаться синими, мышечные волокна и цитоплазма – красными, а ядра – темно-синими.

5. Иммунофлюоресцентное окрашивание

1. Зафиксируйте срезы клеток или тканей и заблокируйте 5% BSA на 1 ч, чтобы уменьшить неспецифическое связывание.
2. В качестве вторичного антитела используйте обычную сыворотку того же видового происхождения, разбавьте ее PBS в соотношении 1:10 и капните на образец. Закупорьте его при комнатной температуре на 30 минут. После запечатывания аккуратно дважды промойте PBS.
3. Инкубируйте срезы с первичным антителом в течение ночи при 4 °C. После промывки PBS добавьте флуоресцентное вторичное антитело и инкубируйте в темноте в течение 1 ч.
4. Окрашивание сердечника DAPI, герметизация антизакалочным монтажным агентом и наблюдение под конфокальной микроскопией.

6. Иммуногистохимия

1. После депарафинизации и гидратации парафиновых срезов проводят репарацию антигена и блокируют эндогенную пероксидазу.
2. Инкубация антител и развитие цвета: сначала блокируйте обычной сывороткой, затем инкубируйте первичное антитело и меченное HRP вторичное антитело в последовательности, и, наконец, развитие цвета DAB. Контролируйте степень реакции под микроскопом.
3. Повторно окрашивают ядра клеток гематоксилином. После обезвоживания и прозрачности запечатайте пластины и наблюдайте за коричневато-желтым положительным сигналом под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте необходимо настроить контроль и строго контролировать условия восстановления и развития цвета.

7. Обнаружение аутолизосом

1. Совместно культивируют макрофаги RAW264.7 со спорами Candida albicans в соответствующей пропорции (10:1) и инкубируют при 37 °C и 5%_CO2 в течение 4 ч, 8 ч, 12 ч, 16 ч, 20 ч, 24 ч, 28 ч, 32 ч, 36 ч, 40 ч, 44 ч и 48 ч для создания фагоцитарной модели.
2. Трижды промыть предварительно охлажденным PBS для удаления нефагоцитарных спор.
3. Сначала заблокируйте образцы 5% BSA на 30 минут. Затем последовательно инкубируют с первичным антителом против LC3 (разведение 1:200) при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем с меченным Alexa Fluor 488 вторичным антителом при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Добавьте зонд лизосомы Lyso-Tracker Red непосредственно в клетки для визуализации лизосомальной локализации. Наконец, противопоставьте ядра DAPI (1 мкг/мл) в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс операции должен проводиться в темноте, чтобы обеспечить точный контроль времени инкубации и концентрации антител.

Результаты

Первоначально мы систематически оценивали патологические изменения миокарда, индуцированные различными дозами CAWS у мышей. Смертельных исходов не наблюдалось в контрольной группе PBS, группе 4 мг CAWS и группе 8 мг CAWS (n=20 в каждой группе). Напротив, воспалительная реакция в группе 4 мг была легкой и не соответствовала требованиям моделирования. Смертность была выше в группе 12 мг CAWS (9/20, 45%), а смертность наступила с 3-го по 10-й день после инъе...

Обсуждение

Аневризмы коронарных артерий (ААА) и фиброз миокарда при БК являются основными причинами отдаленных сердечно-сосудистых событий. Несмотря на прогресс, достигнутый в лечении острой фазы, примерно у 5% пациентов все еще развивается персистирующая КБА^28,29. Механизм этого отсроченного патологического изменения до сих пор неясен, и существует острая потребность в животных моделях, чтобы выявить его динамический^{проце...}

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
вторичное козье антитело к Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Abcam	ab15081	вторичное козье антитело к Rabbit IgG Alexa Fluor 488
Анаэробная камера	Thermo Scientific	Thermo Scientific	Анаэробная камера
Анилиновый синий	Solarbio	G3668	Анилиновый синий
anti-LC3	Abcam	ab192890	первичное антитело против LC3
Кабинет биологической безопасности	Thermo Scientific	1500	Кабинет биологической безопасности
BSA	Solarbio	A8020	BSA
Candida albicans (штамм)	NBRC	1385	Candida albicans (штамм)
CD3e	Бионаука по бакалаврству	561827	FITC Hamster Anti-Mouse CD3e (145-2C11)
CD86	Бионаука по бакалаврству	105013	CD86
CD8a	Бионаука по бакалаврству	100713	CD8a
Инкубатор клеточной культуры	Thermo Scientific	311	Инкубатор клеточной культуры
Центрифуга	Thermo Scientific	ST4R Plus	Центрифуга
Конфокальный микроскоп	Олимп	IX73	Конфокальный микроскоп
DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131-25 мл	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
Машина вложения	P.S.J MEDICAL	BM450A	Машина вложения
Эозин	Solarbio	G1100	Эозин
F4/80	Бионаука по бакалаврству	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
Формальдегид	Solarbio	P1110	Формальдегид
Полностью автоматический сушитель тканей	Leica Biosystems	ASP3005	Полностью автоматический сушитель тканей
Стеклянные микроскопические стекли	Citotest	250124A1	Стеклянные микроскопические стекли
H& E-краситель	Beyotime Biotechnology	C0105M	H& E-краситель
Комплект IHC	Абсиновая биотехнология	abs996-5 мл	Комплект IHC
Зонд LC3	Beyotime Biotechnology	C3018M	Зонд LC3
Низкопрофильные микротомные лезвия	Термо Фишер	3052835	Низкопрофильные микротомные лезвия
Лизосомный зонд	Beyotime Biotechnology	C1046	Лизосомный зонд
Маркерная ручка	Гастроном	SK109	Маркерная ручка
Краситель Массон	Beyotime Biotechnology	C0189M	Краситель Массон
Микротом	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Микротом
Нейтральная резинка	Соларби	G8590	Нейтральная резинка
NK1.1	Бионаука по бакалаврству	561117	NK1.1
Оптический микроскоп	Nikon	Nikon	Оптический микроскоп
Парафин	Solarbio	YA0012	Парафин
Парафин	Solarbio	YA0012	Парафин
PBS	Solarbio	P1020	PBS
Фосфомолибная кислота	Solarbio	G3472	Фосфомолибная кислота
VDAC1	Abcam	ab34726	Anti-VDAC1