Методическая статья

Измерение одноклеточного старения с помощью биомаркера хроматина и эпигенетического старения на основе визуализации

DOI:

10.3791/69057

⸱

30 января 2026 г.

 ,  ,  , 
1Harry Perkins Institute of Medical Research, QEII Medical Centre and Centre for Medical Research, The University of Western Australia, 2Scintillon Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол представляет собой процесс визуализации и вычислительных процессов для извлечения и валидации хроматина и эпигенетического возраста на основе визуализации (ImAge).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для развития персонализированного здравоохранения и оценки потенциальных стратегий омоложения жизненно важны биомаркеры, отражающие биологический возраст. Мы ввели хроматин на основе визуализации и эпигенетический возраст (ImAge) — биомаркер, основанный на визуализации, полученный из пространственной организации хроматина и эпигенетических меток внутри отдельных ядер, фиксируя внутренние возрастные изменения. ImAge эффективно фиксирует и количественно оценивает влияние вмешательств, модулирующих биологическое возрастное время, демонстрируя чувствительность через значительное снижение после стратегий омоложения (таких как ограничение калорий и частичное перепрограммирование через экспрессию временного Oct4, Sox2, Klf4 и Myc (OSKM)) и увеличивается после лечения, таких как химиотерапия. Кроме того, низкий уровень ImAge коррелирует с более высокой локомоторной активностью, что свидетельствует о отражении функциональных улучшений наряду с биологической реверсией возраста, что является перспективным инструментом для оценки вмешательств в развитие долгосрочной жизни. Поскольку ImAge — это интегративный метод, требующий качественной визуализации и тщательного вычислительного анализа, мы стремимся предоставить тщательные рекомендации по его выделению и валидации. Этот комплексный протокол подробно описывает рабочий процесс как для лабораторных процедур (подготовка образцов и визуализация), так и для правильного использования нашего открытого вычислительного конвейера (настройка среды и обработка данных визуализации) для извлечения и валидации ImAge.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Увеличение средней продолжительности жизни и старение глобального населения подчёркивают критическую необходимость эффективных биомаркеров функционального или биологического возраста 1,2,3. Эти биомаркеры необходимы для точного прогнозирования риска заболевания и продолжительности жизни, что может значительно улучшить гериатрическую помощь и снизить связанные с этим расходы. Хотя часы метилирования ДНК (ДНКм) добились значительных успехов в количественной оценке биологического старения 4,5,6, они часто опираются на линейную регрессию и требуют больших когорт, потенциально упуская из виду тонкие, контекстно-зависящие биологические компоненты, специфичные дляиндивидуумов 7,8. Кроме того, эти методы, основанные на секвенировании, требуют лизиса клеток, сложной подготовки образцов и дорогих реагентов для каждой клетки, что делает их более дорогими и сложными для высокопроизводительных, крупномасштабных или продольных исследований, где разрушение образца являетсянедостатком 9.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали хроматин и эпигенетический возраст на основе визуализации (ImAge) — новую технику, предназначенную для количественной оценки старения и омоложения при разрешении одной клетки. Эта техника была применена и подтверждена на периферической крови мышей и различных твёрдых органах, как описано Альварес-Кугленом и др.1. В данной публикации оптимизированные протоколы подробно описаны так, чтобы они могли быть адаптированы и приняты другими исследователями для различных применений.

Этот подход принципиально отличается от традиционных ДНК-часов, фиксируя внутренние возрастные траектории на основе пространственной организации хроматина и эпигенетических отметок внутри одногоядра 1. Методы на основе визуализации имеют явные преимущества: они по своей природе неразрушительны, то есть клетки не разрушаются во время обработки, в отличие от методов секвенирования. Эта неразрушительная природа решающе позволяет сохранять пространственную структуру хроматина и эпигенетических отметок на уровне отдельных клеток, сохраняя пространственный контекст клеток внутри тканей — перспектива, часто теряемая в традиционных процессах секвенирования. Кроме того, методы визуализации обычно более экономически эффективны для крупномасштабных или продольных исследований, так как не требуют дорогих реагентов или сложной библиотечной подготовки для каждой клетки, что делает их подходящими для повторных наблюдений во времени10,11.

Ключевым преимуществом ImAge является способность выявлять возрастные траектории как внутренние основные признаки самих данных, без необходимости регрессии по хронологическому возрасту. ImAge продемонстрировала тесную корреляцию с хронологическим возрастом у периферических мононуклеарных клеток крови мышей и различных твёрдыхорганах 1. Ключевым является то, что ImAge эффективно фиксирует ожидаемые нарушения биологического возраста, показывая увеличение после химиотерапии и снижение калорийного ограничения и частичного перепрограммирования за счёт временной экспрессии OSKM в печени и скелетных мышцах. Кроме того, показания ImAge были обратно коррелируют с локомоторной активностью у хронологически идентичных мышей, что указывает на их полезность для измерения аспектов биологического и функционального возраста.

Внедрение методологии ImAge требует экспертизы как в экспериментальных процедурах влажнойлаборатории 12 , так и в вычислительноманализе 1 (рисунок 1); Поэтому в данной статье представлены комплексные, пошаговые протоколы для обоих аспектов. Этот оптимизированный протокол направлен на облегчение широкого внедрения ImAge, позволяя исследователям изучать возрастные изменения хроматина и эпигенетической организации с одноклеточным разрешением различных типов клеток и тканей. В этом протоколе были выбраны H3K27ac и H3K27me3 — два маркера, обеспечивающие достаточный контраст и разрешение для определения ImAge, — как репрезентативные показатели. Исследователи могут воспроизвести этот протокол для количественной оценки биологического старения, оценки влияния вмешательств по обеспечению долголетия и изучения врождённой гетерогенности процессов старения и омоложения на уровне отдельных организмов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами и протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Института исследований Скриппса (Протокол 09-0004-6). Данные, представленные в этой рукописи, были получены с помощью самцов мышей i4F возрастом от 2 до 14 месяцев. Органы, представляющие интерес (печень и скелетные мышцы), были взяты из i4F в возрасте 13,8 месяцев, а мыши из помёта проходили лечение в течение 1 недели низкой дозой доксициклина (0,2 мг/мл)14. Ядра были выделены из образцов молодых (3,2 месяца), возраста (13,8 месяца) и обработанных доксициклином для переэкспрессии факторов OSKM (возрастной OSKM).

1. Визуализация образцов

  1. Подготовка образца
    1. Соберите интересующие органы (печень и скелетные мышцы) у свежепрепарированных мышей (или других видов интереса) и мгновенно заморозьте жидким азотом. Храните образцы при -80 °C до готовности к использованию.
    2. Перенесите органы и ткани в предварительно охлаждённую ступку и положите на сухой лёд. Вылейте жидкий азот на замороженную ткань и измельчите с помощью предварительно охлаждённого пестика. Измельчите образец в предварительно охлаждённой ступке и пестике, пока не получится равномерно мелкий порошок.
    3. Аликвот измельчите ткани с помощью предварительно охлаждённой металлической лопатки в несколько пробирок и храните неиспользованные образцы при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы измельчённой ткани в пробирках можно хранить при -80 °C или проводить изоляцию ядер.
    4. Извлекайте ядра из замороженных аликвотов с помощью коммерчески доступного комплекта Nuclei Lysis Buffer согласно инструкциям производителя.
    5. Считайте ядра с помощью Trypan Blue. Смешайте ядра и Trypan Blue в равных пропорциях в отдельной трубке. Перенесите 10 мкл раствора Nuclei-Trypan Blue на гемоцитометр или автоматический счётчик клеток.
    6. Разбавлять образцы в PBS + 0,5% BSA, чтобы 10 000 ядер можно было покрыть в объёме 20-30 мкл/скважину.
  2. Подготовка подачи
    1. Введите все соответствующие метаданные для подготовки покрытия и вычислительного анализа в Platemap (предоставленный в дополнительном файле 1). Запишите идентификаторы образца (например, номера или символы) в том же расположении, что и сама пластина ямы, во вкладке sampleID. Фиксируйте экспериментальные условия, включая возраст образца, в той же структуре, что и сама пластина скважины во вкладке состояния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информация, предоставленная во вкладке состояния, будет использована для определения возрастной группы каждой выборки (то есть молодых или пожилых). Эти выявленные возрастные группы впоследствии станут эталоном для построения модели прогнозирования старения (ImAge). Поэтому вкладка состояния должна содержать данные, связанные с возрастом, а также другие релевантные экспериментальные условия по мере необходимости.
    2. Запишите целевые биомаркеры (например, H3K27me3) в той же структуре, что и фактическая пластина скважины, в вкладке канала# (# заменяется числом). Проверьте, что все комбинации метаданных совпадают и корректно отражаются в одном последовательном формате таблицы на вкладке platemap.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый столбец в таблице должен соответствовать назначенному имени вкладки (например, «sampleID»). Для документирования целей проекта и деталей окрашивания предоставлена дополнительная вкладка под названием «метаданные»; Эта информация не будет использоваться при анализе данных. Используйте эту вкладку по мере необходимости.
    3. Экспортировать карту пластинки вкладки в формате csv-файла с коротким, описательным названием проекта (например, project.csv).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладка метаданных предоставляет шаблон для обобщения целей проекта и информации об иммунокрашении. Использование вкладки метаданных в шаблоне Platemap является необязательным для самого процесса покрытия. Однако для вычислительного анализа требуются другие вкладки, включая sampleID, канал# (# заменяется числом).
  3. Пластина 10 000 ядер/колодец в объёме 20–30 мкл в пластине скважины (например, пластины с 384 лунками). Вращение на 1000 x g (ускорение девять, замедление 4) в течение 10 минут при 4 °C.
  4. Фиксируйте объём 1:1 с 8% параформальдегидом (PFA) в PBS на 10 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Проводите шаги PFA в вытяжке и утилизируйте отходы в соответствии с институциональными мерами безопасности.
  5. Удалите раствор. Добавьте 30 мкл глицина 0,1 м в PBS на 5 минут при комнатной температуре. Удалите раствор. Помойте 100 мкл PBS дважды и добавьте 30 мкл PBS для хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно хранить при 4 °C или сразу приступать к иммуномаркировке.
  6. Иммуномаркировка
    1. Уберите PBS. Добавьте 30 мкл блокирующего раствора (2% BSA и 0,5% Triton X-100 в PBS) и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Уберите раствор для блокировки.
    2. Добавьте 25 мкл первичных антител: Mouse anti-H3K27ac (1:250) и Rabbit anti-H3K27me3 (1:250), разбавленных в блокирующем буфере (0,4–2 мкг/мл). Инкубировать на ночь при 4 °C.
    3. Удалите первичный раствор антител. Мойте с 100 мкл PBS 3 раза в течение 3 минут при комнатной температуре.
    4. Добавьте 25 мкл вторичных антител: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) и Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250), разбавленных в блокирующем буфере (1–10 мкг/мл). Инкубировать 2 часа при 4 °C или 1 час при комнатной температуре.
    5. Мойте с 100 мкл PBS 3 раза в течение 3 минут при комнатной температуре. Окрашивание DAPI/Hoechst в 30 мкл концентрации 0,01 мг/мл. Стирайте 100 мкл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните тарелку при 4 °C в фале или немедленно приступайте к визуализации. DAPI/Hoechst необходим для этапа сегментации ядер.
  7. Визуализация
    1. Ячейки изображения на камере с высоким содержанием для максимального разрешения (для этого набора данных использовалось 20x, но рекомендуется 63x).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя изображение может выполняться с любым изображением с высоким содержанием, этот протокол предполагает плоскую структуру папок из полученных изображений и общий формат изображения (например, .tiff) в качестве полученного изображения (рисунок 2).
    2. Собирайте несколько полей на одну яме и несколько z-стеков, желательно покрывая ядра ядер от верхнего до нижнего размера. Покрытие 10 мкм вместе с осью z (например, 20 z-срезов с шагом 0,5 мкм z) обычно охватывают большинство ядер мышиных клеток. Размер и необходимое покрытие зависят от видов и типов клеток, представляющих интерес. Репрезентативная визуализация показана на рисунке 3.
    3. Перенесите данные изображения на компьютер, где будет проводиться вычислительный анализ, следуя структуре папок, показанной на рисунке 2.
    4. Добавьте префикс с аннотированной квадратной скобкой имени проекта, определённого на шаге 1.2.2 выше, в папку с данными изображения (например, [проект]original_folder_name)

2. Вычислительный анализ данных изображения

  1. Подготовка требований к системному программному обеспечению (требуется только для начальной настройки)
    1. Установите Windows Subsystem for Linux (WSL), если вы работаете на Windows-компьютере, следуя инструкциям в https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Установите Anaconda или Miniconda, следуя инструкциям в https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
  2. Подготовка вычислительной среды (требуется только для начальной настройки)
    1. Скачайте скрипты рабочих процессов с репозитория github https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Распаковайте загруженный файл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Место хранения данных может быть назначено произвольно; однако рекомендуется выбрать каталог, отличный от местоположения системного хранилища файлов (например, диск C в Windows).
    2. Организуйте клонированный репозиторий ImAge так, чтобы он соответствовал предполагаемой структуре папок для правильного выполнения скриптов (рисунок 2).
    3. Открытое приложение терминала, если работает на Linux или macOS. Откройте приложение WSL, если вы работаете на Windows.
    4. Переименуйте папку в клонированный файл репозитория. Далее термин Command: обозначает инструкцию для копирования и вставки следующего кода в приложение терминала, после чего следует нажатие клавиши Enter .
      Команда: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замените «/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY» на пользовательскую настановку. Например, когда репозиторий распакован в папке «analysis» диска D и получен доступ с WSL, тогда это будет «/mnt/d/analysis».
    5. Создайте новую вычислительную среду на Python версии 3.10, используя conda (командное приложение, установленное с Anaconda/miniconda).
      Команда: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
    6. Активируйте новосозданную среду.
      Команда: conda активировать ImAge_workflow
    7. Установите poetry (менеджер пакетов на Python) с помощью pip installer (установщик python package installer установлен при создании среды ImAge_workflow).
      Команда: pip install poetry
    8. Установите необходимые пакеты на Python с помощью поэзии.
      Команда: установка поэзии
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что текущая папка — это папка ImAge_workflow, что можно проверить, выполнив команду: pwd.
    9. Настройте CUDA в среде Conda для включения функционала графического процессора (GPU) на этапе сегментации для более быстрых вычислений (применимо только для Linux или Windows PC с Nvidia GPU).
      Команда: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir in $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; do if [ -d "$dir/lib" ]; затем экспортировать LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты автоматически обнаруживают доступность GPU на сервере. Если видеокарты отсутствуют, по умолчанию будет работать на процессоре.
  3. Выполните вычисления, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислительный анализ состоит из четырёх этапов: сегментация ядер, извлечение элементов изображения, построение осей старения (ImAge) и прогнозирование ImAge. Каждый процесс выполняется с помощью скриптов на Python; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features и o4_ImAge_validation. Все эти шаги включены в один скрипт на Python, main.py. Извлеченные показания ImAge можно визуализировать с помощью графика в виде коробки и скрипки, как показано в Рисунок 4. Считывание ImAge также может быть извлечено в простом формате таблицы (стандартный .csv формат файла), при этом образцы представлены строками, а соответствующие считывания и метаданные — столбцами. Пользователи имеют гибкость выполнять дополнительные числовые анализы показаний ImAge по мере необходимости. Эти графики и CSV-файл можно получить, используя один скрипт на Python, visualization.py. Процесс прогнозирования ImAge использует сигналы, полученные от отдельных клеток в одной ткани. Эти bootstrapped сигналы представляют собой усредненные сигналы, полученные случайным выборкой и повторяющимися итерациями. Этот подход направлен на то, чтобы анализ фиксировал наиболее надёжные и репрезентативные показания, при этом неопределённость анализа пропорциональна врождённой гетерогенности ткани.
    1. Открытое приложение терминала, если работает на Linux или macOS. Откройте приложение WSL, если вы работаете на Windows.
      Команда: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что текущая папка — это папка ImAge_workflow, что можно проверить, выполнив команду: pwd.
    2. Активируйте окружение.
      Команда: conda активировать ImAge_workflow
    3. Настройте параметры анализа для workflow/main.py файла в коде или текстовом редакторе (например, приложение Notepad, Microsoft Visual Studio Code и т.д.).
      1. Установите имя проекта в переменной p на короткий, безопасный для файловой системы идентификатор, используемый для организации выходов (например, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Задайте список каналов для извлечения признаков в chs. Включайте сегментационный канал, если для анализа необходимы особенности этого канала (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Отображайте идентификаторы каналов изображений от имён файлов к столбцам карт с помощью imageIndex. Определите формат меток канала, используемый системой визуализации для получения данных изображения, и используйте эту метку как ключ. Сопоставьте каждую метку с точным, чувствительным к регистру заголовок столбца в картографе, сохранённым в шаге 1.2.2 (например, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
        ВНИМАНИЕ: Имена столбцов чувствительны к регистру и должны соответствовать вашему файлу с картой номеров.
      4. Установите расположения данных: orgDataLoadPath — к корню набора данных, orgDataSubFolder — в подпапку изображения при необходимости, а resultsSavePath — к выходному корню.
      5. Подтвердите расширение имени файла в imageFileFormat и отредактируйте imageFileRegEx, чтобы использовать группы захвата с именами на Python для всех необходимых частей: row, col, field, zposition и channel. Используйте следующий синтаксис: (? P\d+), где GROUP заменяется на ряд, перевал, поле, zposition или канал.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обновите регулярные выражения, если имена файлов различаются; все названные группы должны правильно анализировать. Например, имя файла r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff следует преобразовать в следующее: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P<поле>\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Установите сегментационный канал в segmentation_ch на ядерный канал, используемый для обнаружения объектов (например, segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Решите, использовать ли коррекцию освещения, установив illumiCorrection. Установите на True для вычисления и применения моделей BaSiC; установлен на False для обработки raw изображений.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластин с ≥ 25 ямы рекомендуется коррекция освещения для уменьшения систематического смещения.
      8. Установить физический размер вокселя в микрометрах в voxel_dim как [z, y, x]. Используйте метаданные микроскопа для определения расстояния между ними (например, voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6]). Сохраните файл и закройте редактор после проверки каждого параметра
    4. Запускайте скрипты для получения показаний ImAge и проведения валидации. Во время запуска скрипта не закрывайте терминал или приложение WSL.
      Команда: Python workflow/main.py
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт (main.py) охватывает все этапы, включая сегментацию, извлечение признаков, построение осей ImAge и предсказание по умолчанию. Скрипт генерирует предполагаемое время завершения каждого шага (например, сегментация ядер). Каждый процесс (например, o1_illumination_correction) генерирует промежуточные файлы в формате .pickle, содержащие результаты каждого процесса. Однако это предназначено исключительно для передачи данных между процессами с целью обеспечения стандартизированной обработки и не предназначено для манипуляций пользователем в данной статье. Тем не менее, если пользователям нужно обрабатывать или внедрять эти файлы, смотрите документацию, включённую в каждую функцию Python для формы данныхи типов 13.
    5. Визуализируйте результаты и экспортируйте сырые показания ImAge для дополнительного анализа на внешнем ПО. Команда: Python workflow/visualization.py
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе получаются рисунки и таблицы показаний ImAge, а файлы расположены соответственно на fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN и export_o4_ImAge_validation (рисунок 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные изображения должны быть хорошо заполнены для получения отдельных клеток, но отдельные ядра не должны соприкасаться друг с другом, так как это ухудшает качество сегментации ядер клеток. Рисунок 3 показывает репрезентативную визуализацию для получения надёжных результатов вычислительного анализа.

Результаты, изложенные в этой рукописи методов, адаптированы из рукописи ImAge Альвареса-Куглена и др.1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подготовка образца
Для подготовки образца немедленно соберите интересующие ткани и немедленно заморозьте их в жидком азоте. При измельчении тканей ступкой и пестиком можно использовать силиконовую крышку для ступки, чтобы предотвратить потерю образца. Добавьте больше жидкого азота, если ткань трудно измельчать. Для более хрупких тканей образцы также можно обрабатывать свежими (а не замораживаемыми), чтобы уменьшить механические повреждения или повреждение тканей. Прот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех нынешних и бывших членов лаборатории Терсих за помощь в создании протоколов и вычислительной структуры. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R21 AG068913, R21 AG075483, R21 AG083782 и Фондом исследований и инноваций в области будущего здравоохранения Департамента здравоохранения Западной Австралии, BU/PG: 01760/47004300 для A.V.T.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычий сывороточный альбуминSigma-Aldrich A9647
Высокоадсорбируемое вторичное антитело против мышей IgG (H+L), Alexa 488 ИнвитрогенA-21202
Высокоадсорбируемое вторичное антитело IgG против кроликов (H+L), Alexa 555ИнвитрогенA-31572
ГлицинБио-Рад161-0718
Антитела к гистону H3K27ac (mAb) Активный мотив39685
Антитела к гистону H3K27me3 (pAb) Активный мотив39155
Hoechst 33342ИнвитрогенH3570
Набор для изоляции ядер: подготовка к ядрам EZСигма-ОлдричNUC101
Оперетта CLS Высококонтентный имиджРеввитиhttps://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Параформальдегид 16% водный раствор EM GradeНауки об электронной микроскопии15710-С
PBSТермо ФишерAM9624
Микропластина PhenoPlate с 384 лункамиРеввити6057302
Triton-XSigmaT8787
Трипан Синий раствор, 0,4% Gibco 15250061 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez-Kuglen, M., et al. ImAge quantitates aging and rejuvenation. Nat Aging. 4, 1308-1327 (2024).
  2. Zampino, M., et al. Biomarkers of aging in real life: three questions on aging and the comprehensive geriatric assessment. GeroScience. 44 (6), 2611-2622 (2022).
  3. Moqri, M., et al. Biomarkers of aging for the identification and evaluation of longevity interventions. Cell. 186 (18), 3758-3775 (2023).
  4. Bell, C. G. DNA methylation aging clocks: challenges and recommendations. Genome Biol. 20 (1), 249(2019).
  5. Horvath, S., Raj, K. DNA methylation-based biomarkers and the epigenetic clock theory of ageing. Nat Rev Genet. 19 (6), 371-384 (2018).
  6. Field, A. E., et al. DNA methylation clocks in aging: Categories, causes, and consequences. Mol Cell. 71 (6), 882-895 (2018).
  7. Galow, A. M., Peleg, S. How to slow down the ticking clock: Age-associated epigenetic alterations and related interventions to extend life span. Cells. 11 (3), 468(2022).
  8. Westneat, D. F., Wright, J., Dingemanse, N. J. The biology hidden inside residual within-individual phenotypic variation. Biol Rev Camb Philos Soc. 90 (3), 729-743 (2015).
  9. Lähnemann, D., et al. Eleven grand challenges in single-cell data science. Genome Biol. 21 (1), 31(2020).
  10. Ninomiya, K. ImAge: quantifying epigenetic ageing with single-cell images. Nat Rev Cancer. 25, 755(2025).
  11. Stepanov, A. I. Genetically encoded epigenetic sensors for visualization of H3K9me3, H3K9ac and H3K4me1 histone modifications in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150715(2024).
  12. Farhy, C., et al. Improving drug discovery using image-based multiparametric analysis of the epigenetic landscape. Elife. 8, e49683(2019).
  13. ImAge_workflow. , https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow (2025).
  14. Chondronasiou, D., et al. Multi-omic rejuvenation of naturally aged tissues by a single cycle of transient reprogramming. Aging Cell. 21 (3), e13578(2022).
  15. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189 (5), 777-782 (2010).
  16. The Open Microscopy Environment. , bioformats. https://github.com/ome/bioformats (2025).
  17. González-Ramírez, M., et al. Differential contribution to gene expression prediction of histone modifications at enhancers or promoters. PLoS Comput Biol. 17 (9), e1009368(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи