Method Article

Клеточный подтип-специфичный анализ протеасомы нейрональной мембраны в соматосенсорных нейронах

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеасома нейронной мембраны (NMP) была недавно идентифицирована в подмножестве соматосенсорных нейронов в качестве ключевого регулятора восприятия прикосновения, боли и зуда. В этой статье представлен надежный рабочий процесс анализа экспрессии и функции NMP, специфичных для конкретного типа клеток, с использованием сортировки клеток, профилирования транскриптома и иммунофлуоресцентного анализа на основе культур.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Передача сигналов сенсорных нейронов зависит от функциональных протеасом, а их субклеточная локализация влияет на функцию. Специализированный протеасомный комплекс, протеасома нейрональной мембраны (NMP), был недавно идентифицирован в субпопуляции периферических соматосенсорных нейронов. NMP локализуется исключительно на плазматической мембране сомы и на проксимальном и дистальном аксонах. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) показало, что в нормальных условиях NMP преимущественно экспрессируется в нейронах MrgprA3+ и Cysltr2+, которые опосредуют механическое, зудящее и болевое ощущение. Острое, избирательное ингибирование NMP в коже лап мышей снижало механическую и болевую чувствительность без влияния на тепловые ощущения. Примечательно, что в отличие от глобального ингибирования протеасом, селективное ингибирование NMP не вызывает нейропатии. Исследования in vitro показывают, что NMP способствует коммуникации между нейронами, потенциально за счет высвобождения сигнальных пептидов, и имеет важное значение для нормальных реакций нейронов на стимуляцию. Эти результаты определяют NMP как ключевой регулятор перекрестных помех сенсорных нейронов, необходимых для нормального ощущения прикосновения, боли и зуда. Таким образом, NMP представляет собой потенциальную мишень для лечения боли. В данной статье представлены методы выделения как NMP-экспрессирующих, так и не-NMP-экспрессирующих нейрональных популяций с использованием кормления антителами и флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS). Эти популяции подходят для профилирования экспрессии по типу клеток с помощью scRNA-seq или анализа динамики экспрессии NMP на основе культуры. Вместе эти методы обеспечивают надежный рабочий процесс для изучения динамики экспрессии NMP и ее вклада в заболевания, связанные с болью.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функция протеасом необходима для оптимального развития и поддержания периферической нервной системы (ПНС)1,2,3,4,5,6. Исследования in vitro и in vivo с использованием ингибиторов протеасом показывают, что активность протеасомы имеет решающее значение для развития нервной системы, миелинизации, возбудимости и функции глиальных клеток 7,8,9,10. Кроме того, химиотерапия на основе ингибиторов протеасом вызывает болезненные невропатии у 30-60% пациентов, часто характеризующиеся хронической болью и изменением чувствительности в конечностях 8,9,11,12,13. Интересно, что введение этих же ингибиторов в низких дозах снижает чувствительность к болевым раздражителям, что указывает на сложную роль протеасомы в обработке сенсорных данных. Однако, несмотря на эти обширные исследования, специфическая функция протеасом в ПНС остается малоизученной.

Протеасомы являются основным механизмом деградации белка во всех сферах жизни и необходимы для поддержания гомеостаза белка16. Протеасома ядра 20S состоит из четырех гептамерных колец α, β, β, α субъединиц и опосредует убиквитин-независимую деградацию белка17,18. Ассоциация с регуляторными частицами образует протеасому, покрытую 26S и 30S, которая опосредует убиквитин-зависимую деградацию белка 4,17. В нейронах протеасомы были идентифицированы во всех клеточных компартментах, и известно, что их субклеточная локализация влияет на функцию19. Тем не менее, многие широко используемые ингибиторы протеасом не обладают достаточной специфичностью для избирательного нацеливания на дифференциально локализованные популяции протеасом.

Действительно, с использованием мембранонепроницаемых ингибиторов протеасом и мечения антител в непроницаемых клетках было обнаружено, что нейрон-специфичный комплекс протеасом локализуется на плазматической мембране в подмножестве соматосенсорных нейронов20. scRNA-seq анализ нейронов первичного ганглия дорсального корешка (DRG), разделенных на популяции NMP+ и NMP- с помощью подачи антител против субъединицы протеасомы и сортировки FACS, привел к получению 20 транскрипционно различных клеточных кластеров20. Дальнейший анализ показал, что NMP+ клетки кластеризуются только в 3 из 20 кластеров. Используя наборы генных маркеров для конкретных подтипов нейронов,было идентифицировано 13 различных подтипов соматосенсорных нейронов. Большинство нейронов NMP+ сгруппированы с сенсорными нейронами MrgprA3+ и Cysltr2+ 20. Минимальное количество клеток NMP+ сгруппировалось в третий кластер, в котором не было идентифицировано никаких специфических наборов генов, и поэтому этот кластер остался нераспределенным20. Нейроны MrgprA3+ и Cysltr2+ являются ноцицепторами С-типа, чувствительными к тепловым, механическим и зудящим стимулам, что соответствует подтипам нейронов CGRP-θ и SST соответственно21,22. Из 20 идентифицированных клеточных кластеров 7 NMP-кластеров экспрессировали генные маркеры, соответствующие ненейрональным клеткам, включая шванновские клетки, сателлитную глию и иммунные клетки, и также остались неотнесеннымик 20. Эти клеточные популяции были ожидаемы, так как во время культивирования нейронов DRG20 невозможно отделить ненейрональные клетки от нейронов.

Исследуя его функцию, ингибирование NMP in vitro изменяло возбудимость нейронов к стимуляции KCl, гистамина и αβ-метиленаденозина-5'-трифосфата20. In vivo ингибирование NMP снижает чувствительность к механическим и болевым раздражителям без влияния на тепловые ощущения20. Эти результаты показывают, что NMP является ключевым регулятором механического, болевого и зудящего ощущения, а также потенциальной терапевтической мишеньюдля лечения боли. Тем не менее, специфические механизмы, связывающие активность NMP с развитием боли в различных контекстах заболевания, остаются плохо изученными. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования динамики и функции экспрессии NMP при состояниях, связанных с болью и нейропатией.

В этой статье описывается надежный рабочий процесс (рис. 1) для идентификации и изоляции нейронных популяций NMP+ DRG. Этот подход позволяет исследовать динамику экспрессии NMP для разных типов клеток с помощью сортировки FACS, scRNA-seq и иммуноокрашивания. Эти подходы позволяют проводить анализ экспрессии NMP с высоким разрешением в зависимости от типа клеток, что может быть использовано для исследования роли NMP в норме и различных состояниях, связанных с болью.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные с использованием экспериментальных животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинской школы Стрича Университета Лойолы в Чикаго.

1. Приготовление растворов для сбраживания, сред DRG и сред FACS

  1. Приготовьте полный солевой раствор (CSS), содержащий 137 мМ NaCl, 5,3 мМ KCl, 1 мМ MgCl2·6H2O, 25 мМ сорбита, 10 мМ HEPES и 3 мМ CaCl2·2H2O. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью NaOH и простерилизуйте фильтром.
  2. Приготовьте рабочий раствор смеси ферментов диссоциации тканей (умеренное растирание) путем смешивания 190 мкл исходного раствора (5 мг/мл в Н2О), 84 мкл 50 мМ ЭДТА и 6,5 мл CSS. Подготовить свежий и процедить-простерилизовать перед употреблением.
  3. Приготовьте смесь ферментов диссоциации тканей (низкая тритурация) и папаина, содержащую 190 мкл исходного раствора ферментной смеси, 150 мкл папаина, 84 мкл 50 мМ ЭДТА и 6,5 мл CSS. Подготовить свежий и процедить-простерилизовать перед употреблением.
  4. Готовят раствор BSA/TI/DMEM, смешивая 7,5 мг ингибитора трипсина и 7,5 мг BSA в 5 мл среды DMEM/F12. Готовим свежий и процеживаем-стерилизуем.
  5. Приготовьте нейронную среду DRG, смешав 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин/стрептомицина, 1% глутамина и 2% 50x добавки B27 в 430 мл DMEM/F12.
  6. Приготовьте буфер FACS, смешав 1% FBS, 1x PBS, 25 mM HEPES и 1% пенициллин/стрептомицин в автоклавной воде. Готовим свежий и процеживаем-стерилизуем.
  7. За 24 часа до начала составления протокола нанесите покрытие на две полистирольные трубки с круглым дном объемом 5 мл, наполнив их буфером FACS и поместив их при температуре 4 °C.

2. Приготовление суспензии одноклеточных нейронов DRG

  1. Собрать все ДРГ у 4-6 мышей Р20-Р23 по ранее описанным методам20,23.
  2. Переложите DRG в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 7 мл рабочей смеси ферментов диссоциации тканей (умеренного растирания). Инкубировать при осторожном перемешивании (вращая) при 37 °C в течение 20 минут.
  3. Уменьшите количество ганглиев при 120 × г в течение 2 минут. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и повторно суспендируйте ганглии в 7 мл смеси ферментов диссоциации тканей (низкой растиранности)-рабочего раствора папаина. Инкубировать при осторожном перемешивании (вращая) при 37 °C в течение 15 минут.
  4. Вращайте при 120 × g в течение 2 минут. Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте ганглии в 500 μл раствора BSA/TI/DMEM.
  5. Растирайте ганглии 12-16 раз с помощью пипетки Пастера объемом 1 мл из отполированного огнем.
  6. Отфильтруйте клеточный мусор, пропустив клетки через клеточный фильтр 40 мкм. Промойте ситечко 1 мл раствора BSA/TI/DMEM, чтобы обеспечить сбор всех нейронов DRG. Перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
  7. Отжим при 120 × г в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды DRG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это суспензия одноклеточного нейрона DRG.

3. Подача антител для мечения NMP-положительных нейронов

  1. Разделите суспензию нейрона DRG на две пробирки по 1,5 мл, каждая из которых содержит 500 мкл, и пометьте две пробирки: «первичная» и «без первичной».
  2. Добавьте 20 мкл антитела козьей антипротеасомной 20S субъединицы альфа 2 (PSMA2) в «первичную» меченую пробирку (разведение 1:25).
    1. Необязательно: Для проверки целостности мембраны и специфичности антитела к PSMA2 включите дополнительный образец первичных DRG, инкубированных с тяжелой цепью куриных антинейрофиламентов (NF-H) (1:1000), за которыми последовали вторичные антикуриные (например, 488-конъюгированные) вторичные (1:250) (шаг 3.10).
      Примечание: Контроль мечения анти-NF-H не должен приводить к клеточному мечению, если мембрана нейрона не повреждена.
  3. Инкубируйте клетки при осторожном перемешивании в течение 30 минут при 37 °C.
  4. Теплый фильтрованный, стерилизованный 1x PBS во время первичной инкубации антител.
  5. Центрифугируйте пробирки при 200 × г в течение 2 мин и удалите 90% надосадочной жидкости (выбросьте).
  6. Ресуспендируйте нейроны в 500 мкл теплого 1x PBS. Инкубируйте пробирки с легким перемешиванием в течение 3 минут при 37 °C.
  7. Повторите шаги 3.5-3.6 в общей сложности три стирки.
  8. Во время промывки приготовьте вторичное антитело, разбавив 4 мкл антикозьего IgG (флуорофор с длиной волны 555 нм) в 1000 мкл теплой среды DRG (разведение 1:250).
  9. После третьего промывки ресуспендируйте «первичную» и «непервичную» пробирки в 500 мкл раствора вторичного антитела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента защищайте трубки от света, обернув их алюминиевой фольгой.
  10. Инкубируйте пробирки при осторожном перемешивании в течение 40 минут при 37 °C.
  11. Промойте ячейки, повторяя шаги 3.5-3.6, всего три промывки.
  12. После третьего промывки ресуспендируйте нейроны в 300 мкл буфера FACS. Переложите ресуспендированные элементы в отдельные полистирольные трубки с круглым дном объемом 5 мл и поместите на лед в ведро для льда с крышкой для защиты от света.
  13. Поместите предварительно обработанные пробирки с круглым дном, содержащие буфер FACS за предыдущий день, в ведро со льдом вместе с пробирками, содержащими клетки, и перейдите к этапу сортировки FACS.

4. Разделение NMP-положительных (NMP+) и NMP-отрицательных (NMP-) нейронов с помощью сортировки FACS

  1. Сразу после кормления антителами и мечения нейронов DRG отведите клетки и пробирки с покрытием в сортировщик FACS.
  2. Добавьте 7-аминоактиномицин D (7-AAD) (1:1000) в «первичные» и «без первичных» пробирок. Выдерживать 10-30 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 7-AAD используется для исключения мертвых клеток из процесса сортировки.
  3. Извлеките буфер FACS из пробирок, которые были покрыты на ночь, и замените его 1 мл свежего буфера FACS. Эти трубки служат коллекторными трубками для отсортированных нейронов.
  4. Используйте помеченную трубку «без первичной» для установки параметров и стробирования для немеченных нейронов.
  5. Применяйте стробирование прямого рассеяния (FSC) для выделения клеток, соответствующих размеру сенсорных нейронов. Диаметр сенсорных нейронов колеблется от 10 до 50 мкм.
  6. Примените стробирование бокового рассеяния (SSC) для исключения мертвых клеток и мусора (нижнее боковое рассеивание) и для изоляции событий, согласующихся с гранулярностью нейронов DRG (большее боковое рассеивание).
  7. Загрузите «первичную» трубку и установите параметры стробирования, как установлено с образцом «без первичного», чтобы обнаружить немеченые (NMP-) и 555-положительные (NMP+) нейронные популяции.
  8. С помощью сопла 100 мкм и давления сортировки 15-20 фунтов на квадратный дюйм отсортируйте нейроны на 555+ и 555-.
  9. Перейдите к нисходящему анализу отсортированных нейронов.

5. Секвенирование РНК одиночных клеток NMP+ и NMP-нейронов

  1. Переложите отсортированные клетки в пробирки объемом 1,5 мл и положите на лед. Транспортируйте клетки в ядро для секвенирования одиночных клеток.
  2. Выполняйте секвенирование РНК отдельных клеток на нейронах, отсортированных по NMP+ и NMP, на глубине от 30 000 до 100 000 прочтений на клетку.
  3. Анализируйте данные scRNA-seq с помощью различных бесплатных программ для создания клеточных кластеров в соответствии с определенными профилями экспрессии генов. Для получения более подробной информации о шагах анализа и ранее использованных программах обратитесь к Villalón Landeros et al.20.
  4. Составьте список конкретных генных маркеров для идентификации отдельных популяций нейронов с помощью доступных баз данных, таких как https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ или https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
  5. Используйте список конкретных генных маркеров для идентификации полученных клеточных кластеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее проведенный анализ scRNA-seq был проведен независимой консалтинговой компанией (www.cmcherryconsulting.com).

6. Первичные культуры обогащенных NMP+ и NMP-нейронов

  1. За день до эксперимента поместите круглые покровные стекла диаметром 12 мм в культуральный планшет на 24 лунки (1 покровный стакан/лунка) и промойте его 70% этанолом в течение 15 минут. Затем промойте стерильной водой 3 раза и высушите на воздухе в шкафу для стерильных тканей.
  2. Как только покровные стекла высохнут, покройте их 0,1 мг/мл поли-L-лизина гидробромидом (ФАПЧ) и поместите при температуре 4 °C на ночь.
  3. В день эксперимента удалите ФАПЧ, промойте покровные стекла стерильной водой 3 раза и дайте высохнуть в капюшоне для культуры тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ФАПЧ можно сохранить и использовать повторно.
  4. Разведите 10 мкл 1 мг/мл ламинина в 125 мкл среды DRG и распылите 20-30 мкл в центре каждого покровного стекла.
  5. Перед использованием покройте покровные стекла ламинином не менее чем на 40 минут.
  6. Перенесите отсортированные с помощью FACS клетки в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при температуре 200 × г в течение 5 минут для сбора клеток. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте нейроны в 50 мкл теплой среды DRG.
  7. Отсадите ламинин из покровного стекла и дайте ему высохнуть.
  8. Засейте 15-20 мкл ресуспендированных нейронов на каждую покровную крышку. Осторожно переместите планшет с засеянными покровными стеклами в инкубатор для тканевых культур и инкубируйте не менее 30 мин (не более 1 ч), чтобы дать возможность клеткам прилипнуть.
  9. Переместите планшет обратно в колпак для культуры тканей и добавьте 1 мл стерильной теплой среды DRG в каждую лунку, содержащую клетки на покровных стеклах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опустите наконечник пипетки в нижний угол лунки и медленно дозируйте, чтобы не касаться покровного стекла и не повредить ячейки. Слишком быстрое добавление среды может привести к возникновению турбулентности и смещению ячеек.
  10. Поддерживайте культуры при температуре 37 °C с влажностью 5% CO2/95% с 75% сменой среды каждые 2-3 дня.

7. Анализ экспрессии NMP для конкретного типа клетки

  1. Подготовьте культуральный планшет диаметром 140 мм или лоток для иммунофлуоресцентного окрашивания, выстелив его большим куском парапленки.
  2. С помощью стерильных щипцов 5/45 перенесите покровные листы из чашки для культуры тканей на парапленку на лотке для окрашивания, следя за тем, чтобы сторона, содержащая нейроны DRG, была обращена вверх.
  3. Добавьте 100 мкл среды DRG в каждое покровное стекло на парапленке, чтобы предотвратить высыхание клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте жидкости с помощью пипетки медленно по краю покровного стекла.
  4. Разведите первичное антитело козы к ПСМА2 в теплой среде DRG в соотношении 1:20.
  5. С помощью аспиратора с нефильтрованным наконечником P10 медленно удалите фильтрующий материал из покровного стекла, отсасывая от края. Добавьте 100 мкл раствора антител козы против ПСМА2 в покровные стекла и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут.
  6. Осторожно отсасывайте первичный раствор антитела с покровных стекол. Добавьте 100 μL PBS (комнатной температуры) и выдерживайте в течение 3 минут при комнатной температуре для стирки.
  7. Отсадите PBS с покровного стекла и повторите добавление и аспирацию PBS в общей сложности три промывки.
  8. Готовьте вторичное антитело против козы (например, 555-конъюгированное) в теплой среде DRG в разведении 1:250.
  9. После третьей промывки добавьте 100 μл разведенного вторичного антитела в покровный лист и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага вперед защищайте клетки от света.
  10. Отсадите вторичный раствор антитела из покровного стекла и промойте 3 раза, как описано в шагах 7.6-7.7.
  11. Удалите последнюю промывку PBS и зафиксируйте клетки, добавив 100 мкл фиксирующего раствора, содержащего 4% параформальдегида (PFA), 4% сахарозы в 1x PBS. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
  12. Зафиксируйте аспират и промойте 3 раза, повторяя шаги 7.6-7.7.
  13. Проникните в клетки, добавив 100 мкл 0,1% неионогенного детергента (например, Triton X-100) в 1x PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
  14. Аспират проникающего раствора и промыть 3 раза, повторяя шаги 7.6-7.7.
  15. Добавьте 100 μл блокирующего раствора, состоящего из 5% FBS, 5% сыворотки осляка в 1x PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут.
  16. Готовят смесь первичных антител, специфичных для клеток типа нейронов DRG, в соответствии со следующими разведениями в блокирующем растворе: кроличий пептид, связанный с геном антикальцитонина (CGRP) (1:500); изолектин В4, конъюгат биотина (IB4) (1:50); куриный анти-NF-H (1:1000).
    Примечание: Эти антитела не мешают друг другу и могут быть добавлены вместе в одном растворе.
  17. Удалите блокирующий раствор и добавьте первичную смесь антител в покровное стекло. Выдерживать при комнатной температуре в течение 45 минут.
  18. Удалите раствор антитела и промойте 3 раза, повторяя шаги 7.6-7.7.
  19. Приготовьте раствор вторичной смеси антител путем разведения стрептавидина (например, 647-конъюгированного), donkey anti-rabbit (например, 488-конъюгированного) и donkey anti-chicken (например, 405-конъюгированного) до 1:500 каждый.
  20. Удалите последнюю промойку PBS и добавьте 100 мкл раствора вторичного антитела в покровные стекла. Выдерживать при комнатной температуре в течение 45 минут.
  21. Постирайте 3 раза, повторяя шаги 7.6-7.7.
  22. Дополнительно: Приготовьте ядерное окрашивание в концентрации 1-10 мкг/мл. Добавьте 100 μл раствора ядерного красителя, инкубируйте в течение 30 с при комнатной температуре и промойте 2 раза деионизированной водой (diH2O), повторяя шаги 7,6-7,7.
  23. Отберите последний отстойник и с помощью щипцов с тонким наконечником оторвите покровное стекло от парапленки. Промокните лишнюю жидкость, осторожно прикоснувшись краем покровного стекла к безворсовой салфетке.
  24. Поместите каплю монтажной среды объемом 7 мкл на предметное стекло микроскопа. Аккуратно поместите защитное стекло на каплю монтажной среды, убедившись, что ячейки обращены вниз и находятся в контакте со средой.
  25. Поместите предметные стекла микроскопа с покровными стеклами в темный сухой ящик или коробку не менее чем на 1 час для высыхания и запечатайте край покровного стекла. Завершите запечатывание края покровных покрытий быстросохнущим лаком для ногтей и подождите 10-15 минут перед нанесением изображения.
  26. Слайды изображения с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа с вращающимся диском, оснащенного соответствующими светофильтрами, позволяют визуализировать синюю, зеленую, красную и дальнюю красную флуоресценцию.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность различать NMP и внутриклеточные протеасомы основана на подходах к непроницаемому для мембран мечению. Кормление антителами позволяет использовать антитела, специфичные для протеасомной субъединицы, на живых нейронах для маркировки протеасом, доступных только извне клетки. Из-за своих размеров и гидрофильности антитела не могут проникать через интактные клеточные мембраны24. Живые нейроны поддерживают целостность мембраны, предотвращая попадание антител ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеасомы необходимы во всех клетках и могут быть обнаружены во всех компартментах по всей клетке19. Недавнее открытие специализированного протеасомного комплекса, NMP, в нейронах центральных 25,26,27 и периферических20 нервных систем изменило наше нынешнее представление о функции протеасом. Предыдущая работа показала, что NMP функционирует как си...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E.V.L был поддержан стартовыми фондами Чикагской школы медицины Стрича Университета Лойолы. Мы хотели бы поблагодарить Роберта Лэдда за его советы и помощь в работе с FACS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 м буферный раствор HEPES, pH 7,3Качественное биологическое118-089-721Буфер FACS
10x PBSThermo Fisher Scientific70011-044Буфер FACS
16% Параформальдегид (PFA) в исходном растворе; Марка ЭМЭМС15710Фиксирующий раствор
1x Фосфатно-солевой буфер (PBS)Научный центр Фишера10-010-023Смывки FACS
Трубка из полистирола с круглым дном 5 млНаучный центр Фишера14-959-6Трубки FACS
7-Аминоактиномицин D (7-AAD)ИнвитрогенА1310Маркирует мертвые клетки
Доплата B27Thermo Fisher Scientific17504044Питательная среда
Бычий сывороточный альбуминМиллипорСигмаА9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Дигидрат хлорида кальция (CaCl?-2H? O)МиллипорСигмаС7902Полный раствор для использования солевых растворов
Куриная антинейрофиламентная тяжелая цепь (NF-H)МиллипорСигмаАБ5539антитело
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Scientific11320033питательная среда; BSA/TI/DMEM
Ослиный антикозий IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificА32816антитело
Ослиный противокроличий IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificА32790антитело
DyLight 405 ослик против курицыИммуноисследования Джексона703-475-155антитело
ЭДТАМиллипорСигмаЕ5134; CAS: 6381-92-6Рабочие растворы Liberase TM/Liberase TL-папаин
Фетальная бычья сыворотка (FBS)МиллипорСигмаА9647Решение для культуральной среды/буфера/блокировки FACS
Стеклянный пастеровский пипетка, 9 дюймовНаучный центр Фишера1367820Дтитрование
Козий анти-ПСМА2Сделано на собственном предприятииNAантитело
Порошок HEPESМиллипорСигмаН4034Полный раствор для использования солевых растворов
ХёхстThermo Fisher ScientificН21492Ядерное пятно
Сыворотка для лошадейThermo Fisher Scientific26050070Решение для блокировки
IB4, конъюгат биотинаМиллипорСигмаЛ2140антитело
ЛамининСигма-ОлдричЛ2020-1МГБлюдо из культуры
L-глютаминThermo Fisher Scientific25030081Питательная среда
Либераза растирание низкое (TL)МиллипорСигма54010200001Стоковое решение Liberase TL
Либераза растирание умеренная (ТМ)МиллипорСигма5401119001Стоковое решение ТМ Liberase
Гексагидрат хлорида магния (MgCl?-6H? O)МиллипорСигмаМ2393Полный раствор для использования солевых растворов
Монтажный носительSouthernBiotech0100-01Фторомант-Г
ПапаинУортингтонКат#: 9001-73-4Рабочий раствор Liberase TL-papain
Пенициллин/стрептомицинМиллипорСигма15140122культуральная среда/буфер FACS
Поли-L-лизина гидробромид (ФАПЧ)МиллипорСигмаП4707Блюдо из культуры
Хлорид калия (KCl)МиллипорСигмаП5405Полный раствор для использования солевых растворов
Кролик анти-CGRPИммуностар24112антитело
хлорид натрия (NaCl)МиллипорСигмаС9888; CAS: 7647-14-5Полный раствор для использования солевых растворов
СорбитМиллипорСигма56755-МПолный раствор для использования солевых растворов
Стрептавидин Alexa Fluor 647 конъюгатThermo Fisher ScientificС21374антитело
СахарозаСигма-ОлдричС0389-500ГФиксирующий раствор
Ингибитор трипсинаМиллипорСигмаТ9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cartelli, D., Cavaletti, G., Lauria, G., Meregalli, C. Ubiquitin proteasome system and microtubules are master regulators of central and peripheral nervous system axon degeneration. Cells. 11 (8), 1358(2022).
  2. Fortun, J., et al. Impaired proteasome activity and accumulation of ubiquitinated substrates in a hereditary neuropathy model. J Neurochem. 92 (6), 1531-1541 (2005).
  3. Thibaudeau, T. A., Smith, D. M. A practical review of proteasome pharmacology. Pharmacol Rev. 71 (2), 170-197 (2019).
  4. Türker, F., Cook, E. K., Margolis, S. S. The proteasome and its role in the nervous system. Cell Chem Biol. 28 (7), 903-917 (2021).
  5. VerPlank, J. J. S., Lokireddy, S., Feltri, M. L., Goldberg, A. L., Wrabetz, L. Impairment of protein degradation and proteasome function in hereditary neuropathies. Glia. 66 (2), 379-395 (2018).
  6. Moss, A., et al. A role of the ubiquitin-proteasome system in neuropathic pain. J Neurosci. 22 (4), 1363-1372 (2002).
  7. Meregalli, C., et al. Bortezomib-induced painful neuropathy in rats: a behavioral, neurophysiological and pathological study. Eur J Pain. 14 (4), 343-350 (2010).
  8. Meregalli, C. An overview of bortezomib-induced neurotoxicity. Toxics. 3 (3), 294-303 (2015).
  9. Velasco, R., Alberti, P., Bruna, J., Psimaras, D., Argyriou, A. A. Bortezomib and other proteosome inhibitors-induced peripheral neurotoxicity: from pathogenesis to treatment. J Peripher Nerv Syst. 24 (Suppl 2), S52-S62 (2019).
  10. Cavaletti, G., et al. Bortezomib-induced peripheral neurotoxicity: a neurophysiological and pathological study in the rat. Exp Neurol. 204 (1), 317-325 (2007).
  11. Cata, J. P., et al. Quantitative sensory findings in patients with bortezomib-induced pain. J Pain. 8 (4), 296-306 (2007).
  12. Meng, L., et al. Peripheral neuropathy during concomitant administration of proteasome inhibitors and factor Xa inhibitors: identifying the likelihood of drug-drug interactions. Front Pharmacol. 13, 757415(2022).
  13. Mina, S. A., et al. Post-marketing analysis of peripheral neuropathy burden with new-generation proteasome inhibitors using the FDA adverse event reporting system. Turk J Hematol. 38 (3), 218-221 (2021).
  14. Holzer, A. -K., Suciu, I., Karreman, C., Goj, T., Leist, M. Specific attenuation of purinergic signaling during bortezomib-induced peripheral neuropathy in vitro. Int J Mol Sci. 23 (7), 3734(2022).
  15. Meng, L., et al. a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflammatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (18), 10403-10408 (1999).
  16. Maupin-Furlow, J. Proteasomes and protein conjugation across domains of life. Nat Rev Microbiol. 10 (2), 73-82 (2012).
  17. Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu Rev Biochem. 65 (1), 801-847 (1996).
  18. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 Å resolution. Nature. 386 (6624), 463-471 (1997).
  19. Pines, J., Lindon, C. Proteolysis: anytime, any place, anywhere. Nat Cell Biol. 7 (8), 731-735 (2005).
  20. Landeros, E. V., et al. The nociceptive activity of peripheral sensory neurons is modulated by the neuronal membrane proteasome. Cell Rep. 43 (4), 114058(2024).
  21. Qi, L., et al. A mouse DRG genetic toolkit reveals morphological and physiological diversity of somatosensory neuron subtypes. Cell. 187 (6), 1508-1526.e16 (2024).
  22. Sharif, B., Ase, A. R., Ribeiro-da-Silva, A., Séguéla, P. Differential coding of itch and pain by a subpopulation of primary afferent neurons. Neuron. 106 (6), 940-951.e4 (2020).
  23. Krueger, E. R., Church, T. R., Brennan, A., Türker, F., Landeros, E. V. Protocol to study neuronal membrane proteasome function in mouse peripheral sensory neurons. STAR Protoc. 6 (1), 103552(2025).
  24. Chiu, M. L., Goulet, D. R., Teplyakov, A., Gilliland, G. L. Antibody structure and function: the basis for engineering therapeutics. Antibodies. 8 (4), 55(2019).
  25. Ramachandran, K. V., et al. Activity-dependent degradation of the nascentome by the neuronal membrane proteasome. Mol Cell. 71 (1), 169-177.e6 (2018).
  26. He, H. -Y., et al. Neuronal membrane proteasomes regulate neuronal circuit activity in vivo and are required for learning-induced behavioral plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (3), e2216537120(2023).
  27. Paradise, V., et al. ApoE isoforms differentially regulate neuronal membrane proteasomes to shift the threshold for pathological aggregation of endogenous tau. bioRxiv. , (2022).
  28. Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd edn, MIT Press. (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal Membrane ProteasomeSomatosensory NeuronsSensory Neuron SignalingDorsal Root GangliaAntibody FeedingFlow CytometryCell Type SpecificitySingle Cell RNA SequencingProteasome InhibitionPain Sensation

Related Articles