Методическая статья

Моделирование диспластического и функционального восстановления альвеол легких после гриппозной инфекции

898 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69062

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит инструкции по интраназальному введению IAV и последующему анализу повреждения легких мышей и связанных с ним транскрипционных изменений в типах клеток легких.

Аннотация

Вирусная инфекция вызывает как острое, так и долгосрочное повреждение альвеолы легких, специализированной тканевой структуры, отвечающей за газообмен между сердечно-сосудистой системой и внешней средой. Инфекция, вызванная вирусом гриппа А (IAV) у мышей, представляет собой трансляционную модель реакции легких человека на вирусную инфекцию и вызывает как преходящие, так и стойкие изменения состояния клеток в альвеолах. В некоторых случаях аберрантные состояния клеток, вызванные вирусным повреждением, которые не устраняются с течением времени, могут необратимо нарушить критическую функцию газообмена в легких. В данной статье демонстрируются методы интраназального инфицирования мышей A/PR/8/34 IAV и характеристика преходящих и долговременных изменений клеточного состава и структуры тканей поврежденных легких. Эта модель позволяет детально исследовать молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе восстановления легких и хронической дисфункции. Этот подход также предлагает платформу для оценки терапевтических вмешательств, направленных на содействие эффективной регенерации легких и восстановление дыхательной функции после вирусного поражения.

Введение

Легкие играют решающую роль в снабжении местных тканей кислородом и питательными веществами. Эндотелиальные клетки (ЭК), населяющие мелкие капиллярные кровеносные сосуды легких, необходимы для правильного функционирования легочной ткани, поддержания целостности сосудов и эффективного газообмена1. ЭК образуют сосудистую нишу и взаимно взаимодействуют с другими клетками, такими как эпителиальные клетки, иммунные клетки и мезенхимальные клетки. Это способствует регуляции развития легких и восстановлению тканей в ответ на травму или заболевание2.

Инфекция, вызванная вирусом гриппа H1N1, является всемирной проблемой3. У пациентов с инфекцией H1N1 часто диагностируется экссудативное диффузное альвеолярное повреждение (ДАД)4. Инфекция H1N1 может привести к серьезному повреждению легких и тяжелым последствиям, включая пневмонию, тяжелое острое повреждение легких (ОПЛ) и острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС)5. Повреждение в основном происходит из-за вируса, инфицирующего эпителиальные клетки легких, что вызывает чрезмерный иммунный ответ, приводящий к воспалению, повреждению тканей и накоплению жидкости в легких. Таким образом, эпителиальные клетки, выстилающие дыхательные пути и альвеолы, которые отвечают за газообмен, подвергаются прямому повреждению вируса H1N1, что приводит к нарушению нормальной структуры легких 6,7. Стало ясно, что другие типы клеток, хотя и не инфицированы непосредственно IAV, могут повреждаться в ответ на инфекцию 8,9. Таким образом, повреждение тканей после гриппозной инфекции затрагивает все клеточные компартменты легких, и недавно было показано, что инфекция IAV вызывает как преходящие, так и стойкие изменения состояния клеток во многих клеточных компартментах. Эта пластичность клеток в ответ на болезнь может быть полезной или вредной для успешного восстановления тканей и требует дальнейшего изучения.

Наиболее распространенной экспериментальной моделью для изучения гриппа и его патогенеза является интраназальное инфицирование мышей вирусом гриппа A/PR/8/3410. Это важный метод, позволяющий изучать тяжесть заболевания, смертность и вирусную заразность. Интраназальная инфекция мышей имитирует естественный путь заражения у людей и позволяет изучать как адаптивные, так и врожденные иммунные реакции против вируса. В 1934 году в Пуэрто-Рикобыл выделен специфический штамм вируса гриппа А "A/PR/8/34". Этот штамм вируса гриппа в настоящее время адаптирован к мышам и больше не заражает людей продуктивно. Из-за сходства иммунных систем мышей и человека, мыши являются наиболее популярной животной модельюдля исследований IAV. В этом методе штамм A/PR/8/34 H1N1 вводится мышам непосредственно через ноздри, имитируя естественную инфекцию13. Это простой, экономически эффективный и удобный метод изучения влияния вирусной инфекции на легочную ткань хозяина в условиях дикого типа (WT), а также нокаута (KO). Альтернативные методы имеют преимущества и недостатки по сравнению с интраназальной моделью. Интратрахеальная инокуляция (IT) позволяет точно доставить вирус в легкие, но этот метод не полностью имитирует инфекцию при вдыхании и не дает информации о токсичности в верхних дыхательных путях. Инокуляция ИТ также требует большого мастерства для снижения риска повреждения трахеи13,14. Аэрозольная ингаляция (АР) имитирует естественный путь заражения и создает более однородную патологию легких по сравнению с интраназальной инфекцией, но может быть трудно поддерживать равномерную концентрацию вируса в аэрозоле и добиться точной доставки вирусного аэрозоля. Безопасность также является важной задачей при использовании метода инокуляцииAR 10. Таким образом, метод интраназальной инокуляции IAV является важнейшим подходом к легочно-ориентированным исследованиям нисходящих эффектов вирусной инфекции при повреждении и восстановлении тканей. В отличие от химических или механических моделей, она обеспечивает более реалистичный и менее инвазивный способ изучения индуцированного гриппом повреждения легких и взаимодействия хозяина и патогена.

В данной работе мы разрабатываем воспроизводимый метод интраназального инфицирования мышей вирусом гриппа А (A/PR/8/34) и характеристики как краткосрочных, так и долгосрочных клеточных и структурных изменений в альвеолах легких, возникающих в результате вирусного повреждения. Исследования с использованием этого метода могут помочь в открытии механизмов повреждения и восстановления легочной ткани для выявления новых терапевтических мишеней для заболеваний легких.

Протокол

Работа с вирусом гриппа А на животной модели считается уровнем биобезопасности 2 (BSL2) и уровнем биобезопасности животных 2 (ABSL2). Все процедуры на животных, использованные для получения этих данных, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Центра исследований рака, Национального института рака, Национальных институтов здравоохранения (Протокол #24-452). Этот протокол также одобрен Институциональным комитетом по биобезопасности Центра исследований рака, Национальным институтом рака, Национальными институтами здравоохранения. Перед началом работы над этим протоколом пользователям рекомендуется получить одобрение от своего институционального комитета по уходу за животными и их использованию и институционального комитета по биобезопасности.

1. Подготовка оборотного состава

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с вирусом гриппа должны выполняться на льду в шкафу биобезопасности. Извлеките наконечники и все, что контактирует с вирусом, в контейнер с 10% отбеливателем. Ведра со льдом, пипетки и коробки для наконечников следует опрыскивать 10% раствором отбеливателя, а не погружать в воду. Выдерживать при комнатной температуре не менее 30 минут. Выбросьте твердые отходы в контейнер для биологически опасных отходов и выбросьте жидкие отходы в раковину, промыв водой.

  1. Разморозьте замороженный запас вируса (0,5 мл) на льду в шкафу биобезопасности.
  2. Установите контейнер для отходов, содержащий 10% отбеливателя, в водопроводную воду. Поместите две пластиковые или картонные коробки для морозильной камеры, которые вмещают до 100 пробирок с образцами, в морозильную камеру при температуре -80 °C для предварительного охлаждения.
  3. Предварительно промаркируйте 160 пробирок объемом 1,5 мл для аликвот вируса. Пробирки с завинчивающейся крышкой предпочтительнее пробирок с откидной крышкой, чтобы избежать образования аэрозолей при открытии пробирок с вирусными запасами для использования. Поместите трубки на лед для предварительного охлаждения перед изготовлением аликвот вируса.
  4. Сделайте 3 мкл аликвот вируса с помощью откалиброванной пипетки P20 и наконечников, помещая вирус только в предварительно охлажденные пробирки и постоянно держа аликвоты на льду.
  5. После изготовления аликвот храните их в предварительно охлажденной морозильной камере с маркировкой «A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)», каталожным номером, номером партии и сроком годности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные партии вирусов имеют разную заразность и их не следует смешивать.
  6. Поместите коробку в морозильную камеру при температуре -80 °C. Убедитесь, что все должно быть как можно холоднее, так как титр вируса будет уменьшаться с каждым циклом замораживания/оттаивания.

2. Разведение аликвот вируса для использования в экспериментах по интраназальной инфекции

  1. Разморозьте одну аликвоту объемом 3 мкл вирусного запаса на льду в шкафу биобезопасности.
  2. Сделайте разведение в соотношении 1:100 (разведение А), переложив 2 мкл аликвоты 3 мкл в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 198 мкл холодного D-PBS.
  3. Продолжайте разбавлять вирусный запас до тех пор, пока он не достигнет соответствующей концентрации на 0,5-1 ЛД50 на фоне штамма используемых мышей. Держите все на льду и используйте предварительно охлажденные трубки, чтобы избежать перегрева вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для VR-95PQ, партия 70063082, заражайте мышей вирусом от 12 600 до 31 500 CEID50/μL (в зависимости от массы тела) в разведении 1:500 000.
  4. Из разведения А (1:100) проводят разведение в соотношении 1:50 000 (разведение В) путем добавления 10 мкл разведения А к 4990 мкл холодного D-PBS в предварительно охлажденную пробирку объемом 15 мл. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
  5. Из разведения В проводят разведение в масштабе 1:500 000 (разведение С) путем добавления 200 мл разведения В к 1,8 мл D-PBS в предварительно охлажденную пробирку объемом 5 мл. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить идеальное разведение вируса, которое будет использоваться для заражения животных при покупке новой партии, можно оценить с использованием титра вируса, указанного в описании продукта, и скорректировать разведение на основе титра предыдущей партии. Лучший способ определить идеальное разведение — эмпирически титровать новую партию вируса с помощью мышей дикого типа C57BL/6. Запланируйте диапазон разведений в диапазоне от 1:50 000 до 1:500 000 и закажите 1-2 клетки с самками мышей C57BL/6 на одно разведение для тестирования. Заражайте мышей в разных концентрациях и следите за их потерей веса. Для тестирования титров вируса в исследовании предлагается использовать только самок мышей, чтобы уменьшить изменчивость, которая может быть вызвана различиями в полу или весе между мышами. Самки мышей часто болеют сильнее, чем самцы мышей, возможно, из-за их меньшего размера или из-за различий по признаку пола в ответ на инфекцию гриппа, как это происходит при других формах повреждения легких у мышей. Хотя это не было подробно изучено, в экспериментах по титру использовались самки мышей, потому что если бы титр был определен с помощью мышей-самцов, самки мышей могли бы умереть при определенной дозе. Тем не менее, было обнаружено, что самцы мышей заметно болеют и имеют заметные повреждения легких при заражении титром вируса, который был определен с использованием только самок мышей. Идеальным разведением при использовании мышей смешанного происхождения или аутбредных мышей будет «1 LD50», при котором погибает 50% мышей дикого типа C57BL/6. Беспородные мыши более устойчивы к инфекции16 и будут травмированы и хорошо восстанавливаться при таком разведении. Если мыши для эксперимента будут находиться на инбредном фоне C57BL/6, идеальная доза будет составлять половину от этих «0,5 LD50». Поскольку целью этих экспериментов является изучение травм и восстановления, идеально определить дозу, при которой мыши заболевают и теряют 20-25% массы тела, но большинство мышей в конечном итоге выздоравливают (рис. Если все мыши в исследовании имеют примерно одинаковый вес (~25 г), то можно вводить вирус гриппа в дозе 50 мкл соответствующего разведения каждой мыши. Однако вес мышей колеблется в пределах 15-35 г. Следовательно, вводите 2 мкл вирусного разведения на грамм массы тела (например, мышь весом 15 г получит 30 мкл гриппа, а мышь весом 35 г — 70 мкл). Это приводит к более постоянному уровню инфекции и повреждения тканей у животных разного размера. Эта информация необходима для планирования объема разведения С.

3. Транспортировка вирусных аликвот в животноводческие помещения

  1. Поместите пробирку объемом 5 мл с конечным вирусным разведением в лед и наклейте на контейнер наклейку с биологической опасностью. Выстелите пластиковую коробку для образцов бумажными полотенцами, чтобы впитать возможные разливы.
  2. Поместите материалы, необходимые для интраназальной инфекции, внутрь коробки с биологически опасной этикеткой: пипетку P200, неоткрытую коробку с отфильтрованными наконечниками для пипеток P200, ручку и коническую трубку объемом 50 мл, наполненную свежим 10% отбеливателем для вирусных отходов. В качестве инфекционного контроля заполните пробирку объемом 1,5 мл тем же холодным D-PBS, который используется для разбавления IAV.

4. Введение IAV мышам

ПРИМЕЧАНИЕ: Работа с вирусом гриппа в помещении для содержания животных требует уровня безопасности ABSL2. Стандартные СИЗ включают в себя скрабы, одноразовый лабораторный халат, два чепчика для волос, двойные нитриловые перчатки, двойные бахилы, защитные очки (защитные очки) и маску. Разбавленный вирус гриппа следует держать на льду в течение всего протокола введения, чтобы избежать потери инфекционности.

  1. Вся работа с вирусами должна проходить внутри шкафа биобезопасности. Несмотря на то, что вирус гриппа A/PR/8/34 является штаммом, адаптированным к мышам, вирусы гриппа склонны к мутациям, и поэтому относятся к вирусу так, как если бы он был потенциально заразным для человека.
  2. Вводите изофлурановую анестезию животным по одному со скоростью потока 2,5-3% на испарителе. Перед введением гриппа переместите животных из анестезиологического бокса в носовой конус.
  3. Когда мышь находится под наркозом, проверьте ее дыхание и ущипните палец ноги, чтобы увидеть, реагирует ли она. Мыши готовы к заражению IAV, когда они реагируют на укол пальца ноги небольшой конвульсией или «прыжком», но не в том случае, если они достаточно бодры, чтобы двигать головой.
  4. С помощью пипетки P200 с концентрацией 50 мкл (или 2 мкл/г массы тела; см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже, шаг 2.5), отсадите разбавленный IAV (или PBS control) из флакона на лед и положите пипетку на коробку с наконечником или бумажное полотенце, где наконечник не будет соприкасаться с перчатками или поверхностью шкафа для биологической безопасности.
  5. Возьмите мышь под наркозом и держите мышь вертикально под углом 45°. Сожмите мышь достаточно плотно, чтобы трахея удлинилась для лучшего вдоха, но не настолько плотно, чтобы затруднить дыхание. Следите за тем, чтобы дыхание мыши было поверхностным, но равномерным, без задыхания.
  6. Медленно введите разведенный IAV препарат в ноздри мыши. Это можно успешно сделать с помощью одного из двух методов, описанных в шагах 4.6.1 и 4.6.2.
    1. Капайте вирусный раствор в ноздри по каплям, чередуя ноздри так, чтобы вирус проник с обеих сторон носа.
    2. Создайте «пузырь» вируса, охватывающий обе ноздри, поддерживаемый последовательным и медленным пипетированием, когда мышь вдыхает жидкость.
      Примечание: В этом исследовании последовательно использовался метод пузырьковой инстилляции, который был более контролируемым и воспроизводимым. Этот метод позволяет легко доставлять вирусную суспензию в ноздри под наркозом и способствует естественному дыханию. Метод понижения одинаково действителен, но какой бы метод ни использовался, последовательность метода должна применяться во всех экспериментах, чтобы обеспечить меньшую вариабельность результатов.
  7. Держите кончик пипетки близко к носу, но не прикасайтесь к носу. Если мышь просыпается, введите половину дозы и верните мышь в носовой конус изофлурана перед введением второй половины дозы.
  8. Если мышь находится в сознании настолько, что может покачать головой, покашлять или выплюнуть вирус, необходимо больше анестезии, чтобы избежать появления аэрозольного вируса и обеспечить хорошую инфекцию. Если мышь не бодрствует, введите всю дозу. Если мышь была помещена обратно на носовой конус, повторите шаг 4.6 для введения оставшейся IAV.
  9. Выбросьте наконечник в контейнер для отходов, содержащий свежий 10% отбеливатель. Используйте свежий наконечник для каждой клетки с мышами.
  10. После каждого введения IAV держите мышь вертикально в течение 1-2 минут, чтобы дыхательные пути оставались открытыми и чтобы убедиться, что грипп был адекватно доставлен в легкие. Если вирус гриппа был успешно доставлен в легкие мыши, хрипы можно почувствовать, положив по одному пальцу на каждую сторону грудной клетки мыши.
  11. После того как мышь начнет восстанавливаться, поместите ее обратно в клетку, чтобы она полностью восстановилась. Мыши быстро выздоравливают от изофлурана, но их необходимо наблюдать до тех пор, пока они не станут амбулаторными.
  12. Записывайте такие события, как хрипы в груди и глубокое дыхание, которые указывают на то, что IAV был хорошо вдохнут, или пузыри и спреи из носа, которые указывают на то, что часть жидкости была выброшена из ноздрей мыши. Отслеживайте эту информацию в электронной таблице журнала травм (Дополнительный файл 1) и лабораторной записной книжке.
  13. Повторите шаги 4.2-4.12 для каждой зараженной мыши.

5. Транспортировка обратно в лабораторию

  1. Поместите 50 мл конической жидкости, содержащей отбеливатель и кончики, обратно в пластиковую коробку для хранения образцов вместе с остатками разведения IAV (если есть) и лабораторными предметами, используемыми для лечения гриппа.
  2. Вернувшись в лабораторию, инкубируйте все, что вступило в контакт с вирусом, с 10% отбеливателем. Опрыскивайте ведра со льдом, пипетки и коробки для чаевых 10% раствором отбеливателя, а не погружайте в воду. Выдерживать при комнатной температуре не менее 30 минут. Выбросьте твердые отходы в контейнер для биологически опасных отходов и выбросьте жидкие отходы в раковину, промыв водой.

6. Наблюдение за мышами и дополнительные экспериментальные процедуры

  1. Контролируйте оценку упитанности (BCS)17 и массу тела всех контрольных (PBS) и инфицированных IAV мышей ежедневно после заражения гриппом, начиная либо на следующий день после заражения (день 1), либо через 3 дня после заражения (день 4). Мыши, инфицированные IAV, вряд ли потеряют значительную потерю веса до 4-го дня после заражения (Рисунок 1).
    Мыши, которые теряют более 30% массы тела или достигают показателя упитанности 1, должны быть усыплены.
  2. При желании вводите EdU мышам путем внутрибрюшинной инъекции или в питьевую воду для мониторинга пролиферации клеток после гриппозной инфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие типы клеток в легких мыши размножаются после повреждения, вызванного IAV9. По желанию можно вводить другие препараты, специальные продукты питания или специальную воду для конкретных экспериментальных целей. Имейте в виду, что мыши не едят и не пьют так много, как обычно, во время выздоровления от гриппа, поэтому метод введения на основе инъекций может быть более желательным; с другой стороны, может быть сложно вводить мышам с BCS 2-2,5.

7. Забор легочной ткани для последующих подходов

  1. Забор легочной ткани для последующих применений, включая иммунофлуоресцентный анализ, проточную цитометрию или секвенирование РНК отдельных клеток в мышином помещении или в лаборатории в шкафу биобезопасности.
  2. Усыпляйте мышей по одной, используя CO2. Не вывихивайте шейку матки, чтобы избежать вывиха трахеи. Двусторонняя торакотомия обычно является одобренным методом вторичной эвтаназии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это исследование следует утвержденным рекомендациям учреждения по уходу за животными и протоколу эвтаназии CO2 и последовательно использовало этот метод в предыдущих исследованиях гриппа без внесения значительной вариабельности в повреждение легких или гистопатологические исходы. Кетамин/ксилазин также можно использовать для усыпления мышей, чтобы избежать повреждений, вызванных вдыханием CO2 . Тем не менее, ингаляция CO2 является приемлемым методом, если приобретение кетамина/ксилазина слишком дорого или если получение лицензии DEA слишком сложно.
  3. Рассеките, вскройте грудную полость и обнажите грудную клетку и трахею.
  4. Разрежьте диафрагму и аккуратно рассеките ее в сторону от грудной клетки, чтобы не проколоть легкие. Разрежьте по бокам грудной клетки и удалите грудную клетку сверху. Разрежьте ключицы и рассеките кость и мягкие ткани в сторону от передней части трахеи.
  5. Рассекайте мышцы и ткани, окружающие трахею, до тех пор, пока не станут видны хрящевые кольца, но не прокалывайте трахею. С помощью изогнутых щипцов вытолкните пищевод из-за трахеи и рассеките его в сторону от трахеи.
  6. Проденьте кусочек шва за трахеей и завяжите свободный шовный узел (оберните один конец вокруг одного щипца двойным кольцом, возьмите свободный конец шва и протяните свободный конец через петли).
  7. Перфузируйте кровеносную систему с помощью D-PBS. Зафиксируйте большой сосуд (под передней конечностью или в нижней части диафрагмы) и перфузируйте D-PBS через правый желудочек (дно сердца, обращенной вверх), медленно надавливая на конец шприца. Если игла не видна через стенку сердца, скорее всего, она находится в левом желудочке. При этом кровь удаляется из легких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не давите на пузыри. Если в магистрали есть пузырьки, удалите их, прежде чем проталкивать D-PBS шприцем. Если речь идет о гибели эндотелиальных клеток, более щадящим является использование гравитационной перфузии, а не нажатие PBS вручную.
  8. Если забор ткани проводится только для гистологии или иммунофлюоресценции, перейдите к шагу 7.9; При сборе только для одноклеточной суспензии отрежьте все доли легких и поместите их в PBS на лед, затем перейдите к шагу 7.11.
  9. Раздувание легких для последующей иммунофлюоресценции или гистологии:
    1. Надуйте легкие в 2% параформальдегиде (PFA) и обезвоживайте через этанол для встраивания парафина или надувайте в 2% PFA и обезвоживайте через сахарозу для криосекции.
    2. Для методов обнаружения РНК, таких как РНК-скоп или гибридизационная цепная реакция (HCR), фиксируйте легкие с 4% PFA. Для лучшей фиксации надуйте легкие в 2% агарозе со сверхнизким плавлением и немедленно рассеките на вибрирующем микротоме 2% или 4% PFA в тканевой культуральной тарелке для последующей иммунофлуоресценции.
  10. Надувание легких вручную:
    1. Надувайте легкие вручную с помощью шприца и иглы 21-23 G с трубкой или без нее или с использованием силы тяжести, прикрепив трубку с PFA к кольцевой подставке на высоте 30 см над поверхностью скамейки.
    2. После изоляции трахеи введите иглу в верхнюю часть трахеи, скосите вверх, не прокалывая нижнюю часть трахеи, и затяните шов вокруг трахеи и иглы перед введением жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование острой иглы сопряжено с небольшим риском прокола трахеи по сравнению с иглой с тупым концом, и исследователи должны проявлять большую осторожность во время процедуры, чтобы избежать каких-либо повреждений. Если острая игла прокалывает трахею, следует использовать иглу с тупым концом.
  11. Чтобы создать суспензию одиночных клеток для последующей проточной цитометрии или анализа секвенирования одиночных клеток, удалите легочную ткань из D-PBS и измельчите легочную ткань ножницами, а затем измельчите лезвием бритвы в течение 2-3 минут, чтобы получить еще более мелкие кусочки ткани.
  12. Диссоциировать в буфере для расщепления, содержащем 480 Ед/мл коллагеназы I, 100 мкл/мл диспазы и 2 мкл/мл ДНКазы в D-PBS, при 37 °C в течение 30-35 мин. Фильтруйте через фильтры 100 мкм и 40 мкм, лизируйте все оставшиеся эритроциты с помощью буфера для лизиса аммония-хлорида-калия (ACK) и ресуспендируйте 1% BSA в PBS для последующей обработки и анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выявления вирусной инфекции и выведения вирусной инфекции после инфекции в легких можно оценить вирусную нагрузку с помощью анализа qRT-PCR или TCID50 в гомогенатах легких для измерения репликации вируса. Нейраминидаза и окрашивание капсидом также могут быть использованы для выявления вирусной инфекции. Клиренс вируса должен произойти на 8-9 день после заражения18,19, в то время как восстановление и регенерация легочной ткани продолжаются в течение нескольких недель9.

Результаты

По сравнению с неинфицированными мышами, получавшими PBS, у инфицированных IAV мышей наблюдаются гетерогенные повреждения тканей (рис. 1A). Повреждение тканей может быть количественно определено с помощью алгоритма кластеризации k-средних в MATLAB20 (рис. 1B). Инфицированные IAV мыши начинают терять вес через 3-4 дня после заражения. При идеальном титре мыши теряют от 20 до 30% от своей первоначальной массы тела, при этом максимальная потеря веса происходит через 8-10 дней после заражения (dpi) (рисунок 1C). К 11-12 dpi мыши должны начать набирать вес и вернуться к 10-15% от первоначальной массы тела к 14 dpi. Для исследований регенерации полезно, если большинство мышей в эксперименте теряют вес и испытывают повреждение тканей, но не умирают. Тем не менее, из-за гетерогенности повреждения тканей (Рисунок 1A, B) и возможной вариабельности при интраназальном введении, для нескольких мышей в эксперименте нормально не терять вес или испытывать повреждение тканей, а для нескольких мышей терять >30% массы тела, что приводит к эвтаназии (Рисунок 1D). Эксперименты, направленные на определение разницы в выживаемости и потере веса, например, между мышами с KO определенного гена и их контрольной группой WT, могут потребовать корректировки титра и дозы IAV, а также выполнения расчета мощности для определения размера выборки, необходимого для обнаружения такой разницы в этих двух параметрах.

В дополнение к изменениям в общей структуре тканей и здоровье мышей, транскрипционные изменения во всех клеточных компартментах легких происходят в ходе реакции ткани на повреждение. Это включает в себя как транзиторные состояния клеток, которые в конечном итоге разрешаются по мере восстановления ткани, включая переходные или промежуточные состояния эпителиальных клеток и миелоидные иммунные клетки, так и персистирующие состояния клеток, которые не способствуют функциональному восстановлению, включая эпителиальные клетки Krt5+ и эндотелиальные клетки TrkB+9. Например, в капиллярном эндотелии легкого мыши при 6 dpi возникает транзиторное интерферон-стимулированное состояние эндотелиальных клеток, характеризующееся высокой экспрессией интерферон-стимулированных генов (рис. 2А). Это состояние разрешается с разрешением 11-19 точек на дюйм (рис. 2A). Индуцированное травмой состояние капиллярного эндотелия (iCAP) возникает при 11 dpi, характеризуясь высокой экспрессией Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 и Bnip3 (рис. 2B). В отличие от интерферон-стимулированного состояния эндотелиальных клеток, состояние эндотелиальных клеток iCAP сохраняется в областях сильно поврежденной ткани и все еще присутствует в течение года после инфицирования (Рисунок 2C). Транзиторные состояния альвеолярных эпителиальных клеток, включая альвеолярные переходные клетки и незрелые состояния альвеолярных эпителиальных клеток I типа (AT1), также возникают после инфицирования (рисунок 2D). Наконец, инфекция приводит к потере многих эндогенных альвеолярных макрофагов (aMAC_a) и их восстановлению как из воспалительных моноцитов (iMON), так и из эндогенных aMAC. Альвеолярные макрофаги через 1 год после инфицирования имеют различные транскрипционные состояния (aMAC_a и aMAC_b) в зависимости от их происхождения (рис. 2E)9. Преходящие и персистирующие состояния клеток, возникающие после острого повреждения легких, требуют дальнейшего изучения, поскольку их аномальное поведение в нише может способствовать как продуктивному, так и отрицательному вкладу в успешное восстановление тканей и последующее функционирование тканей. Данные секвенирования РНК одиночных клеток былиранее опубликованы 9 и депонированы в Gene Expression Omnibus как GEO: GSE262927.

figure-results-1
Рисунок 1: Мониторинг повреждения легких и здоровья животных. (A) Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) участков легочной ткани из ложно инфицированного (PBS-обработанного) легкого слева и инфицированного IAV легкого справа. По сравнению с неповрежденным легким, легкое, инфицированное IAV, демонстрирует гетерогенное повреждение тканей. Масштабные линейки, 1 мм. (B) Используя алгоритм кластеризации k-средних в MATLAB20, повреждение тканей можно охарактеризовать как серьезное (красный), поврежденное (зеленый) или нормальное (синий). Важно отметить, что в левой доле легкого, обработанной PBS, структуры дыхательных путей классифицируются как «тяжелые» из-за плотности и интенсивности окрашивания эпителиальных клеток дыхательных путей. Тем не менее, все еще можно легко различить разницу между легкими, получавшими PBS, и легкими, инфицированными гриппом, учитывая этот исходный уровень. Масштабные линейки, 1 мм. (C) Пример кривой потери веса из репрезентативного эксперимента с инфекцией IAV, в котором легкие мышей были собраны через 13 дней после заражения (dpi). Кривая содержит данные от шести мышей дикого типа, точки представляют среднее значение, в то время как полосы погрешности представляют стандартную ошибку среднего. (D) Пример кривой выживаемости из репрезентативного эксперимента с инфекцией IAV, в котором легкие мышей были собраны через 14 дней после заражения (dpi). Кривая содержит данные о семи мышах дикого типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Мониторинг изменений состояния эндотелиальных клеток капилляров после инфекции IAV. (А) Интерферон-стимулированное ЭК-состояние возникает при 6 dpi и разрешается в диапазоне 11-19 dpi. Повторный анализ опубликованных данных секвенирования РНК одиночных клеток из легких мышей в несколько различных временных моментов после гриппозной инфекции показывает, что показатель интерферонового модуля во всех типах капиллярных эндотелиальных клеток является самым высоким и составляет 6 точек на дюйм. Данные были повторно проанализированы с использованием R, а оценка интерферонового модуля основана на экспрессии 87 интерферон-стимулированных генов в каждом типе клеток. CAP1, эндотелиальная клетка капиллярного типа 1; iCAP, эндотелиальные клетки, вызванные травмой; CAP2, эндотелиальная клетка капиллярного типа 2; EC, эндотелиальная клетка. (В) Напротив, индуцированное травмой состояние ЭК, характеризующееся экспрессией Ntrk2 (TRKB), возникает при 11 dpi и сохраняется до года после инфицирования. Масштабная линейка, 500 мкм. (C) Транскрипционные данные секвенирования одноклеточной РНК эндотелиальных клеток капилляров легких после гриппозной инфекции демонстрируют динамический характер состояния эндотелиальных клеток капилляров во время восстановления тканей. (D) Альвеолярные эпителиальные клетки также испытывают клеточную пластичность после гриппозной инфекции. Тип альвеолярных переходных клеток возникает в диапазоне от 6 до 11 точек на дюйм и разрешается с разрешением 19 точек на дюйм. Незрелое состояние клеток AT1 (AT1_c) возникает при 11 dpi и сохраняется до 90 dpi. (E) После инфекции многие существующие альвеолярные макрофаги (aMAC_a) теряются, и приток воспалительных моноцитов (iMON) наблюдается при 6 dpi. Популяция альвеолярных макрофагов восстанавливается как существующими aMAC для регенерации aMAC_a популяции, так и воспалительными моноцитами, генерирующими популяцию aMAC_b. Хотя оба представляют собой альвеолярное состояние макрофагов, полученные aMACs можно различить транскрипционно. Графики в (C-E) показывают процент клеток в каждой популяции в каждый момент времени в продольном наборе данных о гриппозной инфекции и были сгенерированы с помощью R. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Образец журнала травм, журнала веса и журнала оценки упитанности (BCS) для наблюдения за животными после гриппозной инфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этой статье мы рассказали об удобном способе передачи вируса гриппа мышам для инициирования быстрого и эффективного повреждения легких мышей и изучения механизмов как успешной регенерации, так и диспластической репарации. Мы демонстрируем, что интраназальная инокуляция A/PR/8/34 IAV может быть методом без стресса. Для полного посева после анестезии изофлураном требуется менее 2 минут на одну мышь. Это простой и неинвазивный метод вирусной инокуляции, который следует естественному пути заражения и позволяет изучать реакцию как тканей, так и иммунной системы более физиологически значимым образом. Вирус, инокулированный через ноздри мыши, может индуцировать как слизистый, так и системный иммунитет21. Что еще более важно, повреждения, вызванные вирусной инфекцией, хорошо видны в срезах легочной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином (ПЭ)22 (рис. 1). Полная временная шкала ожидаемых транскрипционных изменений в типах клеток легких в каждом компартменте легкого была опубликована ранее9. В данной работе мы повторно проанализировали подмножество этих данных, чтобы продемонстрировать, что в капиллярных эндотелиальных, альвеолярных эпителиальных и миелоидных иммунных компартментах легких мышей преходящие и стойкие транскрипционные изменения происходят в течение ответа на инфекцию гриппа у неинфицированных мышей в течение года после заражения (рисунок 2).

В этом протоколе есть несколько критических шагов, и надлежащее устранение неполадок на этих этапах приведет к успешному эксперименту. Вирус гриппа A/PR/8/34 является адаптированным к мышам штаммом гриппа, который продуктивно не заражает человека23, но всегда важно соблюдать все указанные меры безопасности во время эксперимента, чтобы избежать любой возможности заражения лабораторного персонала. Введение изофлурановой анестезии является критически важным шагом для обеспечения успешной доставки вируса, поскольку мыши не будут хорошо вдыхать вирус во время бодрствования. Проверяйте дыхание и следите за движением головы мыши во время процедуры, чтобы убедиться, что вирус попал в обе ноздри. Если мыши не полностью обезболиваются, могут образовываться пузырьки, которые ограничивают вдыхание вируса и образуют аэрозоли. Следует избегать обоих исходов, и мышей следует снова помещать на носовой конус изофлурана, если наблюдается чихание или пузырьки в ноздрях. Постинфекционный мониторинг, такой как измерение потери веса, оценки упитанности и состояния здоровья, а также предоставление восстановительной пищевой добавки, также является важным компонентом этого эксперимента. Если наблюдается, что мыши не теряют достаточного веса или не имеют ожидаемого объема повреждения тканей (рисунок 1), возможно, что доза слишком мала; С другой стороны, если многие мыши достигают конечной точки потери массы тела на 30%, возможно, что доза слишком высока. В любом случае, лучше всего определить правильную дозу с помощью эмпирического титра партии вируса с использованием когорты мышей C57BL/6, как мы описываем здесь.

Поскольку инфекция гриппа по-прежнему широко распространена во всем мире, вызывает тяжелые респираторные заболевания и может привести к летальному исходу, понимание процесса вирусной инфекционности и клеточного ответа на инфекцию и повреждение тканей легких имеет первостепенное значение. Таким образом, метод интраназальной инфекции, описанный в этом исследовании, может помочь в выявлении важных регуляторных механизмов и разработке новых терапевтических подходов к заболеваниям легких. Кроме того, в будущих приложениях этого метода может быть использован другой штамм вируса гриппа, адаптированный к мышам, такой как X31, для определения влияния на структуру и функцию легочной ткани в случае повторяющихся респираторных инфекций. Поскольку многие люди в течение жизни подвержены множественным респираторным инфекциям, такое расширение этой модели может иметь важные последствия для изучения регенерации легочной ткани и, следовательно, для общественного здравоохранения.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения США (NIH), Национальным институтом рака, Центром исследований рака.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл трубы и bbsp;Fisher Scientific02-682-557
100 & micro; Сито M-ячейкиFalcon352360
Коническая трубка объёмом 15 млFalcon352196
1x PBSGibc010010-023
40 и микро; Сито M-ячейкиFalcon352340
Трубка объёмом 5 млГлобус6101C
Коническая трубка объёмом 50 млFalcon352098
A/PR/8/34 Запасы вируса гриппаATCC VR-95PQУ разных лотов разный вирусный титр
ACK Lysis BufferКачество биологических характеристик118-156-101
Антитела к TRKBR& D SystemsAF1494
ОтбеливательКлорокс10% отбеливателя
Бычий сывороточный альбуминСигма ОлдричA8022
Индукционная камера анестезии CO2ЛюбойН/Д
Коллагеназный тип IGibco17100017
DAPIМилипор Сигма28718-90-3
DispaseКорнингCB-40235
Инструменты для вскрытия: ножницы, изогнутые щипцы, прямые щипцыЛюбойН/Д
DnaseСигма Олдрич4716728001
D-PBSКорнинг21-031-CM
ЭтанолPharmco111000200
Стеклянные флаконыDWK Life Sciences986562
Ведро для льдаЛюбойН/Д
ИзофлуранКоветрус29404
Нидлз, 21– 23 GЛюбойН/Д
P20/P200 — пипетка ПипетманF144056M/F144058M,
Наконечники пипеток P20/P200Томас Сайентифик1159M43/1159M40
Параформальдегид (PFA) Thermo ScientificJ19943-k22%PFA
ПипетманЛюбойН/Д
Пластиковые или картонные морозильные коробкиЛюбойН/Д
Лезвие бритвыЛюбойН/Д
Ринг-стендЛюбойН/Д
Серологические пипеты, 5 млFalcon357543
Камера с индукционной индукционной камерой мыши с верхней частью затвораSomni Scientific
ШвыFisher ScientificNC9422522
Шприцовые трубки и люер-замкиЛюбойН/Д
Шприц, 10 млЛюбойН/Д
Настольный анестезиологический аппарат IsofluraneОмедаOhmeda Isotec-4Расход должен быть 2.5– 3%
Агароза с ультранизким плавлениемСигма ОлдричA5030-1G
Весовые весыOHAUSCS200

Ссылки

  1. Mammoto, A., Mammoto, T. Vascular niche in lung alveolar development, homeostasis, and regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 7, 318(2019).
  2. Tsikis, S. T., Hirsch, T. I., Fligor, S. C., Quigley, M., Puder, M. Targeting the lung endothelial niche to promote angiogenesis and regeneration: a review of applications. Front Mol Biosci. 9, 1093369(2022).
  3. Torrego, A., Pajares, V., Mola, A., Lerma, E., Franquet, T. Influenza A (H1N1) organising pneumonia: figure 1. BMJ Case Rep. 2010, bcr1220092531(2010).
  4. Murota, M., et al. Influenza H1N1 virus-associated pneumonia often resembles rapidly progressive interstitial lung disease seen in collagen vascular diseases and COVID-19 pneumonia; CT-pathologic correlation in 24 patients. Eur J Radiol Open. 7, 100297(2020).
  5. Niethamer, T. K., et al. Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury. eLife. 9, e53072(2020).
  6. Klomp, M., Ghosh, S., Mohammed, S., Khan, M. N. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol. 110 (1), 115-122 (2021).
  7. Newton, A. H., Cardani, A., Braciale, T. J. The host immune response in respiratory virus infection: balancing virus clearance and immunopathology. Semin Immunopathol. 38 (4), 471-482 (2016).
  8. Jones, D. L., et al. An injury-induced mesenchymal-epithelial cell niche coordinates regenerative responses in the lung. Science. 386 (6727), eado5561(2024).
  9. Niethamer, T. K., et al. Longitudinal single-cell profiles of lung regeneration after viral infection reveal persistent injury-associated cell states. Cell Stem Cell. 32 (2), 302-321.e6 (2025).
  10. Belser, J. A., Gustin, K. M., Katz, J. M., Maines, T. R., Tumpey, T. M. Comparison of traditional intranasal and aerosol inhalation inoculation of mice with influenza A viruses. Virology. 481, 107-112 (2015).
  11. Oltean, T., Maelfait, J., Saelens, X., Vandenabeele, P. Need for standardization of influenza A virus-induced cell death in vivo to improve consistency of inter-laboratory research findings. Cell Death Discov. 10 (1), 247(2024).
  12. Nguyen, T. -Q., Rollon, R., Choi, Y. -K. Animal models for influenza research: strengths and weaknesses. Viruses. 13 (6), 1011(2021).
  13. Jin, X. -Y., et al. Comparative pathogenicity of influenza virus-induced pneumonia mouse model following intranasal and aerosolized intratracheal inoculation. Virol J. 21 (1), 240(2024).
  14. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164(2012).
  15. Cantu, A., Gutierrez, M. C., Dong, X., Leek, C., Anguera, M., Lingappan, K. Modulation of recovery from neonatal hyperoxic lung injury by sex as a biological variable. Redox Biol. 68, 102933(2023).
  16. Sunagar, R., Kumar, S., Namjoshi, P., Rosa, S. J., Hazlett, K. R. O., Gosselin, E. J. Evaluation of an outbred mouse model for Francisella tularensis vaccine development and testing. PLoS One. 13 (12), e0207587(2018).
  17. Cowley, P. M., Roberts, C. R., Baker, A. J. Monitoring the health status of mice with bleomycin-induced lung injury by using body condition scoring. Comp Med. 69 (2), 95-102 (2019).
  18. Gonzalez, A. J., Ijezie, E. C., Balemba, O. B., Miura, T. A. Attenuation of influenza A virus disease severity by viral coinfection in a mouse model. J Virol. 92 (23), e00881-e00918 (2018).
  19. Lv, J., et al. Kinetics of pulmonary immune cells, antibody responses and their correlations with the viral clearance of influenza A fatal infection in mice. Virol J. 11, 57(2014).
  20. Liberti, D. C., et al. Alveolar epithelial cell fate is maintained in a spatially restricted manner to promote lung regeneration after acute injury. Cell Rep. 35 (6), 109092(2021).
  21. Cipolla, D., et al. Inhalable and nasal biologics: analytical, formulation, development, and regulatory considerations. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2024, (2025).
  22. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), (2014).
  23. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal models for influenza virus pathogenesis and transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

Моделирование диспластического и функционального восстановления альвеол легких после гриппозной инфекции
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.