Исследовательская статья

Улучшение CD44-опосредованного прогрессирования экспериментального периодонтита у остеопоротических мышей с помощью глицитина

DOI:

10.3791/69067

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1The First School of Clinical Medicine, Lanzhou University, 2School of Stomatology Lanzhou University, 3Stomatology Center of Gansu Provincial Hospital, 4Department of Endocrinology, Gansu Provincial Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD44 способствует патогенезу заболевания, управляя воспалительными каскадами и остеокластической дифференцировкой посредством активации пути PI3K/Akt. Глицитеин оказывает терапевтическое воздействие на коморбидные проявления остеопороза (ОП) + периодонтита (ПД) за счет целенаправленного ослабления CD44-опосредованной сигнализации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование выясняет критические молекулярные детерминанты, связанные с коморбидностью остеопороза (ОП) и пародонтита (ПД) посредством протеомного профилирования, а также определяет регуляторную функцию CD44 при экспериментальном пародонтите в мышиной модели ОП. Фаза I включала сбор образцов сыворотки крови у пациентов с ОП+ФД (n = 3) и здоровых контрольных групп (n = 6), проходивших рутинную оценку состояния здоровья в нашем учреждении для сравнительного протеомного анализа. Последующая трансляционная валидация дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) и связанных с ними сигнальных каскадов проводилась на клинических образцах и мышиных моделях ОП+ФД. Чтобы механически охарактеризовать роль CD44 в прогрессировании БП в условиях остеопорота, была создана мышиная модель ФП с помощью двусторонней овариэктомии с последующей экспериментальной индукцией БП с помощью установки лигатуры. Всесторонняя оценка включала гистоморфометрические изменения с помощью окрашивания гематоксилин-эозином, микроархитектурный анализ костей в области первого моляра верхней челюсти с помощью микрокомпьютерной томографии и иммуноблоттинговую оценку компонентов пути фосфоинозитид-3-киназы (PI3K)/Akt. Параллельный сетевой фармакологический скрининг в сочетании с моделированием молекулярного докинга был проведен для идентификации биологически активных компонентов Angelica sinensis с терапевтическим потенциалом. Протеомный опрос идентифицировал CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP и VWF в качестве потенциальных патогенных медиаторов в патогенезе OP+PD. В наших руках анализ обогащения набора генов показал, что передача сигналов PI3K/Akt функционирует как основной медиатор прогрессирования заболевания ОП+БП. Количественная валидация на основе ПЦР с обратной транскрипцией подтвердила значительную апрегуляцию CD44 как в клинических, так и в экспериментальных когортах ОП+БД. Модуляция in vivo с помощью подавления CD44 значительно восстанавливала целостность ткани пародонта, уменьшала инфильтрацию воспалительных клеток и укрепляла микроархитектуру альвеолярной кости у мышей с ОП, что сопровождалось ингибированием пути PI3K/Akt. Сетевая фармакология показала, что глицитеин является основным биологически активным фитохимическим веществом у Angelica sinensis, а CD44 идентифицирован как его центральная молекулярная мишень. Глицитин улучшил альвеолярную структуру кости у мышей OP+PD, увеличив объемную фракцию кости (BV/TV), толщину трабекуляра (Tb.Th), минеральную плотность костной ткани (МПК) и уменьшив трабекулярное число (Tb.N), отношение поверхности кости к объему кости (BS/BV), что указывает на более здоровое качество кости, механически связанное с ослаблением сигнальной оси CD44.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пародонтит (ПД) является сложным смешанным микробным заболеванием, вызванным отложением патологических биопленок в десневой борозде1. Он характеризуется дисбалансом в микроэкологической среде, который запускает патологический воспалительный каскад внутри хозяина, что в конечном итоге приводит к необратимому прогрессирующему повреждению цемента, периодонтальной связки и альвеолярной кости, которые являются компонентами системы прикрепления пародонта. Это может привести к расшатыванию или даже потере зубов2. Количество было стандартизировано для сопоставимости, и самые последние эпидемиологическиеданные3 указывают на то, что более 1,066 миллиарда человек во всем мире страдают от тяжелого пародонтита, при этом стандартизированная по возрасту распространенность составляет примерно 12,5%, что свидетельствует о значительных различиях между международными популяциями.

Остеопороз (ОП), системное заболевание костей, характеризуется значительным ухудшением микроструктуры костей и систематической потерей костной массы 4,5. Риск переломов значительно увеличивается из-за этой структурной слабости, особенно у пожилых людей. Примечательно, что люди в возрасте 65 лет и старше в Японии имели более высокую распространенность заболеваний пародонта, чем взрослые в возрасте от 30 до 64 лет. Женщины в постменопаузе чаще заболевают пародонтозом и часто испытывают другие проблемы со здоровьем 6,7. В исследовании прогнозируется, что с 2005 по 2025 год бремя болезней увеличится более чем на 50%, а экономические издержки, как ожидается, вырастут с 17 до 25 миллиардов долларов. В исследовании прогнозируется, что с 2005 по 2025 год бремя болезней увеличится более чем на 50%, а экономические издержки, как ожидается, вырастут с 17 до 25 миллиардов долларов. Эта тенденция подчеркивает значительные социально-экономические последствия этих заболеваний пародонта. Кроме того, у пациенток с пародонтозом и гингивитом наблюдается четкая положительная корреляция между продолжительностью заболевания и его хронизацией и повышенными рисками для здоровья8.

Предыдущие исследования показали, что ОП может способствовать развитию БП и наоборот из-за общих факторов риска обоих заболеваний, таких как старение, курение и недостаточное потребление кальция и витамина D. В женской популяции в постменопаузе тяжелая ОП может сопровождаться снижением содержания минералов в нижней челюсти, что может быть связано с недостаточным уровнем прикрепления пародонта9. Было продемонстрировано, что связанное с ОП снижение плотности костной ткани может ускорить индуцированную БП альвеолярную резорбцию кости, тем самым способствуя инвазии пародонтальных патогенов10. Среди целого ряда проблем со здоровьем, связанных с возрастными и физиологическими изменениями, БП и ОП особенно заметны в связи с ускорением старения населения во всем мире и значительным увеличением числа женщин в период менопаузы. Таким образом, уточнение соответствующих показателей и их взаимосвязи имеет решающее значение для профилактики, лечения и прогностической оценки заболеваний. Руководствуясь этими аспектами, в данном исследовании использовалась протеомика для скрининга ключевых белков с акцентом на CD44-опосредованную передачу сигналов PI3K/Akt при разработке OP+PD, изучая регуляторные роли и возможные механизмы ключевых белков с использованием экспериментальной модели PD у мышей OP. Дальнейший скрининг таргетных терапевтических агентов, присутствующих в Angelica sinensis - традиционной китайской лекарственной траве, широко используемой в клинической практике благодаря ее противовоспалительным и костнозащитным свойствам, и ранее сообщалось, что они облегчают потерю костной массы и модулируют воспалительные реакции при остеопорозе и пародонтозе. Руководствуясь сетевой фармакологией и молекулярным докингом, глицитеин был идентифицирован как основной биоактивный фитохимический препарат и рациональный кандидат для вмешательства ОП+ФД.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и их использованию. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике животных. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.

Данное исследование направлено на оценку роли CD44-опосредованной регуляции пути PI3K/Akt в остеокластической дифференцировке и прогрессировании воспаления во время коморбидного остеопороза и периодонтита (ОП+ФД) и определить, может ли глицитиин, биологически активное соединение из Angelica sinensis, терапевтически модулировать эти эффекты. Обоснование основано на новых данных, связывающих сверхэкспрессию CD44 с патологической резорбцией кости и иммунной дисрегуляцией при ОП+ФД 11,12,13. Интегрируя протеомику, моделирование in vivo и сетевую фармакологию, протокол систематически исследует молекулярные механизмы и терапевтические вмешательства для смягчения прогрессирования заболевания14.

Размер выборки для экспериментов in vivo был основан на предыдущих исследованиях и анализе мощности, в результате чего n = 6 на группу, что обеспечивает достаточную статистическую мощность для обнаружения значимых различий (P < 0,05) между условиями лечения. Глицитеин вводили в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг, суспендировали в 5% ДМСО в оливковом масле и доставляли через ежедневный пероральный зонд. За мышами наблюдали в течение 8 недель после индукции БП. Для введения лигатуры для индуцирования воспаления пародонта использовали шелковую нить 5-0, а двустороннюю овариоэктомию выполняли под наркозом 0,3% пентобарбитала натрия (0,5 мл/100 г)15. Кроме того, молекулярные анализы, включая ОТ-кПЦР, вестерн-блоттинг и ИФА, проводились с использованием валидированных протоколов16, а гистологические оценки, такие как окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) и метиленовым синим, проводились в соответствии с установленными сроками и продолжительностью окрашивания.

Все экспериментальные процедуры с использованием химических реактивов, красителей и биологических образцов проводились в соответствии со стандартными протоколами биобезопасности для минимизации рисков для здоровья. С опасными материалами, такими как формалин, ЭДТА, метиленовый синий и кислотный фуксин, обращались с помощью средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, маски и защитные очки. Все отходы, включая использованные реагенты и загрязненные одноразовые материалы, были собраны в специальные контейнеры для биологически опасных отходов и утилизированы с помощью сертифицированных служб утилизации опасных отходов в соответствии с рекомендациями по институциональной и экологической безопасности. На рисунке 1 показан общий рабочий процесс эксперимента.

Сбор клинических данных
В нашем исследовании мы систематически собирали и всесторонне анализировали исходные клинические данные и подробные истории болезни трех пациентов с ОП+БП и шести контрольных субъектов, включая демографические факторы и факторы образа жизни, а также анатомический и метастатический профили. Кроме того, было проведено тщательное подтверждение результата теста на инфекцию ВПЧ (положительный или отрицательный). Стадия прогрессирования или рецидив метастатического поражения была подробно описана. В течение первых 7 дней иммунотерапии образцы крови пациентов систематически собирались и стандартизировались, включая биохимические показатели, такие как рутинные анализы крови. Рутинные анализы крови проводились в строгом соответствии со стандартными процедурами для точной оценки ключевых параметров, таких как тромбоциты, лимфоциты и нейтрофилы. Параллельно измеряли сывороточный альбумин, а функцию печени оценивали путем количественного анализа индекса концентрации глобулинов.

Пациентов
Оценка минеральной плотности костной ткани и стратификация участников
Мы провели систематическое сравнение измерений плотности костной ткани в поясничном отделе и шейке бедра. Все обследования проводились опытными радиологами нашего отделения с использованием прецизионного оборудования для точной количественной оценки значений плотности костной ткани. Чтобы обеспечить стандартизированный сбор проб, участники должны были голодать не менее 8 часов перед отбором проб. Объединив данные о плотности костной ткани с данными комплексной оценки пародонта, мы строго классифицировали пациентов либо в группу остеопороза с пародонтитом (ОП+ФД), либо на здоровую контрольную группу (ГК), гарантируя, что соотношение полов между двумя группами идеально совпадает. Сопоставление пола относится к равному распределению самок между группами ОП+БП и здоровыми контрольными группами. Тем не менее, в это исследование были включены только женщины, чтобы сосредоточиться на постменопаузальном остеопорозе; Ни в одной из групп не было испытуемых мужского пола. Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации, при этом все участники подписывали официальные формы информированного согласия, полностью защищая свои права.

Диагностические параметры
Остеопороз был определен в соответствии с Китайскими рекомендациями по диагностике и лечению первичного остеопороза (2022)17, при этом диагностические пороги были установлены на уровне Т-критерия ≤ -2,5 стандартных отклонений (SD) для поясничного (L1-L4) или тазобедренного МПК. Стадирование пародонтита соответствовало Классификации заболеваний пародонта18 Всемирного семинара 2018 года, при этом включение было ограничено случаями класса А, стадии II-III. Критерии включения: женщины в постменопаузе в возрасте 50-65 лет, двойной диагноз ОП и БП по вышеуказанным критериям, отсутствие аутоиммунных нарушений, отсутствие злокачественных новообразований в анамнезе, нормальная сердечно-легочная, печеночная и почечная функции. Критерии исключения: Отказ пациента или его семьи, недавняя (≤6 месяцев) фармакотерапия ОП или БП.

Протеомное профилирование образцов сыворотки крови
Для протеомного анализа были собраны образцы сыворотки крови трех пациентов с ОП+ФД и шести контрольных субъектов. Количественное определение относительных белков достигали с помощью стандартных процедур, а дифференциально экспрессируемые белки определяли как белки с P < 0,05 и кратным изменением > 1,519.

Анализ обогащения набора генов (GSEA)
GSEA использовали для выявления ключевых сигнальных путей, нарушенных между контрольной группой и когортой ОП+БП. Необработанные транскриптомные данные сначала преобразовывались с помощью преобразования log2 и нормализовались с помощью квантильной нормализации для устранения пакетных эффектов. Наборы генов с множественными биологическими функциями были отобраны из базы данных молекулярных сигнатур (MSigDB), а статистическая значимость оценивалась с помощью непараметрического теста ранговой суммы Вилкоксона. Результаты обогащения были представлены с использованием нормализованных баллов обогащения и коэффициента ложных открытий (FDR < 0,25).

Взвешенный анализ сети коэкспрессии генов (WGCNA)
WGCNA была использована для идентификации генных модулей, в значительной степени ассоциированных с фенотипами ОП+ФД. Для достижения безмасштабной топологии сети (R2 > 0,85) была выбрана степень мягкого порога 12, а для оценки взаимосвязи между собственными генгенами модуля и клиническими признаками был использован корреляционный анализ Пирсона. Анализ функционального обогащения был проведен для выявления соответствующих биологических путей в сильно коррелированных модулях.

Создание моделей остеопоротических мышей, индуцированных овариоэктомией
В этом исследовании приняли участие 116 самок мышей SPF-класса. Перед экспериментами животные содержались в условиях контролируемой температуры и влажности в течение 7-дневной фазы адаптации, во время которой им давали стандартизированный корм для грызунов и дистиллированную воду. Все процедуры обращения с животными строго соответствовали этическим протоколам, утвержденным Комитетом по этике Научного центра здоровья Сианьского университета Цзяотун под номером одобрения 0609. Исследование зарегистрировано под номером проекта [2024-054].

Протокол хирургической хирургии двусторонней овариэктомии (OVX):
Мышей обезболивали путем внутрибрюшинного введения 0,3% пентобарбитала натрия (0,5 мл/100 г массы тела). Спинной мех был депилирован хирургическим путем, и животные были размещены в положении лежа на подогреваемой стерильной хирургической платформе. После асептической подготовки с 75% этанолом были сделаны двусторонние паравертебральные разрезы (на 1 см латеральнее позвоночника) на уровне почечных жировых пакетов. Овариальная сумка была экстериоризирована, а яйцевод перевязан проксимальнее яичника с использованием шелковых швов 5-0 с последующим иссечением двусторонних яичников, связанной жировой ткани и частичных яйцеводных структур. Мышечный и кожный слои закрывали последовательно рассасывающимися швами 4-0. Послеоперационную антисептическую терапию проводили с использованием этанола 75%.

Контроль фиктивной хирургии:
Мыши, прооперированные симуляцией, подвергались идентичным процедурным этапам, включая воздействие яичников и резекцию периовариальной жировой ткани, без экстирпации яичников.

Послеоперационное ведение:
Восстановление после анестезии облегчалось с помощью грелок с циркуляционной водой до полного передвижения. Анальгезию поддерживали путем подкожного введения карпрофена (5 мг/кг в сутки) в течение 72 ч после операции, дополняя профилактическим пенициллином G (50 000 МЕ/кг) в течение 48 ч для профилактики инфекций в области хирургического вмешательства. Масса тела контролировалась еженедельно в течение 6-недельной фазы остеопоротического моделирования, при этом критерии исключения применялись к животным с потерей веса >20% или клиническим дистрессом.

Построение экспериментальной животной модели ОП+ПД
Экспериментальная модель ПД была разработана на основе ранее созданной животной модели ОП. Чтобы избежать обрыва нити и обеспечить плавное прикрепление между коренными зубами, для лигирования использовали шелковый шов 5-0. Во время процедуры угол рта мыши был аккуратно отведен, а нить была захвачена щипцами и аккуратно размещена в шейной области между первым и вторым молярами. Проволока и кончик щипцов держались на одном уровне, чтобы свести к минимуму травмирование слизистой оболочки щеки, тем самым снижая риск кровотечения или смертности. Другой рукой осторожно потянули за противоположный конец проволоки, постепенно направляя ее в межпроксимальное пространство между коренными зубами. После того, как нить была правильно расположена, участок рядом с щечной стороной зажимался щипцами и осторожно пропускался между вторым и третьим молярами с использованием той же техники. Мягкое стяжение вниз обеспечивало плавное прохождение шелка. Наконец, нить была надежно завязана вокруг второго коренного зуба в средней шейной области. Впоследствии мышам позволили восстановиться.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)
В таблице материалов перечислены конкретные прямые и обратные последовательности праймеров для генов, нацеленных на гены RT-qPCR, связанные с воспалением, коагуляцией и клеточной адгезией, включая CD44, CDH13, VWF и GAPDH. Последовательности праймеров, используемые для анализа ОТ-кПЦР, приведены в таблице 1.

Вестерн-блоттинг
Характеристики экспрессии ключевых белков сигнального пути в тканях пародонта систематически изучались с помощью вестерн-блоттинга. Ткани пародонта подвергали лимаизирующей гомогенизации с использованием буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеазы и фосфатазы, для эффективного извлечения общего белка. После высокоскоростного центрифугирования (12 000 × г, 4 °C, 10 мин) для отделения лизата надосадочная жидкость использовалась для точного измерения концентрации белка с помощью набора BCA, что обеспечило надежные данные для последующих экспериментов.

Для каждой экспериментальной группы было загружено 30 мкг общего белка и разделено через 10% систему SDS-PAGE. Затем растворенные белки переносили на мембраны PVDF методом полусухого блоттинга. Чтобы свести к минимуму фоновые помехи, мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в течение часа при температуре окружающей среды. Впоследствии мембраны выдерживали при температуре 4 °C в стабильной среде для дальнейшей обработки.

Затем мембраны инкубировали со специфическими первичными антителами (см. таблицу материалов) в течение 2 ч при °C. На следующий день для тщательной промывки использовали буфер TBST, а затем обрабатывали мембраны HRP-конъюгированными вторичными антителами в соотношении 1:10 000 в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Все этапы иммунодетекции были выполнены в строгом соответствии со стандартизированными протоколами для обеспечения согласованности и валидности анализа сигнального пути20.

С помощью подложек с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) для захвата сигналов и оборудования для визуализации с высоким разрешением для точного определения местоположения белковых полос, значения оптической плотности полос были количественно проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. В конечном счете, путем систематического сравнения относительных уровней экспрессии целевых белков/β-актина в каждой группе с контрольной группой, была точно оценена степень активации и динамические изменения пути PI3K/Akt при различных вмешательствах.

Иммуноферментный анализ (ИФА)
С помощью наборов ИФА (см. Таблицу материалов) в этом исследовании была достигнута точная количественная оценка различных воспалительных цитокинов, включая TNF-α, IL-6, IL-1β и IL-4, в образцах сыворотки. Также оценивали концентрации TRAP5b, ALP и TGF-β в качестве маркеров активности остеокластов. 96-луночный планшет, предварительно покрытый антителами захвата, инкубировали при 25 °C с образцами сыворотки, разбавленными в соотношении 1:10 в PBS в течение 2 ч, что позволяло антигенам специфически связываться с иммобилизованными антителами захвата. После инкубации несвязанные вещества удаляли с помощью трех промывок с использованием PBS-T (фосфатно-солевой буфер с Tween-20). Впоследствии добавляли меченые биотином антитела и инкубировали в течение 1 часа при той же температуре. Затем вводили стрептавидин-HRP для связывания биотинилированных антител, и смесь инкубировали еще 20 минут при комнатной температуре в защищенных от света условиях. Затем ферментативную реакцию завершали с помощью стоп-раствора, а абсорбцию измеряли на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов для определения концентраций цитокинов.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
Для анализа микроструктурных изменений были использованы стандартные методы для проведения H&E окрашивания на залитых парафином срезах ткани пародонта. Процесс подготовки образца включал первоначальную фиксацию в 4% растворе параформальдегида в течение 24 ч, затем ступенчатую дегидратацию этанола (70%, 80%, 95% и 100%) и очистку в ксилоле и, наконец, погружение в парафин с получением секций толщиной 4 мкм21. После депарафинизации в ксилоле образцы регидратировали путем убывания концентраций этанола (от 100% до 70%). Процесс окрашивания начинался с 5-минутного погружения в гематоксилин (по Мейснеру), после чего следовало полоскание под проточной водой, дифференциация в 1% кислотном спирте в этаноле и еще одно полоскание. Затем срезы окрашивали 0,5% эозином в течение 10 с для завершения протокола.

После окрашивания предметные стекла снова обезвоживали в сортировочной серии этанола, очищали в ксилоле и герметизировали монтажной средой. Наблюдения проводились под микроскопом, оснащенным 10-кратными и 40-кратными объективами для получения изображений с высоким разрешением. Гистологический анализ оценивал структурную целостность пародонтальной соединительной ткани, воспалительную инфильтрацию клеток и морфологию резорбции альвеолярной кости. Уровень воспаления оценивался с использованием улучшенного индекса Loe-Silness, при этом два патологоанатома, не зная идентичности образца, независимо оценивали образцы с помощью полуколичественной шкалы для обеспечения объективности и воспроизводимости.

Окрашивание метиленовым синим
В этом исследовании использовался метод окрашивания метиленовым синим на стандартизированных, обработанных верхнечелюстных альвеолярных срезах кости для количественной оценки степени резорбции кости. Экспериментальная процедура начиналась с фиксации тканей: ткани пародонта фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после чего в течение 21 дня проводилась декальцинация в 10% растворе ЭДТА (рН 7,4). После декальцинации образцы были погружены в парафин и подготовлены в срезы ткани толщиной 4 мкм, которые затем были установлены на силанизированные предметные стекла. Процесс предварительной обработки секции включал депарафинизацию ксилола, градиентную гидратацию этанола и инкубацию в водяной бане при температуре 60 °C. Затем предметные стекла окрашивали 0,1% раствором метиленового синего в течение 15 мин.

После окрашивания срезы промывали в течение 1 минуты дистиллированной водой, предварительно нагретой до 60 °C, что обеспечивает эффективное удаление излишков красителя без повреждения структуры тканей. Затем их окрашивали 0,1% кислотным фуксином в течение 5 минут для усиления контраста между тканевыми структурами. Этот протокол окрашивания обеспечил последовательную и надежную визуализацию для количественного анализа резорбции альвеолярной кости23. Наконец, предметные стекла были обезвожены с использованием сортированного этанола, очищены в ксилоле и смонтированы. Окрашенная костная ткань была проанализирована под микроскопом светового поля, и были получены изображения с высоким разрешением для точной оценки резорбции альвеолярного края кости для последующей морфологической оценки.

Анализ микрокомпьютерной томографии (микро-КТ)
Микрокомпьютерная томография была выполнена для оценки 3D-микроструктурных изменений в альвеолярной кости мышей модели ОП+ФД, в частности, на область первого моляра верхней челюсти. После 8 недель послеоперационного наблюдения мыши были гуманно усыплены с помощью ингаляции CO2 , метода, подходящего для сохранения челюстно-лицевых структур. Затем образцы верхней челюсти собирали и фиксировали в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 48 ч24.

Микро-КТ-анализ проводили с реконструированными DICOM-изображениями области верхней челюсти, импортированными в программное обеспечение, путем выбора набора данных, соответствующего отсканированным образцам. Стандартная область интереса (ROI) определялась вручную как мезиальная щечная часть на одну треть корня первого моляра верхней челюсти путем очерчивания структуры альвеолярной кости на сагиттальной и корональной проекциях, и обычно включалось около 50 последовательных срезов для полного покрытия области.

Для отделения трабекулярной кости от окружающих мягких тканей и фона применяли порог плотности 180-220 мгГА/см3 . Затем была проведена сегментация для создания бинарной структуры, представляющей только трабекулярную кость. Морфометрический анализ проводился с использованием модуля «Морфометрия костей» в программном обеспечении. Параметры рассчитывались автоматически, включая объемную фракцию костной ткани (BV/TV), толщину трабекуляра (Tb.Th), трабекулярное число (Tb.N), отношение поверхности кости к объему кости (BS/BV) и минеральную плотность костной ткани (МПК). После анализа числовые результаты были экспортированы в виде электронных таблиц.

Эти измерения были использованы для оценки степени микроструктурного повреждения альвеолярной кости, связанного с патологическим состоянием ОП+ФД, и для оценки терапевтической эффективности глицитина в восстановлении качества кости. Этот подход позволил получить воспроизводимую и количественную оценку структурной целостности в костной среде пародонта с высоким разрешением, что позволило получить ключевые морфологические сведения о результатах лечения.

Сетевое фармакологическое профилирование
Для систематического изучения биологически активных компонентов традиционной китайской медицины (ТКМ), которые могут модулировать ключевые биологические пути, связанные с коморбидным остеопорозом и периодонтитом (ОП+ФД), в этом исследовании использовался сетевой фармакологический подход для анализа Angelica sinensis. Это растение было выбрано на основе его исторического использования в ТКМ для лечения заболеваний, связанных с костями, и воспаления, включая симптомы, связанные как с остеопорозом, так и с хроническими заболеваниями десен. На этапе скрининга соединений активные ингредиенты Angelica sinensis были получены с использованием баз данных TCMSP и TCMID [детали базы данных перемещены в ToM] и отфильтрованы с использованием критериев пероральной биодоступности (OB) ≥ 30% и лекарственного сходства (DL) ≥0,18. Взаимодействие соединения и мишени было предсказано с помощью STITCH, а проверка целевого сайта — с помощью DisGeNET и OMIM. Анализ обогащения путей был проведен с использованием платформы DAVID 2021 для идентификации сигнальных путей KEGG, потенциально модулированных выбранными соединениями. Для визуализации молекулярных взаимодействий была построена сеть «состав-мишень-путь» на основе топологических индексов (центральность степени, центральность между ними). Анализ идентифицировал глицитеин, природный флавоноид, как соединение с благоприятными фармакокинетическими свойствами и сильной связью с CD44, что предполагает потенциальную терапевтическую значимость при ОП+ФД. Тем не менее, глицитеин не был клинически одобрен для лечения остеопороза или периодонтита; Эти результаты основаны на прогнозах in silico и обеспечивают теоретическую основу для последующих валидационных экспериментов in vivo 25.

Валидация молекулярного докинга
Белковые структуры CD44 (PDB ID: 1UUH) и PI3K (PDB ID: 4L23) были получены из банка данных белков RCSB (https://www.rcsb.org). Лигандные структуры (глицитиин, лигустилид) оптимизированы за счет минимизации энергии с помощью молекулярного силового поля. Моделирование стыковки проводилось с помощью генетического алгоритма по следующим параметрам: 100 запусков, размер популяции 150 и 25×106 энергетических оценок. Карманы связывания определяли на основе кристаллографических координат лиганда (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). Результирующие позы докинга ранжировали по энергии связи (ΔG, ккал/моль), а воспроизводимость проверяли с использованием порога среднеквадратичного отклонения (RMSD) <2,0 Å.

Терапевтическая оценка гицитеина на мышиных моделях ОП+ФД
Глицитеин (чистота ≥ 98%) был получен от сертифицированного поставщика биохимических веществ в аналитическом классе для экспериментов in vivo является природным изофлавоном, который, как известно, присутствует в Angelica sinensis, с противовоспалительными и остеопротекторными свойствами26. Остеопоротический периодонтит был индуцирован у 11-недельных самок мышей C57BL/6 с помощью двусторонней овариэктомии (OVX) и воспаления пародонта, вызванного лигатурой. Мыши были рандомизированы на четыре когорты (n = 6 в группе):

Симуляция: Фиктивная операция + носитель (5% диметилсульфоксид [ДМСО] в оливковом масле, ежедневное пероральное зондирование)
ОП+ФД: модель болезни + транспортное средство
ОП+ФД + низкие дозы глицитина (50 мг/кг): модель заболевания + суспензия глицитина в транспортном средстве
ОП+ФД + высокие дозы глицитина (100 мг/кг): модель заболевания + суспензия глицитина в транспортном средстве

Статистический анализ
Были проведены логические статистические тесты, а также созданы визуальные представления данных для генерации графиков и визуализации данных. Числовые данные выражали в виде среднего ± SD. Групповые сравнения оценивали с помощью двустороннего непарного t-критерия, рассматривая значения с &l 0,05 как статистически значимые. Эти методы обеспечили устойчивость данных и повысили надежность последующих аналитических результатов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеомное профилирование когорт ОП+ПД
Количественный протеомный анализ сыворотки крови пациентов с ОП+ФД (n=3) и здоровой контрольной группы (n=6) выявил нерегулируемые белки, участвующие в патогенезе заболевания. Сравнительный анализ выявил девять подавленных белков (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) и шесть повышенных белков (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) в сыворотках ОП+ПД по сравнению с контрольной группой (рис. 2A, B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании предлагается трансляционная исследовательская структура, которая сочетает в себе протеомное профилирование, валидацию экспрессии генов, моделирование на животных in vivo и сетевую фармакологию для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе коморбидности остеопороза и периодонтита (ОП+БП). Основная гипотеза заключается в том, что CD44 модулирует сигнальную ось PI3K/Akt, тем самым усугубляя воспалительную потерю костной массы в условиях ОП+ФД, и что глицитиин, флавоноид из Angelica ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Научно-техническим фондом индустрии здравоохранения провинции Ганьсу, Китай (грант No. GSWSKY2020-77), Фонд естественных наук провинции Ганьсу (гранты No 25JRRA314 и 21JR7RA620), Программа талантов провинции Ганьсу и Исследовательская программа инкубации молодежи больницы провинции Ганьсу (грант No 23GSSYF-35).

Вклад авторов:
Цзин Ци провел большую часть экспериментальной работы и анализа данных. Юньцин Панг внес свой вклад в сбор образцов, курирование данных и статистический анализ. Юй Ван помогал в разработке эксперимента и оказывал техническую поддержку. Давэй Хоу и Цзин Ван совместно руководили проектом, критически отредактировали рукопись на предмет важного интеллектуального содержания и утвердили окончательную версию. Все авторы прочитали и одобрили окончательную версию рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наборы ИФАШанхайская биотехнология Enzyme LinkКоличественное определение воспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44)
Набор для экстракции РНКШанхайская биотехнология ЕшэнЭкстракция сывороточной РНК
Набор для синтеза кДНКШанхайская биотехнология ЕшэнВысокоактивная обратная транскрипция
набор для количественной ПЦРШанхайская биотехнология ЕшэнКоличественная амплификация ПЦР
Антитела (первичные/вторичные)Технология клеточной сигнализации / ABCAM / Hangzhou Xianli Biotechnology / Пекин Zhongshan Jinqiao BiotechnologyСпецифические первичные антитела; &бета;-актин внутреннего контроля; козий вторичный антитело IgG к кролику
Реактивы для гистологииBeyotime Biotechnology / Шанхай ШаншанГематоксилин– Окрашивание эозином и метиленовым синим
Хемилюминесцентная подложкаЯккен БиотехнологияОбнаружение вестерн-блоттинга
Система микрокомпьютерной томографииScanco Medical AG (Viva CT40)Микроструктурный анализ с высоким разрешением
Система ЖХ-МС/МСThermo Scientific Q Exactive HF-XПротеомный анализ с высоким разрешением
Программное обеспечение: MaxQuant (v2.1.0), AndromedaИнститут БроудаПредварительная обработка данных протеомики
Программное обеспечение: GSEA (v4.3.2)Институт БроудаАнализ пути обогащения
Программное обеспечение: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12)Фонд RСтатистические вычисления, сетевой анализ, кластеризация, тепловые карты
Программное обеспечение: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7Научно-исследовательский институт СкриппсаМолекулярный докинг и определение сетки
Программное обеспечение: Open Babel 3.1.1Проект «Открыть Вавилон»Оптимизация структуры лиганда
Программное обеспечение: PyMOL 2.5.2Schrö ООО «Дингер»Визуализация молекулярного докинга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demmer, R. T., Papapanou, P. N. Epidemiologic patterns of chronic and aggressive periodontitis. Periodontol 2000. 53, 28-44 (2000).
  2. Kumar, S. Evidence-based update on diagnosis and management of gingivitis and periodontitis. Dent Clin. 63 (1), 69-81 (2019).
  3. Nascimento, G. G., et al. Burden of severe periodontitis and edentulism in 2021, with projections up to 2050: The Global Burden of Disease 2021 study. J Periodontal Res. 59, 823-867 (2024).
  4. Genco, R. J. Current view of risk factors for periodontal diseases. J Periodontol. 67 (10 Suppl), 1041-1049 (1996).
  5. Eke, P. I., et al. Periodontitis in US adults: National Health and Nutrition Examination Survey 2009-2014. J Am Dent Assoc. 149 (7), 576-588 (2018).
  6. Reginster, J. Y., Burlet, N. Osteoporosis: a still increasing prevalence. Bone. 38 (2 Suppl 1), S4-S9 (2006).
  7. Kawai, M., Mödder, U. I., Khosla, S., Rosen, C. J. Emerging therapeutic opportunities for skeletal restoration. Nat Rev Drug Discov. 10 (2), 141-156 (2011).
  8. Burge, R., et al. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025. J Bone Miner Res. 22 (3), 465-475 (2007).
  9. Groen, J. J., Duyvensz, F., Halsted, J. A. Diffuse alveolar atrophy of the jaw (non-inflammatory form of paradental disease) and pre-senile osteoporosis. Gerontol Clin. 2, 68-86 (1960).
  10. Armitage, G. C. Development of a classification system for periodontal diseases and conditions. Northwest Dent. 79 (6), 31-35 (2000).
  11. Dong, N., Yang, Z. Glycitein exerts neuroprotective effects in rotenone-triggered oxidative stress and apoptosis in a Parkinson's disease cell model. Acta Biochim Pol. 69 (2), 447-452 (2022).
  12. Zang, Y. Q., et al. Glycitein induces ROS-dependent apoptosis and G0/G1 arrest via MAPK/STAT3/NF-κB pathway in human gastric cancer cells. Drug Dev Res. 80 (5), 573-584 (2019).
  13. Dong, W., et al. PTX3 promotes osteogenic differentiation by triggering HA/CD44/FAK/AKT feedback loop in inflammation. Bone. 154, 116231(2022).
  14. Thanee, M., et al. CD44 modulates metabolism and ROS-Akt signaling promoting cholangiocarcinoma progression. PLoS ONE. 16 (3), e0245871(2021).
  15. Lee, J. H., et al. Standardized micro-CT assessment for alveolar bone in preclinical models of periodontitis. Bone Rep. 17, 101624(2022).
  16. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Chinese Society of Osteoporosis and Bone Mineral Research. Guidelines for the diagnosis and treatment of primary osteoporosis. Chin J Osteoporos Bone Miner Res. 15 (6), 573-611 (2022).
  18. Guo, S., Liu, Q., Ding, Y. A brief introduction of the new classification scheme for periodontal and peri-implant diseases and conditions. Int J Stomatol. 46 (2), 125-134 (2019).
  19. Wang, H., et al. Therapeutic potential of Angelica sinensis in bone metabolic disorders: Evidence from network pharmacology and experimental models. Phytomedicine. 102, 154200(2022).
  20. Wu, Y., et al. Modified methylene blue-acid fuchsin staining enhances bone resorption assessment in periodontal models. Front Physiol. 13, 856712(2022).
  21. Tian, L., et al. QizhiKebitong Formula ameliorates diabetic osteoporosis via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Res Int. 2022, 4469766(2022).
  22. Hoare, A., Soto, C., Rojas-Celis, V., Bravo, D. Chronic inflammation as a link between periodontitis and carcinogenesis. Mediators Inflamm. 2019, 1029857(2019).
  23. Wang, L., et al. Role of PI3K in bone resorption of apical periodontitis. BMC Oral Health. 22 (1), 345(2022).
  24. Johnston, C. B., Dagar, M. Osteoporosis in older adults. Med Clin North Am. 104 (5), 873-884 (2020).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cancer Cell Biology: Methods Mol Biol. , Springer US. New York, NY. 115-134 (2022).
  26. Huang, J., et al. Standardized histological assessment in periodontal models. J Tissue Eng. 13, 20417314221090381(2022).
  27. Wang, R. P., et al. IL-1β and TNF-α play an important role in modulating the risk of periodontitis and Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 20 (1), 71(2023).
  28. Mesrati, M. H., et al. CD44: a multifunction mediator of cancer progression. Biomolecules. 11 (12), 1850(2021).
  29. Sun, C., et al. A2M inhibits inflammatory mediators of chondrocytes by blocking IL-1β/NF-κB pathway. J Orthop Res. 41 (1), 241-248 (2023).
  30. Shao, Y., et al. CDH13 is a prognostic biomarker and a potential therapeutic target for patients with clear cell renal cell carcinoma. Am J Cancer Res. 12 (10), 4520-4544 (2022).
  31. Li, Z., Du, Y. CST3 alleviates bilirubin-induced neurocyte damage by promoting autophagy. Transl Neurosci. 14 (1), 20220314(2023).
  32. Chen, Z. Z., Gerszten, R. E. Metabolomics and proteomics in type 2 diabetes. Circ Res. 126 (11), 1613-1627 (2020).
  33. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).
  34. Wu, P. Y., et al. Morinda officinalis polysaccharide regulates rat bone mesenchymal stem cell osteogenic-adipogenic differentiation in osteoporosis via miR-21 and PI3K/AKT pathway activation. Kaohsiung J Med Sci. 38 (7), 675-685 (2022).
  35. Kang, W. Q., et al. Inhibitory effects of prepared Radix Rehmanniae combined with Radix Astragali on osteoporosis via PI3K-Akt pathway. Acta Cir Bras. 37 (11), e371101(2023).
  36. Wang, S., et al. miR-21 promotes osteoclastogenesis via activation of PI3K/Akt signaling by targeting PTEN in RAW264.7 cells. Mol Med Rep. 21 (3), 1125-1132 (2020).
  37. Zhang, Y., et al. PSMC6 promotes osteoblast apoptosis by inhibiting PI3K/AKT signaling in ovariectomy-induced osteoporosis. J Cell Physiol. 235 (7-8), 5511-5524 (2020).
  38. Xu, Y., et al. Epimedin C alleviates glucocorticoid-induced suppression of osteogenic differentiation via PI3K/AKT/RUNX2 signaling. Front Pharmacol. 13, 894832(2022).
  39. Go, X., et al. Glipizide alleviates periodontitis pathogenicity by inhibiting angiogenesis, osteoclastogenesis and M1/M2 macrophage ratio. Inflammation. 46 (5), 1917-1931 (2023).
  40. Cui, J., et al. Triptolide prevents bone loss by inhibiting osteoclastogenesis through PI3K-AKT-NFATc1 pathway. J Cell Mol Med. 24 (11), 6149-6161 (2020).
  41. Chen, X., et al. LY3023414 inhibits osteogenesis and osteoclastogenesis through PI3K/Akt/GSK3 signaling pathway. Bone Joint Res. 10 (4), 237-249 (2021).
  42. Hao, S., et al. Identification of key immune genes of osteoporosis using bioinformatics and machine learning. Front Endocrinol. 14, 1118886(2023).
  43. Gong, L., et al. Modified inflammatory scoring systems for periodontal tissue. Sci Rep. 11 (1), 18701(2021).
  44. Zhang, Y., et al. Establishment of ovariectomy-induced osteoporosis model and its application in oral bone loss studies. Bone Rep. 15, 101113(2021).
  45. Eke, P. I., et al. Periodontitis in U.S. adults: National Health and Nutrition Examination Survey. J Periodontol. , (2022).
  46. Guo, X., et al. Integrating network pharmacology and experimental evaluation to investigate the therapeutic mechanism of herbal compounds in periodontitis. Heliyon. 10 (5), e37942(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD44PI3K AktAngelica Sinensis

Похожие статьи