Выделение РНК из эпителия глазного хрусталика мыши и объемных масс волоконных клеток

Глазной хрусталик — это прозрачный орган, который точно фокусирует свет на сетчатке для получения четкого изображения. Хрусталик состоит из двух основных типов клеток: монослоя эпителиальных клеток, покрывающего переднее полушарие, и волоконных клеток, составляющих основную массу ткани (рис. 1). Хрусталик покрыт коллагеновой базальной мембраной, известной как капсула хрусталика, к которой плотно прилегают эпителиальные клетки. По мере роста хрусталика эпителиальные клетки на экваторе пролиферируют и дифференцируются в зарождающиеся оболочки волоконных клеток, которые наслаиваются на хрусталик концентрическим образом ^1,2,3. Пожизненный рост хрусталика зависит от непрерывной пролиферации этой небольшой популяции экваториальных эпителиальных клеток, составляющих герминативную зону⁴. По мере созревания волоконных клеток все клеточные органеллы разрушаются, чтобы устранить светорассеивающие объекты 5,6,7,8,9,10,11 и сохранить прозрачность тканей, а самые внутренние волоконные клетки в конечном итоге уплотняются, что приводит к образованию жесткого центра хрусталика ^9,12. Благодаря окружающей капсуле хрусталика в хрусталике не происходит обновления клеток, и семенные волокна остаются в центре хрусталика на протяжении всей жизни, поскольку новые волокна добавляются на периферии ткани или в коре головного мозга. Волоконные клетки хрусталика обладают различными оптическими свойствами в зависимости от их возраста и могут обеспечить временную картину различных биологических характеристик на каждой^{данной стадии}.

Несмотря на доступные хирургические варианты, катаракта, определяемая как любое помутнение в обычно прозрачном хрусталике, остается основной причиной слепоты^{в мире.} Катаракта может проявляться в эпителии хрусталика, коре или ядре с различной патофизиологией¹⁵. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы образования катаракты остаются неясными^16,17. Чтобы лучше понять, как предотвратить эти различные типы катаракты и разработать альтернативы хирургическому вмешательству, мы должны лучше понять, как эти различные типы клеток поддерживают свой гомеостаз в хрусталике.

Эпителиальные и волокнистые клетки играют разную физиологическую роль в хрусталике. Пролиферация клеток, например, ограничена эпителием хрусталика¹⁸. Между тем, волокна хрусталика составляют основную массу хрусталика, обеспечивая структуру и преломляющие свойства хрусталика⁹. Чтобы получить более детальное представление о биологических процессах, происходящих в различных отделах хрусталика, эпителиальные и волокнистые клетки должны быть исследованы отдельно. В данной работе мы представляем метод выделения эпителия из объемной массы волоконных клеток, извлечения мРНК из каждой фракции и анализа этих транскриптов с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР).

Рисунок 1: Диаграмма анатомии хрусталика. Хрусталик состоит из двух типов клеток: монослойных эпителиальных клеток (синего и оранжевого), покрывающих переднее полушарие, и объемной массы волокон хрусталика (белого). Ткань окружена тонкой коллагеновой мембраной, известной как капсула хрусталика (тан). Передние эпителиальные клетки (синие) находятся в состоянии покоя, в то время как экваториальные эпителиальные клетки (оранжевые) пролиферируют, дифференцируются и удлиняются, превращаясь в новые слои волоконных клеток (белые) на периферии хрусталика. Новые поколения волоконных ячеек накладываются на предыдущие поколения волокон в концентрических оболочках. Самые старые клетки волокон хрусталика уплотняются в центре ткани. Эта цифра была изменена по сравнению с Cheng (2024)³⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального института здравоохранения и утвержденным протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Индианы.

1. Рабочая зона, оборудование и подготовка реагентов

1. Автоклавные наконечники для пипеток перед использованием и специальные коробки с автоклавными наконечниками для экспериментов с РНК, чтобы избежать загрязнения РНКазой.
2. Обработайте рабочую поверхность в вытяжном шкафу и пестках для гомогенизации тканей раствором для обеззараживания РНКазы, тщательно промойте деионизированной водой и высушите.
3. Замочите инструменты для препарирования (изогнутые щипцы, прямые щипцы и ножницы для микродиссекции) в 70% этаноле на 5 минут и высушите их тонкой салфеткой перед использованием.
4. Используйте совершенно новые лотки для вскрытия и чашки Петри для вскрытия и выделения тканей.
5. Аликвота 400 мкл холодного реагента ТРИЗОЛ кислота-гуанидиний-фенол в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл без ДНКазы и РНКазы в вытяжном шкафу.

2. Вскрытие хрусталика мыши

1. Усыпляйте взрослых мышей с использованием передозировки CO₂ с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичной меры.
2. Энуклеируйте глаза с помощью изогнутых щипцов.
   1. Аккуратно надавите щипцами на ткань, окружающую глаз, в результате чего глаз выпячивается из глазницы. Закройте щипцы под глазом и снимите их, постепенно потянув вверх.
   2. Перенесите глаза в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 750-1000 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
3. Для вскрытия перенесите глаза в лунки в лоток для вскрытия со свежим 1x PBS.
4. Под диссекционным микроскопом с помощью прямых щипцов удерживайте основание зрительного нерва и разрежьте нерв как можно ближе к глазу острыми ножницами для микродиссекции.
5. Осторожно вставьте тонкие прямые щипцы в отверстие, где был соединен зрительный нерв, и зажмите, чтобы удержать ткань на месте.
6. Вставьте кончик ножниц для микродиссекции в это же отверстие и аккуратно разрежьте от заднего полюса глаза по направлению к роговично-склеральному соединению. Не вставляйте инструменты слишком глубоко, чтобы не повредить линзу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хрусталик грызуна занимает большой объем в глазу, поэтому рекомендуется делать неглубокие надрезы, чтобы предотвратить прокол хрусталика.
7. Разрежьте вдоль роговично-склерального соединения с помощью ножниц для микродиссекции, отделив не менее половины окружности глаза.
8. С помощью прямых щипцов аккуратно выверните ткани глаза, одновременно надавливая на роговицу, выдавливая линзу через роговично-склеральный разрез.
9. Осторожно удалите все крупные, прикрепленные ткани из линзы с помощью тонких прямых щипцов.
10. При необходимости аккуратно прокатите линзу на чистой, деликатной салфетке с изогнутыми щипцами, чтобы удалить остатки прилипшей внелинзовой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро прокатите салфетку по рабочей салфетке и не допускайте чрезмерного высыхания ткани. На поверхности хрусталика могут быть небольшие помутнения из-за сухих пятен на капсуле хрусталика. Эти помутнения, как правило, обратимы, когда объектив помещается обратно в 1x PBS, и не влияют на последующие шаги.
11. Переложите очищенный объектив в чашку Петри диаметром 6 см с 1x PBS.
12. С помощью тонких прямых щипцов неглубоко проткните капсулу хрусталика вблизи экватора, и аккуратно оторвите капсулу хрусталика от волокнистой объемной массы. Эпителиальные клетки хрусталика останутся прикрепленными к капсуле. Аккуратно удалите из капсулы все крупные кусочки волокон, которые могли оторваться при декапсуляции.
13. Аккуратно захватите капсулу тонкими прямыми щипцами и втяните 1x PBS, чтобы удалить все оставшиеся волокна. Любые слабо прикрепленные волокнистые клетки будут диссоциироваться от капсулы и эпителиальных клеток.

3. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщенный рабочий процесс выделения РНК показан на рисунке 2.

1. Поместите 2 капсулы для линз или 2 волокнистые объемные массы в соответствующие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 400 мкл холодного реагента TRIzol.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Волокнистые массы следует перемещать из чашки в трубку с помощью изогнутых щипцов, чтобы зачерпнуть ткань.
2. Плотно закройте крышку и переместите пробирки в вытяжной шкаф для химических веществ для последующих действий.
3. Аккуратно гомогенизируйте волокна линз насыпными массами с помощью чистого пеллетного пестика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно полностью разбейте волокнистую массу.
4. Инкубировать образцы (капсулы линз или гомогенизированные волокнистые объемные массы) в ТРИзоле в течение 30 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
5. В вытяжной шкаф добавьте 200 μL хлороформа на 400 μL реагента TRIzol в каждую пробирку. Плотно закройте трубки и энергично встряхивайте рукой в течение 15 с, держа большой палец на дне трубки, а указательный палец на колпачке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, указанные в списке материалов, используются из-за герметичного уплотнения. При использовании микроцентрифужных пробирок других марок перед встряхиванием проверьте закрытие и уплотнение пробирки, так как раствор ТРИЗОЛа и хлороформа может вытекать из-под крышки пробирок, которые не имеют плотного уплотнения.
6. Инкубируйте образцы в течение 10-15 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить разделение фаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нижней части пробирки должен быть розовый слой реагента TRIzol, содержащий липиды и белок, белый слой между фазами, содержащими ДНК, и прозрачная водная фаза в верхней части, содержащая РНК. Белый слой ДНК может быть труднее увидеть в образцах эпителиальных клеток.
7. Центрифугируйте образцы при давлении 14 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемещайте пробирки в центрифугу и из нее, стараясь не нарушить фазы при переносе.
8. Соберите пробирки и реагенты из набора RNA Clean and Concentrator. Трубки со спиновой колонкой устанавливаются в сборную трубу из комплекта.
9. В вытяжном шкафу осторожно перенесите прозрачную водную фазу (верхний слой) в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, обращая внимание на объем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тревожить, прикасаться к белому слою ДНК и не затягивать его ниже водной фазы. Наклоняйте трубку при передаче водной фазы, чтобы не нарушить белый слой. Предпочтительно оставить небольшое количество водной фазы в пробирке, чтобы не загрязнять образец. Как правило, на 200 мкл добавленного хлороформа может быть восстановлено 180-190 мкл водной фазы.
10. Добавьте 200-градусный этанол в водную фазу в объемном соотношении 1:1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для связывания РНК из набора концентратора может быть добавлен в объемном соотношении 2:1 в водную фазу перед добавлением этанола. Этот этап пропускается для увеличения выхода РНК и потому, что РНК имеет достаточную чистоту после выделения.
11. Аккуратно перемешайте, несколько раз перевернув трубку или пипетируя раствор вверх и вниз. Перенесите смешанный раствор на спиновую колонку РНК с помощью пипеттора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не прикасайтесь к фильтру наконечником пипетки.
12. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется наносить маркировку на крышку колонки и боковую сторону сборной пробирки, чтобы сохранить комплекты пробирок организованными и в случае обрыва крышки на следующем этапе центрифугирования.
13. Откажитесь от проточного отверстия и добавьте 400 μL буфера для подготовки РНК в спиновую колонку.
14. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
15. Откажитесь от проточной части и добавьте 700 μL промывочного буфера РНК в спиновую колонку.
16. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
17. Выбросьте проточный слой и добавьте 400 μл буфера для промывки РНК в спиновую колонку.
18. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 1 мин при 4 °C.
19. Отбросьте проточный поток и еще раз центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4°C, чтобы убедиться, что спиновая колонна сухая.
20. Переместите спиновую колонку в новую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой.
21. Добавьте в мембранный фильтр 15 μл воды, не содержащей РНКазы. Выдерживать 2 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не прикасайтесь к фильтру наконечником пипетки.
22. Центрифугируйте спиновую колонку при 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C для элюирования очищенной РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл остается открытой во время центрифугирования. Осторожно разместите спиновые колонны и микроцентрифужные пробирки так, чтобы открытые крышки прилегали к крышке ротора, чтобы она не раскачивалась и не ломалась во время центрифугирования. Крышки должны повторять направление вращения ротора.
23. Удалите и выбросьте спин-колонны. РНК будет находиться в жидкости, собранной в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
24. Плотно закройте пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл и инкубируйте образцы РНК при температуре 55-65 °C в течение 10 минут, чтобы способствовать ресолюбилизации.
25. Сразу после этапа нагрева поместите образцы на лед.
26. Храните образцы при температуре -80 °C или обратное транскрибирование в кДНК для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы РНК хранились до 3 месяцев без заметной потери концентрации. Отбирайте образцы РНК в меньшие объемы для хранения, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания и предотвратить деградацию.

4. Измерение концентрации РНК с помощью УФ-ВИД спектрофотометра

1. Держите образцы РНК на льду, включите NanoDrop (УФ-ВИД спектрофотометр) и дайте прибору инициализироваться.
2. В меню «Нуклеиновые кислоты» выберите модуль «Количественное определение РНК».
3. Очистите УФ-ВИД спектрофотометр пипетированием 2,0 мкл элюента от ступени концентрации РНК на пьедестал, в данном случае на молекулярную воду. Опустите рычаг прибора и прочтите пустой образец.
4. Поднимите рычаг прибора, очистите пьедестал датчика с помощью чистой сухой деликатной рабочей салфетки, а затем еще одну салфетку, смоченную деионизированной водой, а затем еще одну сухую салфетку.
5. При необходимости введите данные образца в интерфейс УФ-ВИД спектрофотометра.
6. Загрузите 2,0 мкл образца РНК на пьедестал, опустите руку и количественно оцените.
7. Повторите шаги с 4.4 по 4.6, чтобы очистить пьедестал между образцами.
8. По завершении сохраните и экспортируйте эксперимент для дальнейшей количественной оценки, если это необходимо.

5. Обратная транскрипция

1. Используя высокотехнологичную и термостабильную обратную транскриптазу, выполните обратную транскрибацию 2,0 мкг РНК волокна хрусталика и всей экстрагированной эпителиальной РНК в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Смешайте реагенты и РНК для каждого образца в чистой ПЦР-пробирке. Храните все растворы и образцы РНК на льду.
   Примечание: Эта транскриптаза может осуществлять обратную транскрибацию до 2,5 мкг РНК за одну реакцию. Предполагается полное превращение РНК в кДНК, поэтому в качестве предполагаемой концентрации кДНК используется начальная концентрация РНК.
2. Запустите реакцию в термоамплификаторе, используя условия, перечисленные в таблице 1.
3. Храните кДНК с обратной транскрибацией при температуре -80 °C или перейдите к этапу количественной ПЦР.
   Примечание: образцы кДНК хранились до 4 месяцев без заметной деградации, так как кДНК более стабильна, чем РНК. Образцы, вероятно, могут храниться дольше при условии минимизации циклов замораживания-оттаивания.

Таблица 1: Условия термоамплификатора для обратной транскрипции. Эти условия настраиваются на специфичную, высокопроцессивную и термостабильную обратную транскриптазу. Условия работы могут варьироваться в зависимости от используемого фермента и набора.

6. Количественная ПЦР в реальном времени

1. Перед началом реакции приготовьте стоковые растворы кДНК до нужной концентрации, разбавив их молекулярной водой. В этих экспериментах 1 мкл кДНК будет использоваться при концентрации 5 нг/мкл для реакций 5 нг/лунка. Храните все растворы и образцы кДНК на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матричные планшеты TaqMan (формат 0,1 мл) рекомендуются для проведения реакций 5-50 нг кДНК на лунку. Получение аликвот кДНК полезно для ограничения циклов замораживания-оттаивания. В этом исследовании образцы были ограничены максимум 5 циклами замораживания-размораживания.
2. Подготовьте рабочий мастер-микс, состоящий из Advanced Master Mix и зондов в соответствии с коммерческими рекомендациями. Пример подготовки см. в разделе 7. Храните все растворы и образцы кДНК на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пара зондов с двумя разными красителями обычно используется для каждой лунки. Например, в этом исследовании в качестве зонда для генов был использован Crygs-FAM-MGB, а в качестве внутреннего контроля — Ppia-VIC-MGB. Коммерческие рекомендации для концентраций конечного зонда и праймера составляют 250 нМ и 900 нМ соответственно. Если мишень имеет очень высокую экспрессию, может потребоваться зонд с ограниченным праймером для предотвращения истощения реакционных реагентов.
3. Загрузите запас кДНК (1 мкл) в соответствующие лунки на планшете для количественной ПЦР, а затем рабочую исходную смесь (9 мкл). Смешивайте растворы, медленно пипетируя вверх и вниз при добавлении основной смеси. Следите за тем, чтобы капля кДНК была смешана с раствором, и избегайте образования пузырьков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от чувствительности цели, плиту может потребоваться погрузить на лед.
4. Запечатайте планшет для количественной ПЦР, осторожно наложив оптическую адгезивную крышку. Используйте аппликатор для клейкой пленки, чтобы разгладить крышку и обеспечить плотное уплотнение вокруг каждой лунки.
5. Вихревые пластины при 1000 об/мин в течение 10 с для смешивания.
6. Центрифугируйте планшеты при давлении 1000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что на дне лунок нет пузырьков воздуха.
7. Загрузите планшет в количественный термоамплификатор для ПЦР и запустите с использованием циклов, перечисленных в таблице 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычные протоколы количественной ПЦР обычно ограничены 40 циклами. Увеличение количества циклов вряд ли приведет к значимым результатам, так как за 40 циклов одна целевая копия теоретически может дать примерно 1 триллион^{ампликонов19}.

Таблица 2: Условия термоамплификатора для количественной полимеразной цепной реакции. Эти условия настраиваются на конкретную серию коммерческих анализов экспрессии генов. Используются параметры по умолчанию, за исключением увеличения циклов усиления с 40 до 45.

7. Пример расчета объема для количественной ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный код R для калькулятора объема для описанных ниже уравнений доступен в Дополнительном файле 1. Этот калькулятор предназначен для щупов Taqman и мастер-микса, перечисленных в Таблице материалов.

1. Определите количество лунок, которые необходимо провести пипетирование, и рассчитайте минимум 12,5% избытка. Эта избыточная постоянная (k_{Избыток}) компенсирует ошибку пипетирования и обеспечивает достаточное количество раствора. В этом примере в качестве мишени для пробоподготовки будут использоваться 96 скважин.
   Уравнение:
   
   Пример:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если превышение 12,5% не является целым числом, простой способ обеспечить "красивые" числа на последующих шагах - округлить до ближайшей скважины в большую сторону и соответствующим образом скорректировать k_{Избытка} .
2. Рассчитайте рабочий объем мастер-микса. В этих экспериментах на лунку используется 1 мкл кДНК и 9 мкл рабочей мастер-смеси. Объемы кДНК и мастер-микса можно регулировать по мере необходимости.
   Уравнение:
   
   Пример:
   
3. Рассчитайте модификатор концентрации (k_Conc). Этот модификатор используется для создания более концентрированной рабочей мастер-смеси, которая будет разбавляться в 1 раз при смешивании с кДНК.
   Уравнение:
   
   Пример:
   
4. Рассчитайте объем щупа (20x).
   Уравнение:
   
   Пример:
   
5. Рассчитайте объем основного микса (2x).
   Уравнение:
   
   Пример:
   
6. Доведите рабочую мастер-смесь до расчетного объема с помощью молекулярного H₂O.
   Уравнение:
   
   
   
   
   
   Пример:
   
   
   
   
   

Дополнительный файл 1: Исходный код R для калькулятора объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Эпителий и волокна хрусталика были выделены у мышей дикого типа в возрасте от 6 до 7 недель. Для этих экспериментов использовались три мыши, и 2 капсулы хрусталика или 2 волокнистые клеточные массы от каждой мыши были объединены вместе для одной биологической репликации. Как описано в протоколе, РНК экстрагировали с помощью разделения фаз реагента TRIzol. В среднем, пара эпителия линз и объемные массы волокон давали 0,8 мкг (SD ± 0,2) и 9,7 мкг (SD ± 2,3) РНК соответственно. Средняя концентрация в элюировании объемом 15 мкл составила 55,4 нг/мкл (SD ± 16,3) и 650,0 нг/л (SD ± 152,2) для образцов эпителия и волокна соответственно. Используя реакции 5 нг/лунка, это теоретически позволяет провести в среднем 160 реакций из одной пары эпителия хрусталика, выделенной с использованием этого протокола. Средняя чистота РНК, измеренная в соотношении A260/280, составила 1,92 (SD ± 0,05) для эпителия и 2,05 (SD ± 0,01) для волокон, что указывает на минимальное загрязнение белками. Как правило, соотношение A260/280 ~2,0 считается чистым для РНК20. В целом, такое выделение дало достаточную концентрацию высокочистой РНК для обратной транскрибации в кДНК и проведения повторных экспериментов с количественной ПЦР.

Мы провели обратную транскрипцию и кПЦР, как описано в протоколе. Мы выбрали 7 генов с известной высокой экспрессией транскриптов или белков в хрусталике для анализа количественной ПЦР в реальном времени, чтобы выявить дифференциальную экспрессию между тканевыми компартментами 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Относительная экспрессия проявляется в виде значений 2-ΔΔCq, нормализованных по отношению к эпителиальным клеткам (рис. 3). Среднее относительное выражение показано в виде средних геометрических значений со стандартными отклонениями. Благодаря известной дифференциальной экспрессии, коннексины использовали для определения успешного разделения эпителия и волоконных клеток. Коннексин 43 (Cx43; белок щелевого перехода альфа 1; Gja1) экспрессируется в эпителиальных клеткаххрусталика 33, Cx46 (Gja3) экспрессируется в клетках волокон хрусталика34, а Cx50 (Gja8) экспрессируется как в эпителиальных, так и в волокнистых клетках25,29. Наблюдается, что волокна хрусталика экспрессируют Gja1 и Gja8 примерно в 200 и 7,5 раз ниже, чем эпителий хрусталика, соответственно. Между тем, Gja3 примерно в 1,5 раза сильнее экспрессируется в волокнах хрусталика, что согласуется с предыдущими отчетами28.

Аналогичным образом, дифференциальная экспрессия наблюдалась с кадгеринами, а именно с E-кадгерином (Cdh1) и N-кадгерином (Cdh2). Экспрессия белка E-кадгерина ограничена эпителием хрусталика, в то время как N-кадгерин экспрессируется как в эпителии, так и в волокнах35. Здесь мы показываем, что экспрессия Cdh1 и Cdh2 примерно в 330 и 2,4 раза ниже в волокнах по сравнению с эпителием.

Два дополнительных эпителиальных и волоконных клеточных маркера, парные боксы 6 (Pax6) и γS-кристаллин (Crygs), соответственно, также были использованы для демонстрации успешного разделения хрусталиковых компартментов36,37. В соответствии с ранее наблюдаемыми паттернами экспрессии, Pax6 ограничен эпителиальными клетками, демонстрируя в 8 раз меньшую экспрессию в волокнах. Гамма-кристаллиновые белки экспрессируются в основном в клетках волокон хрусталика, и мы наблюдаем, что Crygs примерно в 3 раза больше в волокнах по сравнению с эпителием1. Эти данные указывают на чистое разделение эпителия хрусталика и волокнистой массы, что позволяет проводить транскриптомный анализ каждого тканевого компартмента для сравнения.

Рисунок 2: Пошаговая схема процесса выделения РНК. (A) Разделение фаз: шаги 3.1-3.11. Эти этапы описывают процесс гомогенизации первичной ткани, экстракции РНК и выделения РНК путем разделения кислот-гуанидиний-феноловых фаз. (B) Концентрация РНК: этапы 3.12-3.19. Эти этапы описывают промывку и концентрирование выделенной РНК с помощью колонок с очисткой и концентратором. (C) Элюирование: этапы 3.20-3.26. Эти этапы представляют собой элюирование РНК из очистных и обогатительных колонок с использованием воды, не содержащей РНКазы, и нагревание для содействия солюбилизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Относительная экспрессия генов при сравнении эпителия изолированного хрусталика с объемной массой клетчатки. Уровни РНК нормализуются в эпителиальном компартменте. Эпителиальные клеточные маркеры Gja1 [кодируют коннексин 43 (Cx43)], Chd1 (кодирует E-кадгерин) и Pax6 (кодируют транскрипционный фактор Pax6) демонстрируют повышенную экспрессию в эпителиальных клетках по сравнению с волоконными клетками. Маркеры волоконных клеток Gja3 (кодирует Cx46) и Crygs (кодирует γS-кристаллин) демонстрируют повышенную экспрессию по сравнению с эпителием. Маркеры, экспрессируемые как в эпителии, так и в волоконных клетках, Gja8 (кодирует Cx50) и Chd2 (кодирует N-кадгерин), демонстрируют обнаруживаемый сигнал в обоих компартментах. На графиках показаны средние геометрические значения со стандартными отклонениями с использованием метода 2-ΔΔCq . Статистическую значимость определяли с помощью двустороннего ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Шидака. * p ≤ 0,05; ** р≤ 0,01; р≤ 0,001; р≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.