Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение РНК из эпителия глазного хрусталика мыши и объемных масс волоконных клеток

914 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описывается разделение эпителия хрусталика глаза мыши и объемной массы волоконных клеток с последующим выделением РНК и анализом количественной ПЦР. Этот метод позволяет разделить клеточные компартменты хрусталика для более детального анализа транскриптома и биологических процессов в эпителиальных клетках по сравнению с дифференцированными волокнами.

Аннотация

Хрусталик представляет собой специализированную прозрачную ткань в передней камере глаза, которая состоит из двух основных типов клеток: эпителиальных клеток и волоконных клеток. Монослой эпителиальных клеток хрусталика покрывает переднюю полусферу хрусталика, в то время как большая часть хрусталика состоит из массы клеток хрусталика. Коллагеновая базальная мембрана, известная как капсула, окружает и инкапсулирует всю ткань. Эпителиальные клетки хрусталика прочно прилегают к капсуле хрусталика и могут быть легко отделены от массы объемных волокон путем отслаивания капсулы от ткани. Трудности с получением достаточной концентрации РНК из небольшого числа эпителиальных клеток в монослое хрусталика ранее препятствовали изучению транскриптомов эпителиальных клеток в сравнении с транскриптомами волоконных клеток. Этот протокол представляет собой метод четкого разделения и изоляции эпителиальных и волокнистых клеточных компартментов, а также этапов концентрации РНК для проведения последующих транскриптомных экспериментов на образцах эпителиальных клеток из одной пары линз мыши. Возможность исследования основных типов клеток хрусталика по отдельности помогает в исследовании биологических механизмов поддержания хрусталика и дисрегуляции, позволяя охарактеризовать специфические для типа клеток нарушения, ответственные за возрастные патологии хрусталика.

Введение

Глазной хрусталик — это прозрачный орган, который точно фокусирует свет на сетчатке для получения четкого изображения. Хрусталик состоит из двух основных типов клеток: монослоя эпителиальных клеток, покрывающего переднее полушарие, и волоконных клеток, составляющих основную массу ткани (рис. 1). Хрусталик покрыт коллагеновой базальной мембраной, известной как капсула хрусталика, к которой плотно прилегают эпителиальные клетки. По мере роста хрусталика эпителиальные клетки на экваторе пролиферируют и дифференцируются в зарождающиеся оболочки волоконных клеток, которые наслаиваются на хрусталик концентрическим образом 1,2,3. Пожизненный рост хрусталика зависит от непрерывной пролиферации этой небольшой популяции экваториальных эпителиальных клеток, составляющих герминативную зону4. По мере созревания волоконных клеток все клеточные органеллы разрушаются, чтобы устранить светорассеивающие объекты 5,6,7,8,9,10,11 и сохранить прозрачность тканей, а самые внутренние волоконные клетки в конечном итоге уплотняются, что приводит к образованию жесткого центра хрусталика 9,12. Благодаря окружающей капсуле хрусталика в хрусталике не происходит обновления клеток, и семенные волокна остаются в центре хрусталика на протяжении всей жизни, поскольку новые волокна добавляются на периферии ткани или в коре головного мозга. Волоконные клетки хрусталика обладают различными оптическими свойствами в зависимости от их возраста и могут обеспечить временную картину различных биологических характеристик на каждойданной стадии.

Несмотря на доступные хирургические варианты, катаракта, определяемая как любое помутнение в обычно прозрачном хрусталике, остается основной причиной слепотыв мире. Катаракта может проявляться в эпителии хрусталика, коре или ядре с различной патофизиологией15. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы образования катаракты остаются неясными16,17. Чтобы лучше понять, как предотвратить эти различные типы катаракты и разработать альтернативы хирургическому вмешательству, мы должны лучше понять, как эти различные типы клеток поддерживают свой гомеостаз в хрусталике.

Эпителиальные и волокнистые клетки играют разную физиологическую роль в хрусталике. Пролиферация клеток, например, ограничена эпителием хрусталика18. Между тем, волокна хрусталика составляют основную массу хрусталика, обеспечивая структуру и преломляющие свойства хрусталика9. Чтобы получить более детальное представление о биологических процессах, происходящих в различных отделах хрусталика, эпителиальные и волокнистые клетки должны быть исследованы отдельно. В данной работе мы представляем метод выделения эпителия из объемной массы волоконных клеток, извлечения мРНК из каждой фракции и анализа этих транскриптов с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Диаграмма анатомии хрусталика. Хрусталик состоит из двух типов клеток: монослойных эпителиальных клеток (синего и оранжевого), покрывающих переднее полушарие, и объемной массы волокон хрусталика (белого). Ткань окружена тонкой коллагеновой мембраной, известной как капсула хрусталика (тан). Передние эпителиальные клетки (синие) находятся в состоянии покоя, в то время как экваториальные эпителиальные клетки (оранжевые) пролиферируют, дифференцируются и удлиняются, превращаясь в новые слои волоконных клеток (белые) на периферии хрусталика. Новые поколения волоконных ячеек накладываются на предыдущие поколения волокон в концентрических оболочках. Самые старые клетки волокон хрусталика уплотняются в центре ткани. Эта цифра была изменена по сравнению с Cheng (2024)38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального института здравоохранения и утвержденным протоколом Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Индианы.

1. Рабочая зона, оборудование и подготовка реагентов

  1. Автоклавные наконечники для пипеток перед использованием и специальные коробки с автоклавными наконечниками для экспериментов с РНК, чтобы избежать загрязнения РНКазой.
  2. Обработайте рабочую поверхность в вытяжном шкафу и пестках для гомогенизации тканей раствором для обеззараживания РНКазы, тщательно промойте деионизированной водой и высушите.
  3. Замочите инструменты для препарирования (изогнутые щипцы, прямые щипцы и ножницы для микродиссекции) в 70% этаноле на 5 минут и высушите их тонкой салфеткой перед использованием.
  4. Используйте совершенно новые лотки для вскрытия и чашки Петри для вскрытия и выделения тканей.
  5. Аликвота 400 мкл холодного реагента ТРИЗОЛ кислота-гуанидиний-фенол в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл без ДНКазы и РНКазы в вытяжном шкафу.

2. Вскрытие хрусталика мыши

  1. Усыпляйте взрослых мышей с использованием передозировки CO2 с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичной меры.
  2. Энуклеируйте глаза с помощью изогнутых щипцов.
    1. Аккуратно надавите щипцами на ткань, окружающую глаз, в результате чего глаз выпячивается из глазницы. Закройте щипцы под глазом и снимите их, постепенно потянув вверх.
    2. Перенесите глаза в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 750-1000 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS).
  3. Для вскрытия перенесите глаза в лунки в лоток для вскрытия со свежим 1x PBS.
  4. Под диссекционным микроскопом с помощью прямых щипцов удерживайте основание зрительного нерва и разрежьте нерв как можно ближе к глазу острыми ножницами для микродиссекции.
  5. Осторожно вставьте тонкие прямые щипцы в отверстие, где был соединен зрительный нерв, и зажмите, чтобы удержать ткань на месте.
  6. Вставьте кончик ножниц для микродиссекции в это же отверстие и аккуратно разрежьте от заднего полюса глаза по направлению к роговично-склеральному соединению. Не вставляйте инструменты слишком глубоко, чтобы не повредить линзу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хрусталик грызуна занимает большой объем в глазу, поэтому рекомендуется делать неглубокие надрезы, чтобы предотвратить прокол хрусталика.
  7. Разрежьте вдоль роговично-склерального соединения с помощью ножниц для микродиссекции, отделив не менее половины окружности глаза.
  8. С помощью прямых щипцов аккуратно выверните ткани глаза, одновременно надавливая на роговицу, выдавливая линзу через роговично-склеральный разрез.
  9. Осторожно удалите все крупные, прикрепленные ткани из линзы с помощью тонких прямых щипцов.
  10. При необходимости аккуратно прокатите линзу на чистой, деликатной салфетке с изогнутыми щипцами, чтобы удалить остатки прилипшей внелинзовой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро прокатите салфетку по рабочей салфетке и не допускайте чрезмерного высыхания ткани. На поверхности хрусталика могут быть небольшие помутнения из-за сухих пятен на капсуле хрусталика. Эти помутнения, как правило, обратимы, когда объектив помещается обратно в 1x PBS, и не влияют на последующие шаги.
  11. Переложите очищенный объектив в чашку Петри диаметром 6 см с 1x PBS.
  12. С помощью тонких прямых щипцов неглубоко проткните капсулу хрусталика вблизи экватора, и аккуратно оторвите капсулу хрусталика от волокнистой объемной массы. Эпителиальные клетки хрусталика останутся прикрепленными к капсуле. Аккуратно удалите из капсулы все крупные кусочки волокон, которые могли оторваться при декапсуляции.
  13. Аккуратно захватите капсулу тонкими прямыми щипцами и втяните 1x PBS, чтобы удалить все оставшиеся волокна. Любые слабо прикрепленные волокнистые клетки будут диссоциироваться от капсулы и эпителиальных клеток.

3. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Обобщенный рабочий процесс выделения РНК показан на рисунке 2.

  1. Поместите 2 капсулы для линз или 2 волокнистые объемные массы в соответствующие микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 400 мкл холодного реагента TRIzol.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Волокнистые массы следует перемещать из чашки в трубку с помощью изогнутых щипцов, чтобы зачерпнуть ткань.
  2. Плотно закройте крышку и переместите пробирки в вытяжной шкаф для химических веществ для последующих действий.
  3. Аккуратно гомогенизируйте волокна линз насыпными массами с помощью чистого пеллетного пестика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно полностью разбейте волокнистую массу.
  4. Инкубировать образцы (капсулы линз или гомогенизированные волокнистые объемные массы) в ТРИзоле в течение 30 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу.
  5. В вытяжной шкаф добавьте 200 μL хлороформа на 400 μL реагента TRIzol в каждую пробирку. Плотно закройте трубки и энергично встряхивайте рукой в течение 15 с, держа большой палец на дне трубки, а указательный палец на колпачке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, указанные в списке материалов, используются из-за герметичного уплотнения. При использовании микроцентрифужных пробирок других марок перед встряхиванием проверьте закрытие и уплотнение пробирки, так как раствор ТРИЗОЛа и хлороформа может вытекать из-под крышки пробирок, которые не имеют плотного уплотнения.
  6. Инкубируйте образцы в течение 10-15 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить разделение фаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В нижней части пробирки должен быть розовый слой реагента TRIzol, содержащий липиды и белок, белый слой между фазами, содержащими ДНК, и прозрачная водная фаза в верхней части, содержащая РНК. Белый слой ДНК может быть труднее увидеть в образцах эпителиальных клеток.
  7. Центрифугируйте образцы при давлении 14 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемещайте пробирки в центрифугу и из нее, стараясь не нарушить фазы при переносе.
  8. Соберите пробирки и реагенты из набора RNA Clean and Concentrator. Трубки со спиновой колонкой устанавливаются в сборную трубу из комплекта.
  9. В вытяжном шкафу осторожно перенесите прозрачную водную фазу (верхний слой) в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, обращая внимание на объем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тревожить, прикасаться к белому слою ДНК и не затягивать его ниже водной фазы. Наклоняйте трубку при передаче водной фазы, чтобы не нарушить белый слой. Предпочтительно оставить небольшое количество водной фазы в пробирке, чтобы не загрязнять образец. Как правило, на 200 мкл добавленного хлороформа может быть восстановлено 180-190 мкл водной фазы.
  10. Добавьте 200-градусный этанол в водную фазу в объемном соотношении 1:1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для связывания РНК из набора концентратора может быть добавлен в объемном соотношении 2:1 в водную фазу перед добавлением этанола. Этот этап пропускается для увеличения выхода РНК и потому, что РНК имеет достаточную чистоту после выделения.
  11. Аккуратно перемешайте, несколько раз перевернув трубку или пипетируя раствор вверх и вниз. Перенесите смешанный раствор на спиновую колонку РНК с помощью пипеттора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не прикасайтесь к фильтру наконечником пипетки.
  12. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется наносить маркировку на крышку колонки и боковую сторону сборной пробирки, чтобы сохранить комплекты пробирок организованными и в случае обрыва крышки на следующем этапе центрифугирования.
  13. Откажитесь от проточного отверстия и добавьте 400 μL буфера для подготовки РНК в спиновую колонку.
  14. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
  15. Откажитесь от проточной части и добавьте 700 μL промывочного буфера РНК в спиновую колонку.
  16. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
  17. Выбросьте проточный слой и добавьте 400 μл буфера для промывки РНК в спиновую колонку.
  18. Центрифуга вращает колонны при давлении 16 000 x g в течение 1 мин при 4 °C.
  19. Отбросьте проточный поток и еще раз центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 30 с при 4°C, чтобы убедиться, что спиновая колонна сухая.
  20. Переместите спиновую колонку в новую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой.
  21. Добавьте в мембранный фильтр 15 μл воды, не содержащей РНКазы. Выдерживать 2 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не прикасайтесь к фильтру наконечником пипетки.
  22. Центрифугируйте спиновую колонку при 16 000 x g в течение 30 с при 4 °C для элюирования очищенной РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл остается открытой во время центрифугирования. Осторожно разместите спиновые колонны и микроцентрифужные пробирки так, чтобы открытые крышки прилегали к крышке ротора, чтобы она не раскачивалась и не ломалась во время центрифугирования. Крышки должны повторять направление вращения ротора.
  23. Удалите и выбросьте спин-колонны. РНК будет находиться в жидкости, собранной в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл.
  24. Плотно закройте пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл и инкубируйте образцы РНК при температуре 55-65 °C в течение 10 минут, чтобы способствовать ресолюбилизации.
  25. Сразу после этапа нагрева поместите образцы на лед.
  26. Храните образцы при температуре -80 °C или обратное транскрибирование в кДНК для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы РНК хранились до 3 месяцев без заметной потери концентрации. Отбирайте образцы РНК в меньшие объемы для хранения, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттаивания и предотвратить деградацию.

4. Измерение концентрации РНК с помощью УФ-ВИД спектрофотометра

  1. Держите образцы РНК на льду, включите NanoDrop (УФ-ВИД спектрофотометр) и дайте прибору инициализироваться.
  2. В меню «Нуклеиновые кислоты» выберите модуль «Количественное определение РНК».
  3. Очистите УФ-ВИД спектрофотометр пипетированием 2,0 мкл элюента от ступени концентрации РНК на пьедестал, в данном случае на молекулярную воду. Опустите рычаг прибора и прочтите пустой образец.
  4. Поднимите рычаг прибора, очистите пьедестал датчика с помощью чистой сухой деликатной рабочей салфетки, а затем еще одну салфетку, смоченную деионизированной водой, а затем еще одну сухую салфетку.
  5. При необходимости введите данные образца в интерфейс УФ-ВИД спектрофотометра.
  6. Загрузите 2,0 мкл образца РНК на пьедестал, опустите руку и количественно оцените.
  7. Повторите шаги с 4.4 по 4.6, чтобы очистить пьедестал между образцами.
  8. По завершении сохраните и экспортируйте эксперимент для дальнейшей количественной оценки, если это необходимо.

5. Обратная транскрипция

  1. Используя высокотехнологичную и термостабильную обратную транскриптазу, выполните обратную транскрибацию 2,0 мкг РНК волокна хрусталика и всей экстрагированной эпителиальной РНК в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Смешайте реагенты и РНК для каждого образца в чистой ПЦР-пробирке. Храните все растворы и образцы РНК на льду.
    Примечание: Эта транскриптаза может осуществлять обратную транскрибацию до 2,5 мкг РНК за одну реакцию. Предполагается полное превращение РНК в кДНК, поэтому в качестве предполагаемой концентрации кДНК используется начальная концентрация РНК.
  2. Запустите реакцию в термоамплификаторе, используя условия, перечисленные в таблице 1.
  3. Храните кДНК с обратной транскрибацией при температуре -80 °C или перейдите к этапу количественной ПЦР.
    Примечание: образцы кДНК хранились до 4 месяцев без заметной деградации, так как кДНК более стабильна, чем РНК. Образцы, вероятно, могут храниться дольше при условии минимизации циклов замораживания-оттаивания.
ШагТемпература (°C)Время (мин)Циклов
Отжиг25101
Обратная транскрипция50101
Инактивация ферментов8551
Держать4∞1

Таблица 1: Условия термоамплификатора для обратной транскрипции. Эти условия настраиваются на специфичную, высокопроцессивную и термостабильную обратную транскриптазу. Условия работы могут варьироваться в зависимости от используемого фермента и набора.

6. Количественная ПЦР в реальном времени

  1. Перед началом реакции приготовьте стоковые растворы кДНК до нужной концентрации, разбавив их молекулярной водой. В этих экспериментах 1 мкл кДНК будет использоваться при концентрации 5 нг/мкл для реакций 5 нг/лунка. Храните все растворы и образцы кДНК на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матричные планшеты TaqMan (формат 0,1 мл) рекомендуются для проведения реакций 5-50 нг кДНК на лунку. Получение аликвот кДНК полезно для ограничения циклов замораживания-оттаивания. В этом исследовании образцы были ограничены максимум 5 циклами замораживания-размораживания.
  2. Подготовьте рабочий мастер-микс, состоящий из Advanced Master Mix и зондов в соответствии с коммерческими рекомендациями. Пример подготовки см. в разделе 7. Храните все растворы и образцы кДНК на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пара зондов с двумя разными красителями обычно используется для каждой лунки. Например, в этом исследовании в качестве зонда для генов был использован Crygs-FAM-MGB, а в качестве внутреннего контроля — Ppia-VIC-MGB. Коммерческие рекомендации для концентраций конечного зонда и праймера составляют 250 нМ и 900 нМ соответственно. Если мишень имеет очень высокую экспрессию, может потребоваться зонд с ограниченным праймером для предотвращения истощения реакционных реагентов.
  3. Загрузите запас кДНК (1 мкл) в соответствующие лунки на планшете для количественной ПЦР, а затем рабочую исходную смесь (9 мкл). Смешивайте растворы, медленно пипетируя вверх и вниз при добавлении основной смеси. Следите за тем, чтобы капля кДНК была смешана с раствором, и избегайте образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от чувствительности цели, плиту может потребоваться погрузить на лед.
  4. Запечатайте планшет для количественной ПЦР, осторожно наложив оптическую адгезивную крышку. Используйте аппликатор для клейкой пленки, чтобы разгладить крышку и обеспечить плотное уплотнение вокруг каждой лунки.
  5. Вихревые пластины при 1000 об/мин в течение 10 с для смешивания.
  6. Центрифугируйте планшеты при давлении 1000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что на дне лунок нет пузырьков воздуха.
  7. Загрузите планшет в количественный термоамплификатор для ПЦР и запустите с использованием циклов, перечисленных в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычные протоколы количественной ПЦР обычно ограничены 40 циклами. Увеличение количества циклов вряд ли приведет к значимым результатам, так как за 40 циклов одна целевая копия теоретически может дать примерно 1 триллионампликонов19.
ШагТемпература (°C)Время(ы)Циклов
Инактивация урацил-N-гликозилазы (UNG)501201
Денатурация951201
Денатурация95145
Отжиг6020
Держать4∞1

Таблица 2: Условия термоамплификатора для количественной полимеразной цепной реакции. Эти условия настраиваются на конкретную серию коммерческих анализов экспрессии генов. Используются параметры по умолчанию, за исключением увеличения циклов усиления с 40 до 45.

7. Пример расчета объема для количественной ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный код R для калькулятора объема для описанных ниже уравнений доступен в Дополнительном файле 1. Этот калькулятор предназначен для щупов Taqman и мастер-микса, перечисленных в Таблице материалов.

  1. Определите количество лунок, которые необходимо провести пипетирование, и рассчитайте минимум 12,5% избытка. Эта избыточная постоянная (kИзбыток) компенсирует ошибку пипетирования и обеспечивает достаточное количество раствора. В этом примере в качестве мишени для пробоподготовки будут использоваться 96 скважин.
    Уравнение:
    figure-protocol-1
    Пример:
    figure-protocol-2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если превышение 12,5% не является целым числом, простой способ обеспечить "красивые" числа на последующих шагах - округлить до ближайшей скважины в большую сторону и соответствующим образом скорректировать kИзбытка .
  2. Рассчитайте рабочий объем мастер-микса. В этих экспериментах на лунку используется 1 мкл кДНК и 9 мкл рабочей мастер-смеси. Объемы кДНК и мастер-микса можно регулировать по мере необходимости.
    Уравнение:
    figure-protocol-3
    Пример:
    figure-protocol-4
  3. Рассчитайте модификатор концентрации (kConc). Этот модификатор используется для создания более концентрированной рабочей мастер-смеси, которая будет разбавляться в 1 раз при смешивании с кДНК.
    Уравнение:
    figure-protocol-5
    Пример:
    figure-protocol-6
  4. Рассчитайте объем щупа (20x).
    Уравнение:
    figure-protocol-7
    Пример:
    figure-protocol-8
  5. Рассчитайте объем основного микса (2x).
    Уравнение:
    figure-protocol-9
    Пример:
    figure-protocol-10
  6. Доведите рабочую мастер-смесь до расчетного объема с помощью молекулярного H2O.
    Уравнение:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Пример:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Дополнительный файл 1: Исходный код R для калькулятора объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эпителий и волокна хрусталика были выделены у мышей дикого типа в возрасте от 6 до 7 недель. Для этих экспериментов использовались три мыши, и 2 капсулы хрусталика или 2 волокнистые клеточные массы от каждой мыши были объединены вместе для одной биологической репликации. Как описано в протоколе, РНК экстрагировали с помощью разделения фаз реагента TRIzol. В среднем, пара эпителия линз и объемные массы волокон давали 0,8 мкг (SD ± 0,2) и 9,7 мкг (SD ± 2,3) РНК соответственно. Средняя концентрация в элюировании объемом 15 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленные здесь шаги демонстрируют способность выделять РНК из отдельных отсеков хрусталика, которые могут быть успешно реверсивно транскрибированы в кДНК для методов молекулярной биологии. Из-за чувствительного характера методов анализа важно, чтобы хрусталик был чистым от прикрепленных тканей на этапе диссекции. Для этого может потребоваться несколько итераций прокатывания объектива на Kimwipe для достижения достаточной чистоты. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проникну...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована грантом R01 EY032056 (CC) от Национального института глаза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифуга и роторНаучный центр Фишера14285554ПМ
Хлороформ, марка ВЭЖХАльфа Аэсар22920
Этанол (190 градусов)Лаборатории Decon2801
Этанол (200 градусов)Биореагенты ФишераБП2818
Пестик для пеллет FisherbrandНаучный центр Фишера12-141-363
щипцы, изогнутые; Студенческий пинцет #7Мировые прецизионные приборы501981
щипцы прямые; Дюмон #5Инструменты для точной науки11252-40
щипцы прямые; Студенческий пинцет #4Мировые прецизионные приборы501978
Кимвайпы, маленькиеКимберли-Кларк34155Деликатная очистка задач
Аппликатор клейкой пленки MicroAmpПрикладные биосистемы4333183
MicroAmp EnduraPlate Оптическая 96-луночная быстрая прозрачная реакционная пластина со штрих-кодомПрикладные биосистемы4483485
МикропипеткиЭппендорф  01-671-120
Микроскоп, ДиссекцияКарл ЦейссSteREO Discovery.V8
МиниАмп Оптический клейкий чехолПрикладные биосистемы4360954
Термоамплификатор MiniAmpПрикладные биосистемыА37834
MixMate Пластинчатый вихревой миксерЭппендорф5353000529
Молекулярная водаНаучный центр ФишераBP28191
Nanodrop Одномикрообъемный УФ-Вид спектрофотометрТермо СайентиалНД-ОДИН-В
Мини-лотки Nunc MicroWellНаучный центр Фишера12-565-154Поддон для препарирования
ПЦР-пробиркиВВР201007-012
Чашка Петри, 60 мм x 15 ммНаучный центр ФишераFB0875713A
Фосфатно-солевой буфер, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Наконечники для пипеток, 10 & микро; L ВыпускникСША Сайентифик1161-3700
Наконечники для пипеток, 1250 & микро; L XL ГрадуированныйСША Сайентифик1161-1720
Наконечники для пипеток, 200 &; L Профиль ГрадуированныйСША Сайентифик1163-1700
Система ПЦР в реальном времени QuantStudio 3Прикладные биосистемыА28567
Обратная транскриптаза, SuperScript IV VILO Инвитроген11756050Высокотехнологичная и термостабильная обратная транскриптаза
Набор для очистки и концентратора РНК 5ЗимоЗР1013
Вода, не содержащая РНКазыБиореагенты ФишераБП2819
РНКазеЗапСигмаР2020Решение для обеззараживания РНКазы
Микроцентрифуга SealRite 1,5 мл ПробиркиСША Сайентифик1615-5500
SuperFine Vannas 8 смМировые прецизионные приборы501778Ножницы
TaqMan FAST Advanced Master Mix для количественной ПЦРПрикладные биосистемы4444557
TaqMan Зонд для анализа экспрессии генов (FAM) (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
ТРИЗОЛИнвитроген15596026Кислотно-гуанидиний-фенольный раствор
Вихревой смесительТермо Сайентиал88880017

Ссылки

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
  7. Bassnett, S. Lens organelle degradation. Exp Eye Res. 74 (1), 1-6 (2002).
  8. Bassnett, S., Beebe, D. C. Coincident loss of mitochondria and nuclei during lens fiber cell differentiation. Dev Dyn. 194 (2), 85-93 (1992).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: Structural determinants of eye lens transparency. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Vrensen, G. F., Graw, J., De Wolf, A. Nuclear breakdown during terminal differentiation of primary lens fibres in mice: A transmission electron microscopic study. Exp Eye Res. 52 (6), 647-659 (1991).
  11. Counis, M. F., et al. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. Cell Death Differ. 5 (4), 251-261 (1998).
  12. Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
  13. Al-Khudari, S., Donohue, S. T., Al-Ghoul, W. M., Al-Ghoul, K. J. Age-related compaction of lens fibers affects the structure and optical properties of rabbit lenses. BMC Ophthalmol. 7, 19(2007).
  14. World Report on Vision. , World Health Organization. Geneva. (2019).
  15. Hashemi, H., et al. Global and regional prevalence of age-related cataract: A comprehensive systematic review and meta-analysis. Eye (Lond). 34 (8), 1357-1370 (2020).
  16. Cheng, C., Gong, X. Diverse roles of eph/ephrin signaling in the mouse lens. PLoS One. 6 (11), e28147(2011).
  17. Ibaraki, N. A brighter future for cataract surgery. Nat Med. 3 (9), 958-960 (1997).
  18. Scullica, L., Grimes, P., Mcelvain, N. Further autoradiographic studies of the lens epithelium. Normal and x-irradiated rat eyes. Arch Ophthalmol. 70, 659-665 (1963).
  19. Caraguel, C. G., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I. R., Hammell, K. L. Selection of a cutoff value for real-time polymerase chain reaction results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epidemiologic approaches. J Vet Diagn Invest. 23 (1), 2-15 (2011).
  20. 60/280 and 260/230 ratios. , Thermo Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/Product-Bulletins/T123-NanoDrop-Lite-Interpretation-of-Nucleic-Acid-260-280-Ratios.pdf (2009).
  21. Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues. J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).
  22. Gong, X., Cheng, C., Xia, C. H. Connexins in lens development and cataractogenesis. J Membr Biol. 218 (1-3), 9-12 (2007).
  23. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for n-cadherin linked c-src and fyn kinases in lens development. Dev Dyn. 242 (5), 469-484 (2013).
  24. Leonard, M., et al. Modulation of n-cadherin junctions and their role as epicenters of differentiation-specific actin regulation in the developing lens. Dev Biol. 349 (2), 363-377 (2011).
  25. Logan, C. M., et al. N-cadherin regulates signaling mechanisms required for lens fiber cell elongation and lens morphogenesis. Dev Biol. 428 (1), 118-134 (2017).
  26. Maddala, R., Nagendran, T., Lang, R. A., Morozov, A., Rao, P. V. Rap1 gtpase is required for mouse lens epithelial maintenance and morphogenesis. Dev Biol. 406 (1), 74-91 (2015).
  27. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  28. Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes. J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).
  29. Rong, P., et al. Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation. Development. 129 (1), 167-174 (2002).
  30. Terrell, A. M., et al. Molecular characterization of mouse lens epithelial cell lines and their suitability to study RNA granules and cataract associated genes. Exp Eye Res. 131, 42-55 (2015).
  31. White, T. W., Bruzzone, R., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Mouse cx50, a functional member of the connexin family of gap junction proteins, is the lens fiber protein mp70. Molecular Biology of the Cell. 3 (7), 711-720 (1992).
  32. Xia, C. H., et al. Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).
  33. Beyer, E. C., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Connexin43: A protein from rat heart homologous to a gap junction protein from liver. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2621-2629 (1987).
  34. Gong, X., et al. Disruption of Alpha3 connexin gene leads to proteolysis and cataractogenesis in mice. Cell. 91 (6), 833-843 (1997).
  35. Xu, L., Overbeek, P. A., Reneker, L. W. Systematic analysis of E-, N- and P-cadherin expression in mouse eye development. Exp Eye Res. 74 (6), 753-760 (2002).
  36. Nishina, S., et al. Pax6 expression in the developing human eye. Br J Ophthalmol. 83 (6), 723-727 (1999).
  37. Wistow, G., et al. Gamman-crystallin and the evolution of the betagamma-crystallin superfamily in vertebrates. FEBS J. 272 (9), 2276-2291 (2005).
  38. Cheng, C. Tissue, cellular, and molecular level determinants for eye lens stiffness and elasticity. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1456474(2024).
  39. Huynh, P. N., Cheng, C. Spatial-temporal comparison of eph/ephrin gene expression in ocular lenses from aging and knockout mice. Front Ophthalmol (Lausanne). 4, 1410860(2024).
  40. Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation. J Vis Exp. (31), e1519(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение РНК из эпителия глазного хрусталика мыши и объемных масс волоконных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.