В данном исследовании представлен метод оценки функции PAK5 в ESCC, показывая, что его сверхэкспрессия предсказывает неблагоприятный прогноз и способствует прогрессированию опухоли по оси сигнализации PAK5-GAREM1.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В данном исследовании представлен метод оценки функции PAK5 в ESCC, показывая, что его сверхэкспрессия предсказывает неблагоприятный прогноз и способствует прогрессированию опухоли по оси сигнализации PAK5-GAREM1.
Плоскоклеточная карцинома пищевода (ESCC) является одной из ведущих причин смертности, связанной с раком, во всём мире, особенно в Азии. Из-за отсутствия ранних симптомов большинству пациентов ставят диагнозы на поздних стадиях, что ограничивает эффективность лечения и ухудшает прогноз. Понимание механизмов, лежащих в основе ESCC, и выявление биомаркеров или терапевтических целей имеют решающее значение для улучшения исходов лечения пациентов. P21-активированная протеинкиназа 5 (PAK5), представитель семейства митоген-активированных протеинкиназ, была связана с различными злокачественными явлениями через регуляцию клеточного цикла, миграции и инвазии. Однако её роль в ESCC остаётся неясной. В этом исследовании оценивалась экспрессия PAK5 в тканях ESCC и соседних нормальных тканях с помощью иммуногистохимии и провёл анализ выживаемости Каплана-Мейера для оценки связи между PAK5 и прогнозом. Были установлены модели ESCC клеток с гиперэкспрессией и снижением PAK5, а также проведены функциональные анализы, включая CCK-8, формирование колоний и анализы Transwell. Кроме того, было проведено секвенирование мРНК для выявления следующих целей и сигнальных путей, регулируемых PAK5. Эти результаты показали, что экспрессия PAK5 была значительно повышена в тканях ESCC по сравнению с нормальными тканями и была связана с плохим прогнозом. Функциональные анализы показали, что PAK5 способствует пролиферации клеток ESCC, формированию колоний, миграции и инвазии, в то время как транскриптомический анализ выделил GAREM1 как ключевой эффектор на последующих этапах. Эти данные свидетельствуют о том, что PAK5 способствует прогрессированию ESCC и может служить прогностическим биомаркером и терапевтической мишенью.
В мире рак пищевода входит в число самых смертоносных злокачественных заболеваний. В Китае преобладающим гистологическим подтипом является плоскоклеточный карцинома пищевода (ESCC). Хотя достигнуты терапевтические достижения, прогноз для пациентов с ESCC остаётся мрачным, проявляясь всего в 10–25% 5-летнейвыживаемости 1. Это во многом связано с трудностями раннего выявления и ограниченным доступом эффективных молекулярно-таргетированныхтерапий 2. В отличие от других солидных опухолей, где таргетная терапия показала значительные перспективы, такие подходы в ESCC всё ещё находятся в зачаточном состоянии из-за нехватки эффективных молекулярных мишеней.
PAK5, PAK группы II, интегрирует динамику цитоскелета и сигнализацию, поддерживающую выживание, и был связан с химиорезистентностью при рядезлокачественных опухолей: 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Учитывая важную роль сигнализации MAPK в биологии и терапии ESCC 1,2,12, была выдвинута гипотеза, что PAK5 повышен в ESCC и способствует развитию злокачественных фенотипов через модуляцию сигнализации MAPK, возможно, с участием GAREM1 в качестве адаптера/регулятора 13,14,15,16 . Для проверки этой гипотезы использовались количественный IHC, функциональная генетическая возмущения и транскриптомическое профилирование.
Лечение ESCC обычно включает сочетание эзофагэктомии, химиотерапии и лучевой терапии. Хотя эзофагэктомия может быть лечебной, она несёт высокий рискзаболеваемости 4,8. Кроме того, как химиотерапия, так и лучевая терапия часто не удаляют все раковые клетки, что приводит к резистентности, рецидиву и метастазированию 8,9. Иммунотерапия в последнее время стала заметным направлением в онкологии, демонстрируя эффективность в лечении запередоленных видов рака. Этот растущий интерес подчёркивает острую необходимость новых биомаркеров, которые могут помочь в ранней диагностике и планировании лечения ESCC. Предыдущие исследования показали, что другие члены семейства PAK, такие как PAK1 и PAK4, способствуют пролиферации, инвазии и устойчивости к терапии в ESCC, что подчёркивает важность этого семейства киназ в биологии ESCC. Однако роль PAK5, менее изученного PAK группы II, остаётся плохо определенной, что стало мотивом для текущего исследования 17,18.
P21-активированная киназа 5 (PAK5), представитель подсемейства PAK II, была впервые идентифицирована как мозгоспецифическая киназа в 2002 году. Расположенный на хромосоме 20p12, PAK5 кодирует белок примерно 80 кДа и в основном обнаруживается в митохондриях и ядре, где играет различные роли в клеточнойрегуляции 10,11,13. Его функции в митохондриях включают энергетический метаболизм и регуляцию, а ядерное присутствие связано с транскрипцией генов и контролем клеточного цикла. Хотя PAK5 изучен меньше, чем его аналоги, считается, что он играет ключевую роль в нейроразвитии, выживании клеток и прогрессировании рака10. Примечательно, что PAK5 участвует в регуляции цитоскелета, антиапоптотических механизмах и клеточнойпролиферации 12. Его апрегуляция в неопластических клетках связана с эмерджентной лекарственной резистентностью, что соответствует данным, связывающим гиперэкспрессию PAK5 с повышенной устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапии 10,11,13,14. Тем не менее, точная роль PAK5 в развитии ESCC остаётся неясной. В данном исследовании изучается влияние PAK5 на транскриптомическую среду ESCC и её функциональные последствия. Транскриптомическое профилирование было проведено для выявления изменений экспрессии генов, связанных с активностью PAK5 в клетках ESCC. Кроме того, была создана модель ESCC клеток с контролируемой модуляцией PAK5 для разъяснения её роли в росте опухоли и метастатическом потенциале. В отличие от традиционных стратегий обнаружения биомаркеров в ESCC, которые в основном основаны на западном блоттинге или измерениях транскрипта с одной модальностью, текущий рабочий процесс интегрирует количественную иммуногистохимию, транскриптомическое профилирование и функциональные анализы. Этот комбинированный подход позволяет одновременно проводить молекулярную и фенотипическую валидацию, предоставляя механистическое понимание и повышая биологическую значимость. Кроме того, протокол делает акцент на экспериментальной воспроизводимости, используя парные образцы опухоли и смежных тканей, стандартизированные процедуры иммунного окрашивания и высококачественные входы РНК (число целостности РНК ≥ 7) для секвенирования. Эти особенности повышают устойчивость и применимость анализов в лабораториях, особенно для исследований, направленных на определение клинически значимых регуляторных сетей, управляемых киназами, в ESCC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры были утверждены Этическим комитетом Второй аффилированной больницы Хайнаньского медицинского университета (Одобрение No LW2022602), и информированное согласие было получено от каждого участника в соответствии с Хельсинкской декларацией. Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Сбор образцов пациентов и тканей
Всего было зарегистрировано 40 пациентов с патологически подтверждённой ESCC, все имели нормальную печёночную и почечную функцию до операции. Образцы опухоли (группа T) и прилегающие нормальные ткани (группа N; ≥2 см от края опухоли) были собраны сразу после хирургического удаления. Ткани фиксировались в 4% параформальдегиде (PFA) в PBS при комнатной температуре в течение 7 дней до внедрения парафина.
2. Иммуногистохимическое окрашивание
Блоки с парафином разделялись с диаметром 5 мкм и запекались при 60 °C в течение 1 часа. Срезы депарафинизировались с помощью заместителя ксилола, регидратированы с помощью градированного этанола и подвергались антигенной заборке в буфере цитрата натрия с концентрацией 10 мкм (pH 6,0) при 95-98 °C в течение 20 минут. Эндогенная пероксидазная активность была закалена 3% перекисью водорода в течение 10 минут, затем блокировалась 5% нормальной сывороткой в течение 30 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали ночью (12-16 часов) при 4 °C с первичным антителом против PAK5 (разбавление 1:100, см. таблицу материалов). После промывки с PBS стекли инкубировали с хрен пероксидазой вторичного антитела в течение 30 минут при комнатной температуре, затем проявляли с помощью DAB до появления цвета (1-5 минут, под микроскопом для предотвращения чрезмерного окрашивания) и контрокрашивались гематоксилином в течение 30-60 секунд. Секции были обезвожены, установлены и сфотографированы под микроскопом яркого поля. Интенсивность окрашивания и доля положительных клеток были количественно измерены с помощью программного обеспечения для анализа изображений с как минимум пятью случайными полями на секцию (200× увеличения). Метод количественной оценки использовал вычисление H-score с формулой: H-score = ∑ (степень интенсивности окрашивания × процент положительных клеток) (интенсивность оценена как 0 = отрицательная, 1 = слабая, 2 = умеренная, 3 = сильная; процент классифицируется как 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Для обеспечения надёжности два независимых патологоанатома провели слепое оценку с межнаблюдательным соглашением κ ≥ 0,75. Критерии контроля качества строго соблюдались: положительные контроли (известная PAK5-положительная ткань ESCC) и отрицательные контроли (первичные антитела заменены на PBS) должны пройти валидацию; интенсивность окрашивания фона должна быть ниже заранее установленного порога (например, H-score < 50); коэффициент вариации (CV) результатов окрашивания по дублирующимся партиям должен составлять <20%, чтобы исключить экспериментальную вариабельность.
3. Клеточные линии и культура
Клетки KYSE-150 (человеческая ESCC) и HEK-293 (упаковка вирусов) были аутентифицированы с помощью профилирования короткого тандемного повтора (STR) и подтверждены отсутствием микоплазмы. Клетки KYSE-150 культивировались в среде RPMI-1640 с дополнением 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки HEK-293 содержались в DMEM с дополнением тех же добавок. Клетки субкультивировались с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА при достигнуте слияния 70%-80%, а за 24 часа до каждого эксперимента — с соответствующими плотностями.
4. Создание лентивирусных векторов и инфекция
Лентивирусные векторы были разработаны либо для чрезмерной экспрессии PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro), либо для подавления PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). Клетки HEK-293 были засеяны в антенны диаметром 10 см и трансфектированы при слиянии 70%–80% с переносной плазмидой, упаковочными плазмидами (GAG/POL и Rev) и оболочающей плазмидой (VSV-G) в соотношении 4:3:1 с использованием липидного трансфекционного реагента, с общим количеством ДНК ~20 мкг на 10 см антенну. Среда была заменена через 6-8 часов после трансфекции. Вирусные супернатанты собирались через 48 и 72 часа, центрифугировали при 500 × г в течение 10 минут для удаления мусора, фильтровались через фильтр 0,45 мкм и концентрировались или хранили при −80 °C. Для трансдукции клетки KYSE-150 были засеяны за день до заражения и подвергались воздействию вирусного супернатанта при множестве инфекции (MOI) 5-10 при наличии полибрена 8 мкг/мл. MOI определялся как отношение инфекционных единиц к числу целевых клеток. Был проведён предварительный эксперимент для оценки MOI с помощью подсчёта GFP или qPCR, и был выбран MOI 5-10. Среда была заменена через 12–16 часов, а кривая поражения пуромицина была установлена путём обработки нетрансдуцированных клеток с концентрацией пуромицина от 0 до 4 мкг/мл в течение 72-96 часов для определения минимальной смертельной концентрации. Выбранная концентрация для отбора составляла 1-2 мкг/мл, а поддерживающая концентрация — 0,5–1 мкг/мл. Клетки отбирались с пуромицином (1-2 мкг/мл) начиная через 48 часов. Гиперэкспрессия или заглушание PAK5 верифицировалось с помощью RT-qPCR с использованием специфических праймеров для PAK5 (вперёд 5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, обратно 5′-AGGCCGTTGATGGGGTTC-3′) и GAPDH (вперед 5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′, обратно 5′-AAAGGGTAACGCAACTA-3′). Относительная экспрессия PAK5 была рассчитана методом 2−ΔΔCt . Все эксперименты проводились как минимум с тремя биологическими репликами.
5. Анализ жизнеспособности клеток CCK-8
Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью Cell Counting Kit-8 (CCK-8), основанного на восстановлении реагента WST-8 с помощью клеточных дегидрогеназ. Логарифмически растущие ячейки KYSE-150 были засеяны по 2000 ячеек на каждую скважину в пластинах с 96 лунками в полной среде по 100 мкл. На 0, 24, 48, 72 и 96 часа в каждую скважину добавлялось 10 мкл реагента CCK-8 (содержащего WST-8). После инкубации при 37 °C в течение 2 часов поглощение измерялось на 450 нм (A450) с помощью считывателя микропластин. Были включены пустые скважины, содержащие только среду. Каждая экспериментальная группа содержала как минимум три биологических репликатов, и каждое измерение проводилось с помощью пяти технических репликатов.
6. Анализ формирования колоний
Одиночные суспензии KYSE-150 были засеяны по 1000 ячеек на скважину в пластинах с 6 лунками и культивировались в течение 14 дней, при этом среду заменяли каждые 2-3 дня. Колонии фиксировались 4% PFA в течение 15 минут, окрашивались 0,1% кристаллической фиолетовой в 20% метанола в течение 15 минут, промывались водой и сушили на воздухе. Колонии, содержащие более 50 клеток, подсчитывались с помощью программного обеспечения для анализа изображений, и рассчитывалась скорость формирования колоний.
7. Анализ инвазии в Трансвелле
Вставки с порами 8 мкм предварительно покрывались матрицей базальных мембран (50 мкл на вставку, разбавление 1:8) и инкубировали при 37 °C в течение 1 часа; Контроль качества проводился до засева ячеек: для проверки валидности анализов устанавливались пустые вставки (без клеток) и отрицательные контрольные вставки (без хемоаттрактанта), а также однородность слоя матрицы базальной мембраны подтверждалась визуальным осмотром (или измерением веса для более строгого контроля). Клетки содержались в сыворотке в среде с 1% FBS в течение 6-12 часов, а 2 × 10⁵ клетки/мл (200 мкл на вставку) были засеяны в верхнюю камеру. Нижняя камера содержала среду объёмом 600 мкл с 20% FBS в качестве химиоаттрактанта. После 24-часовой инкубации неинфицированные клетки с верхней поверхности удалялись, а инфицированные клетки на нижней поверхности фиксировались метанолом на 10 минут и окрашены 0,1% кристаллическим фиолетовым цветом в течение 15 минут. Окрашенные клетки снимались под ярким микроскопом и подсчитывались как минимум в пяти случайных микроскопических полях на одну вставку (увеличение 200×); Подсчёт проводился слепым методом (персонал не знал о распределении групп), чтобы избежать субъективной предвзятости.
8. Проточное цитометрическое обнаружение апоптоза
Клетки были собраны (включая плавающие клетки), дважды промывались PBS и возвращались в буфер связывания при 1 ×10 6 клеток/мл. К 100 мкл суспензии добавлялись V-FITC (5 мкл) и йодид провидия (5 мкл), после чего проводилась инкубация при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте; после инкубации к каждому образцу добавлялся связывающий буфер объемом 400 мкл. Перед проточным цитометрическим анализом корректировка компенсации проводилась с использованием одноокрашенных контролей (Annexin V-FITC — одноокрашенные и PI — одноокрашенные клетки) для устранения флуоресцентного перелива, а FSC/SSC установили на выбор отдельных элементов (исключая остатки и агрегаты). Образцы анализировались в течение 1 часа на потоковом цитометре, оснащённом лазером 488 нм, при этом на образец было получено не менее 10 000 событий. Апоптотические индексы количественно измерялись с помощью программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии: для всех образцов был установлен единый порог гейтинга для обеспечения согласованности, а пропорции ранних апоптотических клеток (Annexin V⁺/PI⁻) и поздних апоптотических клеток (Annexin V⁺/PI⁺) были отдельно представлены для характеристики апоптотического профиля каждой группы.
9. Секвенирование РНК и анализ биоинформатики
Общая РНК была извлечена и оценена на чистоту (A 260/280 между 1,8 и 2,1) и целостность (RIN ≥7 как порог контроля качества). мРНК очищалась с помощью олиго(dT) шариков, фрагментировала при 94 °C в течение 5-7 минут и была обратно транскрибирована в кДНК. Библиотеки готовились с помощью восстановления концов, лигации адаптеров и усиления ПЦР (8-12 циклов), а затем секвенировались на платформе Illumina для генерации парных концов чтений с частотой 150 bp на глубине 30-50 миллионов пар чтения на выборку. Риды были обрезаны и выравнивались с человеческим эталонным геномом с помощью STAR или HISAT2. Количество генов было получено с featureCounts, а дифференциальный анализ экспрессии был проведён с помощью DESeq2, с применением порогов FDR < 0,05 и |log2-кратного изменения| ≥ 1. Анализ функционального обогащения дифференциально экспрессированных генов проводился с помощью clusterProfiler для генной онтологии и путей KEGG (с коррекцией FDR < 0,05 методом Бенджамини-Хохберг (BH), а также были построены сети взаимодействия белок-белок с использованием базы данных STRING.
10. Статистический анализ
Непрерывные данные были выражены как среднее ± SD по крайней мере трёх независимых экспериментов. Сравнения между двумя группами проводились с двухвостыми непарными t-тестами, а сравнения между тремя и более группами — с односторонним ANOVA, после чего последовал пост-хок тест Тьюки. Там, где это было уместно, применялись непараметрические тесты. Распределение выживаемости оценивалось с помощью анализа Каплана-Майера с помощью лог-ранговых тестов. Для данных РНК-секвенции коррекция многократного тестирования проводилась с использованием метода Бенджамини-Хохберга. Точные p-значения указаны в легендах рисунков; Статистическая значимость рассматривалась на уровне p < 0,05, при этом* p < 0,05, а ** — p < 0,01.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
PAK5 сильно экспрессируется в ESCC и связан с плохим прогнозом
Рисунок 1 иллюстрирует общий рабочий процесс — от клинической валидации PAK5 до функционального и транскриптомического анализа, который определяет GAREM1 как последующий целевой объект. Для проверки гипотезы о том, что PAK5 способствует прогрессированию ESCC, модулируя путь MAPK через GAREM1, были изучены паттерны экспрессии PAK5 в тканях ESCC и их связь с клинически...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В данном исследовании подробно рассматривается роль PAK5 в прогрессировании плоскоклетичной карциномы пищевода (ESCC) путём объединения клинических образцов, функциональных анализов и транскриптомического анализа. Эти результаты расширяют понимание участия PAK5 в ESCC, подчеркивая его потенциал как прогностического маркера и терапевтической цели.
Выраженная гиперэкспрессия PAK5 в тканях ESCC и её связь с более низкой выживаемостью пациентов согласуются с данны...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Эта работа была поддержана Хайнаньским провинциальным фондом естественных наук Китая (грант No 822QN474).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology | C1062S | Набор для окрашивания при обнаружении апоптоза |
| Анти-ПАК5 антитела | Abcam | ab110069 | Первичный антител к ИГК, разбавление 1:100 |
| Автоматизированная система электрофореза | Agilent | Биоанализатор 2100 года | Оценка целостности РНК |
| Набор для синтеза кДНК | Инвитроген | 1896649 | Набор для обратной транскрипции |
| Раствор кристаллической фиолетовой | Сигма-Олдрич | C3886 | Окрашивание красителей для колоний и вторжения |
| DMEM Medium | Gibco (Термо Фишер) | 11965092 | Среда для культивирования клеток |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | Gibco (Термо Фишер) | 16000044 | Добавка для культуры клеток |
| Потоковый цитометр | BD Biosciences | FACSCanto II | Инструмент для анализа клеток |
| GraphPad Prism | Программное обеспечение GraphPad | Версия 8 | Программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков |
| H& Набор для окраски E | Solarbio | G1120 | Раствор для окрашивания с гематоксилином и эозином |
| HRP-конъюгированный антикрысиный IgG | Abcam | ab150165 | Вторичные антитела к ИГК |
| Секвенсор Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Высокопроизводительная платформа секвенирования |
| Клеточная линия KYSE-150 | Банк RIKEN Cell | RCB2057 | Клеточная линия плоскостной карциномы пищевода человека |
| Липофектамин 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Трансфекционный реагент |
| Считыватель микропластин | Bio-Tek Instruments | ELx808 | Прибор измерения поглощения |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Термо Фишер Сайентифик | 61005 | Для очистки мРНК |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco (Термо Фишер) | 15140122 | Антибиотики для культивирования клеток |
| Йодид провидия (PI) | Сигма-Олдрич | P4864 | Краситель для окрашивания ДНК |
| RPMI-1640 средний | Gibco (Термо Фишер) | 11875093 | Среда для культивирования клеток |
| Спектрофотометр | Термо Фишер | NanoDrop ND-1000 | Измерение концентрации и чистоты РНК |
| Программное обеспечение SPSS | IBM | Версия 23 | Программное обеспечение для статистического анализа |
| Вставки Трансвелла | Корнинг | 3422 | Вставки для анализа клеточного вторжения |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.